一种芽孢杆菌及其在鹰嘴豆种子培育中的应用的制作方法

1.本发明属于植物生产领域，涉及鹰嘴豆种子的培育，特别是指一种芽孢杆菌及其在鹰嘴豆种子培育中的应用。


背景技术：

2.鹰嘴豆，学名：cicer arietinum，又名桃儿豆、鸡豆、鸡头豆等，是印度和巴基斯坦的重要蔬菜之一，在欧洲食用鹰嘴豆也十分普遍，也是维吾尔医学常用药材。因其面形奇特，尖如鹰嘴，故称此名。鹰嘴豆为豆科草本植物，起源于亚洲西部和近东地区。是世界上栽培面积较大的豆类植物，约一亿五千万亩，其中印度和巴基斯坦两国的种植面积占全世界的80％以上，中国只有零星分布。鹰嘴豆的淀粉具有板栗香味。鹰嘴豆粉加上奶粉制成豆乳粉，易于吸收消化，是婴儿和老年人的营养食品。鹰嘴豆还可以做成各种点心和油炸豆。籽粒可做利尿剂、催奶剂、可治疗失眠，预防皮肤病和防治胆病。淀粉广泛用于造纸工业和纺织工业。
3.但是鹰嘴豆种子的发芽率特别低，这主要是由于鹰嘴豆发芽后成根过程潮湿的环境极易导致霉变和死亡，影响出苗。本技术发明人致力于提高鹰嘴豆的发芽率及培育方向的研究。


技术实现要素：

4.本发明提出一种芽孢杆菌及其在鹰嘴豆种子培育中的应用，解决了鹰嘴豆出苗率低的问题。
5.本发明的技术方案是这样实现的：一种芽孢杆菌，所述芽孢杆菌菌株分类名为bacillus sp.wyccwf10080=1c-6，保藏号为cctcc no: m 20191042，保藏时间为2019年12月13日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学。
6.所述芽孢杆菌作为提高鹰嘴豆种子的出芽率和增加根部生物量的应用。
7.所述的芽孢杆菌的应用，步骤如下：（1）将芽孢杆菌菌株接种至lb液体培养基中，37℃摇床振荡培养过夜，得芽孢杆菌菌液；（2）用次氯酸钠溶液对鹰嘴豆种子进行表面消毒，然后用无菌水冲洗种子5-8次，将冲洗干净的鹰嘴豆种子置于1%的水琼脂平板上进行培养，得发芽1-2cm的鹰嘴豆种子；（3）将营养基质装入培养皿内，然后在营养基质上部用无菌镊子开一个的小穴；（4）取1-5ml步骤（1）得到的芽孢杆菌菌液，均匀的加至营养基质的小穴底部，然后将经步骤（2）得到的鹰嘴豆种子放入小穴底部的菌液内，用营养基质盖过种子2-5cm，在恒温光照培养箱内黑暗生长至芽出土，然后光照-黑暗循环培养，即可提高鹰嘴豆种子的出芽率和增加根部生物量；所述步骤（1）中芽孢杆菌菌株的接种量为1-10亿个菌每颗种子。
8.所述步骤（2）中次氯酸钠溶液的浓度为1.5-3.0%。
9.所述步骤（2）中培养的条件为于25-30℃恒温箱中，黑暗条件下培养2-3天。
10.所述步骤（3）中小穴的规格为直径2-2.5cm，深度4-5cm。
11.所述步骤（4）中光照-黑暗循环培养指以16h光照—8h黑暗为一个循环，进行多次重复循环培养。
12.本发明具有以下有益效果：本发明公开了一株芽孢杆菌菌株在鹰嘴豆无菌盆栽苗育苗过程中，可以大大提高其生根速度和发芽数量，从而提高鹰嘴豆的成苗率，极大降低补苗死苗的成本，经过本技术芽孢杆菌处理的鹰嘴豆培养组的发芽率相对于对照组提高了近两倍达到91.25%；根长增加了84%，平均干重增加了101.2%，可作为鹰嘴豆出苗促生长高效菌剂。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
14.图1为用芽孢杆菌1c-6培养鹰嘴豆及对照的发芽率实验图。
15.图2为用芽孢杆菌1c-6培养鹰嘴豆及对照的根系样图。
16.图3为本技术芽孢杆菌1c-6的16s rrna系统发育树状图。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.一种芽孢杆菌，所述芽孢杆菌菌株分类名为bacillus sp.wyccwf10080=1c-6，保藏号为cctcc no: m 20191042，保藏时间为2019年12月13日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学。
19.细菌lb固体培养基的公开配方：10g 胰蛋白胨，5g 酵母提取物，10g nacl，琼脂粉20g，蒸馏水1l，ph至7.0。
20.一、芽孢杆菌bacillus sp.wyccwf10080=1c-6的分离和筛选于河南省郑州市高新区郑州轻工业大学校园内选取河边、草坪、松树林下、实验楼外等处采集土壤样品，采用五点采样法，分别从多年河边、草坪内、松树林下采集5-10cm的肥沃土壤，存入无菌密封袋，做好记录，立刻带回实验室。分别随机取10g土壤样品放入事先灭好菌的盛有90ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，放入摇床28℃、转速150 r/min条件下振荡混匀10分钟。然后，三角瓶至于90度水浴中加热20分钟，然后放入摇床28℃、转速150 r/min条件下振荡混匀5分钟，之后把三角瓶静置10分钟，取上清液进行10倍梯度稀释（10-1
~10-9
），然后涂布在 lb 培养基固体平板，每个梯度涂布200
µ
l，然后平板放入恒温培养箱中37℃倒置培养过夜，初步得到芽孢杆菌菌源。
21.进一步划线分离出挑选出形态较好的菌落反复划线分离纯化，直到平板上无杂菌落出现。共筛选到6株单菌落，挑取单菌落接至5 ml lb液体试管里，37 ℃，180 rpm 摇床培养12 h，将菌液od600调至1.0，按1：100比例取0.5 ml接至50 ml lb液体培养基里，37 ℃，180rpm摇床中培养12 h；然后按照每颗种子10
6-108个菌的比例接种到消毒后待发芽的鹰嘴豆种子表面，28℃黑暗培养5天，筛选出一株促进发芽率明显的菌株，经16s rrna测序和系统发育分析，被鉴定为芽孢杆菌属，命名为芽孢杆菌bacillus sp.wyccwf10080=1c-6。1c-6的16s rrna序列如seq id no:1所示，系统发育树如图3所示。
22.应用例利用上述芽孢杆菌培养鹰嘴豆的方法：（1）将芽孢杆菌菌株按照每颗种子10
0-109个菌的比例接种至lb液体培养基中，37℃摇床振荡培养过夜，得芽孢杆菌菌液；（2）用1.5-3.0%wt的次氯酸钠溶液对鹰嘴豆种子进行表面消毒，然后用无菌水冲洗种子5-8次，将冲洗干净的鹰嘴豆种子置于1%的水琼脂平板上于25-30℃恒温箱中，在黑暗条件下培养2-3天，得发芽1-2cm的鹰嘴豆种子；（3）将营养基质装入培养皿内，然后在营养基质上部用无菌镊子开一个直径为2-2.5cm，深度4-5cm小穴；（4）取1-5ml步骤（1）得到的芽孢杆菌菌液，均匀的加至营养基质的小穴底部，然后将经步骤（2）得到的鹰嘴豆种子放入小穴底部的菌液内，用营养基质盖过种子2-5cm，在恒温光照培养箱内黑暗生长至芽出土，然后以16h光照—8h黑暗为一个循环，进行多次重复循环培养，即可提高鹰嘴豆种子的出芽率和增加根部生物量；（5）待生长50天后，小心取出每株植物，并用清水小心洗去根部附着的蛭石，然后量取根长，并将根部烘干至恒重后测量其干。
23.以常规的不添加芽孢杆菌菌液的培养方法为对照。
24.鹰嘴豆的发芽率见图1，发芽率数量如表1：表1：添加芽孢杆菌培养组与对照组的发芽率统计由上可知，经过本技术芽孢杆菌处理的鹰嘴豆培养组的发芽率相对于对照组提高了近两倍。
25.经芽孢杆菌bacillus sp.wyccwf10080=1c-6处理的鹰嘴豆植株与对照组的鹰嘴豆植株，经过50天培养的鹰嘴豆的根部如图2所示，根部经烘干至恒重后的干重统计如表2：表2：加芽孢杆菌培养组与对照组的根部数据统计处理10株平均根长（厘米）10株平均根部干重（克）加入本专利芽孢杆菌菌液13.832.4加入lb培养基7.516.1由图2和表2可知，使用本技术的芽孢杆菌1c-6后，根长增加了84%，平均干重增加
了101.2%。效果显著。
26.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。