一种乳杆菌KF2-5及其应用

一种乳杆菌kf2-5及其应用
技术领域
1.本发明涉及食品生物发酵工艺领域，特别是涉及一种乳杆菌kf2-5及其在乳酸菌发酵饮料生产工艺中的应用。


背景技术：

2.谷物是人类的主食，营养物质很丰富。比如麦芽汁中富含许多的活性矿物质、蛋白质、维他命、微量元素等。糙米是稻谷脱去稻壳后得到的全谷粒大米，含有多种营养物质，如：黄酮、γ-氨基丁酸、多酚、膳食纤维等。虽然上述谷物营养丰富，但由于风味口感较差，不适合直接食用。利用乳酸菌发酵谷物增加多种功能性化合物并产生复杂的风味成分，同时提升食物的口感和营养价值是当前行之有效的方法之一。我国对于麦芽和糙米饮料的研究和开发已经具有一定的前期基础。肖连东等用乳酸菌发酵麦芽汁经过工艺优化后研制出酸甜可口、富含许多营养物质的全新麦芽汁乳酸饮料。陈海旭等用复合乳酸菌发酵糙米得到一款新型的发酵糙米饮料产品，此产品将谷物饮料和乳酸菌饮料的优点结合到一起，得到一种均衡营养性谷物发酵饮料。
3.然而谷物发酵饮料仍然存在一些不足，主要体现在：选用的谷物原料单一、发酵菌种及条件依然有待于进一步成熟，这些因素都会影响到饮料的营养价值和风味特性。


技术实现要素：

4.鉴于上述问题，本发明的目的是提供一株具有益生特性的副干酪乳杆菌，可应用于更优化的乳酸菌混菌发酵饮料生产工艺。以有效提高饮料的营养价值和风味特性。
5.本发明提供的乳杆菌kf2-5，分类名称为：副干酪乳杆菌lactobacillus paracasei，保藏编号：cgmcc no.20982，保藏日期：2020年11月2日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
6.本发明用于乳酸菌混菌发酵生产谷物饮料的另一株鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)为已在专利cn112538448a中公开的菌株，其保藏编号为cgmcc no.20983，保藏日期：2020年11月2日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
7.进一步地，本发明提供一种谷物发酵饮料的生产工艺，其采用乳酸菌混菌发酵，混菌中包括鼠李糖乳杆菌rg(lactobacillus rhamnosus)cgmcc no.20983，其特征在于包括如下步骤：
8.1)将灭菌的麦芽汁发酵液和糙米汁发酵液按体积比1:3～3:1混合，得到混合料液；
9.2)将副干酪乳杆菌kf2-5(cgmcc no.20982)和鼠李糖乳杆菌rg接种至混合料液中，于27～42℃发酵96h后得到发酵产物；
10.3)将发酵产物过滤，将滤液于85℃恒温处理30min，冷却后获得饮料产品。
11.进一步地，步骤1)中灭菌的麦芽汁发酵液通过如下方法获得：将麦芽与水按质量比1:4混合，65℃水浴1h，冷却后过滤，滤液煮沸1h，冷却，4000rpm离心15min，取上清液调节糖度至10
°
bx～16
°
bx，115℃灭菌20min；灭菌的糙米汁发酵液通过如下方法获得：将糙米粉(由糙米磨成)与水按质量比1:10混合，得到米-水混合物，之后加入高温液化酶于90℃酶解90min，冷却至60℃后再加入糖化酶糖化60min，之后煮沸10min，冷却后调节糖度至10
°
bx～16
°
bx，115℃灭菌20min。
12.进一步地，步骤2)中，副干酪乳杆菌kf2-5和鼠李糖乳杆菌rg的接种量均为106cfu/ml。
13.进一步地，所述高温液化酶的催化剂用量为：每克米-水混合物对应加入加10u高温液化酶；所述糖化酶的催化剂用量为：每克米-水混合物对应加入加150u糖化酶。
14.本发明的有益效果在于：
15.1、本发明以副干酪乳杆菌kf2-5和鼠李糖乳杆菌rg两株益生菌作为发酵剂，使制备获得的发酵饮料在充分保留麦芽和糙米本身的营养物质基础上进一步增加了多种功能性化合物，同时明显增强了酯香风味，使饮品具有口感酸甜、营养丰富、风味独特的特点。
16.2、本发明采用麦芽汁和糙米汁为原料，以感官评定为指标优化得到乳酸菌混菌发酵生产谷物饮料的最佳发酵工艺，为麦芽和糙米在发酵饮料生产工艺中的高效利用提供新途径。
附图说明：
17.图1为不同接种量对发酵液ph和活菌数的影响，其中a、b为kf2-5的接种量对发酵液ph和活菌数的影响；c和d为rg的接种量对发酵液ph和活菌数的影响。
18.图2为不同糖度对发酵液ph和活菌数的影响，其中a和b为糖度对kf2-5的活菌数和发酵液ph的影响；c和d为糖度对rg的活菌数和发酵液ph的影响。
19.图3为不同培养温度对发酵液ph和活菌数的影响，其中a和b为温度对kf2-5的活菌数和发酵液ph的影响；c和d为温度对rg的活菌数和发酵液ph的影响。
20.图4为单菌与混菌发酵对发酵液ph和活菌数的影响。
21.图5为不同比例的麦汁与糙米汁对发酵液ph和活菌数的影响，其中a和b为麦芽/糙米汁混合比例对kf2-5的活菌数和发酵液ph的影响；c和d为麦芽/糙米汁混合比例对rg的活菌数和发酵液ph的影响。
22.图6为各因素交互作用对发酵液感官评分的响应面和等高图。
23.本发明提供的乳杆菌kf2-5，分类名称为：副干酪乳杆菌lactobacillus paracasei，保藏编号：cgmcc no.20982，保藏日期：2020年11月2日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
24.下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。以下通过各实
施例对本发明技术方案作进一步的说明。
25.实施例1
26.副干酪乳杆菌kf2-5(lactobacillus paracasei，kf2-5)的分离、鉴定：
27.取适量采自西藏的雪莲菌样品用无菌生理盐水10倍梯度稀释，在10-6
、10-7
稀释度下分别取100μl涂布于mrs固体培养基中，37℃厌氧培养24h～48h后，观察并记录菌种特征。用接种环挑取符合乳杆菌菌落形态的单菌落，反复划线分离、培养，直至分离获得单一的纯菌株。挑取菌落继续接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h以活化。取适量活化后的菌液，离心收集菌体，提取细菌基因组dna，以基因组dna为模板进行16srdna序列的pcr扩增，将扩增后的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收并送至测序公司进行双向测序。根据测序结果在genbank数据库中进行同源性比对(genbank登录号：cp044361.1)，鉴定结果表明该菌株为副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)。
28.实施例2
29.发酵条件优化：
30.1)接种量对发酵液ph和活菌数的影响：在培养温度为37℃、糖度12
°
bx、麦芽汁为发酵液的条件下，将乳酸菌接种量控制在105cfu/ml～108cfu/ml。测定发酵过程中发酵液的ph、活菌数。结果如图1所示，随着发酵时间的延长ph值呈现下降的趋势，最后发酵液ph值稳定在3.0左右，此时的发酵液酸度较大，酸度太大会影响产品整体的口感。从图1的b和d可以看出kf2-5和rg在接种量为105cfu/ml、106cfu/ml、107cfu/ml时，0～48h活菌数一直处于上升趋势。接种量为108cfu/ml时，0～36h活菌数一直处于上升趋势，然而36～48h活菌数开始下降。
31.2)糖度对发酵液ph和活菌数的影响：在乳酸菌接种量为106cfu/ml、培养温度为37℃、麦芽汁为发酵液的条件下，调整麦芽汁糖度在10～16
°
bx范围。测定发酵过程中发酵液的ph、活菌数。结果如图2所示，10
°
bx、12
°
bx、14
°
bx和16
°
bx对ph值和活菌数无明显影响，kf2-5在糖度10
°
bx和12
°
bx发酵条件下发酵速度相对更快，ph值最快到达3.5～4.0之间。kf2-5在不同糖度下活菌数均呈现上升趋势且上升幅度较一致，仅在24h时糖度10
°
bx的活菌数略高；菌株rg在不同糖度下，ph值和活菌数变化一致。
32.3)培养温度对发酵液ph和活菌数的影响：在乳酸菌接种量为106cfu/ml、糖度12
°
bx、麦芽汁为发酵液的条件下，培养温度控制在27～42℃。测定发酵过程中的ph值和活菌数。实验结果如图3所示，随着温度的升高，ph值下降速度加快，在0～24h内下降最快，24h后趋于平稳。菌株kf2-5的活菌数在48h内一直处于上升趋势，活菌数随温度的升高而降低，42℃下的活菌数在24h后趋于稳定。菌株rg随着发酵时间的延长，活菌数呈现先增后减的趋势。
33.4)单菌与混菌对发酵液ph和活菌数的影响：在接种量为106cfu/ml、糖度12
°
bx、培养温度37℃、麦芽汁为发酵液的条件下，分别单独接种kf2-5、rg和混菌kf2-5:rg＝1:1，测定发酵过程中的ph值和活菌数，实验结果见图4，由图可知，单菌和混菌发酵的ph值都在6～24h下降最快，但kf2-5和rg混菌发酵较快。从活菌数来看，rg在12h内繁殖最快，在24～48h趋于平缓，kf2-5在12～24h增长最快，24～36h增长较较缓慢，在36～48h活菌数呈现下降趋势。kf2-5和rg混菌条件下活菌数则一直处于上升趋势，且比rg单菌条件下的活菌数高。
34.5)麦芽汁与糙米汁混合比例对发酵液ph和活菌数的影响：固定反应条件为接种量
106cfu/ml，培养温度37℃，发酵液糖度12
°
bx，发酵液为麦芽汁，考察麦芽汁与糙米汁在不同混合比例下对发酵液ph、活菌数的影响。结果见图5。由图5的a和c可知，kf2-5和rg都是在麦芽汁与糙米汁体积比为1:2时发酵速度最快。由图5的b和d可知，kf2-5的活菌数在麦芽汁与糙米汁体积比为1:2时明显更高；rg则在麦芽汁与糙米汁体积比为2:1时的活菌数最高。
35.6)响应面优化：在单因素试验的基础上，以接种量(a)、培养温度(b)、麦芽汁与糙米汁体积比(c)为自变量，以感官评分为响应值，设计三因素三水平的响应面优化试验，得到乳酸菌发酵麦芽汁与糙米汁的最佳条件。响应面试验设计及结果如表1所示。
36.表1响应面优化试验条件及结果
[0037][0038][0039]
由进一步的软件分析并根据响应面结果(图6所示)，确定麦芽糙米汁发酵基质预测最优条件为：接种量10
5.56
cfu/ml，培养温度33.22℃，麦芽汁和糙米汁发酵液体积比为0.90，感官评分预测值为82.84。根据实际实验的可操作性，调整参数为接种量106cfu/ml、培养温度33℃、麦芽汁:糙米汁(体积比)＝1:1。为了验证模型的有效性和实用性，在最优培养条件下对模型做3次验证试验，结果显示3次平行试验的感官评分平均值为83.06，和预测结果基本一致，因此说明最佳发酵工艺参数稳定有效。
[0040]
实施例3
[0041]
谷物发酵饮料产品的制备：
[0042]
1)将灭菌的麦芽汁发酵液和糙米汁发酵液按体积比1:1混合，得到混合料液；其中，灭菌的麦芽汁发酵液通过如下方法获得：将麦芽与水按质量比1:4混合，65℃水浴1h，冷却后过滤，滤液煮沸1h，冷却，4000rpm离心15min，取上清液调节糖度至12
°
bx，115℃灭菌20min；灭菌的糙米汁发酵液通过如下方法获得：将糙米粉(由糙米磨成)与水按质量比1:10混合，得到米-水混合物，之后加入高温液化酶(添加量按每克米-水混合物加入10u酶)于90
℃酶解90min，冷却至60℃后再加入糖化酶(添加量按每克米-水混合物加入150u酶)，糖化60min，之后煮沸10min，冷却后调节糖度至12
°
bx，115℃灭菌20min；
[0043]
2)将副干酪乳杆菌kf2-5和鼠李糖乳杆菌rg接种至混合料液中，于33℃发酵96h后得到发酵产物；本步骤中，副干酪乳杆菌kf2-5和鼠李糖乳杆菌rg的接种量均为106cfu/ml。
[0044]
3)将发酵产物过滤，将滤液于85℃水浴30min，冷却后获得饮料产品。
[0045]
实施例4
[0046]
混菌发酵前、后样品中营养物质及风味物质的含量变化测定：对本发明获得的谷物发酵饮料产品(实施例3获得的饮料产品)以及混菌发酵前的麦芽汁、糙米汁混合发酵液中的有机酸、游离氨基酸以及挥发性化合物含量进行测定、比较，具体如下：
[0047]
1)有机酸含量变化测定：使用高效液相色谱仪测定混菌发酵前、后样品内有机酸(柠檬酸，苹果酸，乳酸，乙酸和丁酸)浓度，将样品7000rpm离心10min并过0.22μm滤膜。色谱柱为aminex hpx-87h(300
×
7.8mm，bio-rad)；流动性为5mm h2so4；流速0.5ml/min；柱温60℃；进样量为20μl；检测波长为210nm。结果如表2所示。乳酸菌混菌发酵后的样品中，柠檬酸含量降低；苹果酸含量有所增加；乳酸含量增长幅度最大，说明发酵过程中生成的有机酸以乳酸为主。乙酸和丁酸在发酵前未检测到，而在发酵后的样品中被检测到。有机酸的释放不仅改善了发酵产品的口感，而且促进了芳香活性化合物的形成。
[0048]
表2混菌发酵前和发酵后的样品中有机酸的含量变化
[0049][0050]
2)游离氨基酸含量变化测定：通过高效液相色谱仪，采用2,4-二硝基氟苯柱前衍生方法对混菌发酵前、后样品内游离氨基酸含量变化进行测定。结果如表3所示：相比发酵前的混和发酵液，发酵后获得的饮料产品中的总氨基酸含量显著升高，其中呈鲜味作用的谷氨酸和天门冬氨酸在饮料产品中的含量均大幅升高；呈甘味作用的甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸的含量在饮料产品中均有不同程度的升高；饮料产品中呈苦味的异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的含量较发酵前有所下降。
[0051]
表3混菌发酵前和发酵后的样品中游离氨基酸的含量变化
[0052][0053]
3)挥发性成分含量变化测定：采用固相微萃取-气质联用技术对混菌发酵前、后样品内的挥发性成分进行检测。使用纤维针式固相微萃取，取发酵样品的离心上清液7.5ml置于20ml的顶空瓶中，加1g无水氯化钠，45℃平衡10min，插入萃取头进行顶空固相微萃取，萃取40min。
[0054]
气相色谱条件：色谱柱为hp-inno wax(60m
×
250μm
×
0.25μm)；固相微萃取纤维针：50/30μm；进样口温度：250℃；检测器温度：230℃；载气：氦气；流量1ml/min；升温程序：60℃保持1min，之后以3℃/min升温至180℃保持8min，最后以8℃/min升温至220℃，保持8min。质谱条件：ei；电子能量：70ev；扫描范围：35.0amu-500.0amu。采用标准数据库进行分析，通过谱库检索和挥发性成分的质谱碎片信息、保留指数、保留时间等进行定性分析；采用内标法进行定量。检测结果见表4。从表4中可以看出：发酵前样品内总共检测到26种挥发性化合物，发酵后的饮料产品中总共检测到35种挥发性化合物，发酵前、后样品中风味化合物在数量和比例上体现出较大差异，说明本发明提供的乳酸杆菌结合发酵工艺可以将有机酸高效代谢为醇、醛、酮、酯类等风味化合物，其中酯类和酸类物质的种类数增加较多，可显著增强产品的酯香风味。
[0055]
表4混菌发酵前和发酵后的样品中的挥发性化合物含量变化
[0056]
[0057][0058]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。