草铵膦脱氢酶突变体、工程菌、固定化细胞及应用

ppt的方向进行，需要加入至少2倍以上的l-天冬氨酸作为氨基供体，过量的天冬氨酸给l-ppt的分离带来了很大的麻烦。
9.手性拆分法获得l-草铵膦，理论最高收率仅为50％；化学法不对称合成l-草铵膦可以突破该限制，然而已报道的化学合成法普遍效率差、立体选择性低。酶法不对称合成l-草铵膦通过不对称铵化酮酸中间体的酮羰基构建手性中心，该路线也因原料价廉易得，且可以避免使用剧毒氰化物，而成为适宜l-草铵膦工业化开发生产的路线。传统的酶合成方法依赖昂贵的nadp作为辅酶，成本高。
10.氨基酸脱氢酶(ec 1.4.1.x，aadh)是一类能将氨基酸可逆的脱氨生成对应酮酸的氨基酸脱氢酶，其反应需要核苷类辅酶(nad

)的参与，被广泛的应用于天然与非天然α-氨基酸的合成。根据其底物特异性，可分为谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶等。如果其表现出对草铵膦前体具有一定的活力，就可称之为“草铵膦脱氢酶(pptdh)”。
11.甲酸脱氢酶(ec1.1.1.47，fdh)是生物催化的重要辅助酶，用于氧化还原催化反应中辅酶nadh的再生循环。
12.目前nadph依赖型草铵膦脱氢酶的酶活显著高于nadh依赖型草铵膦脱氢酶(大于50倍)，而nadph的价格是nadh的5倍，因此，开发一种nadh依赖型高活力草铵膦脱氢酶具有很好的应用前景。由于草铵膦脱氢酶的热稳定性较差，在实际应用中容易失活导致反应速率降低，需要通过合适的方法在分子水平提高酶的稳定性；此外，大肠杆菌e.coli bl21(de3)表达的草铵膦脱氢酶是胞内酶，因此可以利用固定化细胞技术将包含草铵膦脱氢酶的大肠杆菌全细胞进行固定化，进一步提高其热稳定性和操作稳定性，并实现重复使用，降低生产成本。
(三)

技术实现要素：

13.本发明目的是针对现有草铵膦脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸不对称胺化还原活性不高和稳定性较差的问题，提供了一种nadh依赖型草铵膦脱氢酶突变体、工程菌、固定化细胞及用于l-草铵膦手性生物合成的应用，解决了不对称胺化还原制备l-草铵膦成本过高、催化效率低下的问题。
14.本发明采用的技术方案是：
15.本发明提供一种nadh依赖型草铵膦脱氢酶突变体，所述突变体是将seq id no.2所示草铵膦脱氢酶氨基酸序列的第145位、第384位、第348位、第292位、第202位、第70位、第78位进行单突变或多突变获得的。所述草铵膦脱氢酶编码基因kmgdh核苷酸序列如seq id no.1所示。
16.优选的，所述突变体是将seq id no.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第145位脯氨酸突变为甘氨酸(p145g)、或者第348位丝氨酸突变为丙氨酸(s348a)；(2)第145位脯氨酸突变为甘氨酸、第384位缬氨酸突变为苯丙氨酸且第70位赖氨酸突变为丙氨酸(p145g-v384f-k70a)；(3)第145位脯氨酸突变为甘氨酸、第384位缬氨酸突变为谷氨酰胺且第78位天冬酰胺突变为丝氨酸(p145g-v384q-n78s)；(4)第145位脯氨酸突变为甘氨酸、第384位缬氨酸突变为酪氨酸、第348位丝氨酸突变为丙氨酸，第292位丙氨酸突变为半胱氨酸且第202位丙氨酸突变为亮氨酸(p145g-v384y-s348a-a292c-a202l)。
17.本发明还涉及所述nadh依赖型草铵膦脱氢酶突变体编码基因，编码基因构建的重组载体，以及重组载体与甲酸脱氢酶基因共表达转化制备的重组基因工程菌。
18.本发明所述重组载体以质粒petduet为基础载体，克隆到质粒petduet的mcs1(多克隆位点1)的ncoi上。
19.本发明所述重组基因工程菌以e.coli bl21(de3)为宿主菌，按如下步骤制备：将草铵膦脱氢酶kmgdh突变体基因，克隆到质粒petduet的mcs1(多克隆位点1)的ncoi上，构建重组表达载体，保留质粒本身的his-tag基因；再将甲酸脱氢酶基因psefdh(核苷酸序列如seq id no.3所示)，通过vazyme公司的one step cloning kit构建至重组表达载体的mcs2(多克隆位点2)的ndei上，获得共表达载体，转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)，获得草铵膦脱氢酶突变体与甲酸脱氢酶共表达的重组基因工程菌。
20.本发明还提供一种草铵膦脱氢酶突变体在催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(ppo)制备l-草铵膦中的应用，所述的应用方法为：以含草铵膦脱氢酶突变体基因与甲酸脱氢酶基因的重组基因工程菌诱导培养获得的湿菌体或湿菌体制备的固定化细胞为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸为底物，以甲酸铵为辅酶再生底物，外源添加nad

，以ph 7.4、100mm磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在20-50℃(优选35℃)、200-800转/分钟(优选600转/分钟)进行转化反应，反应结束后，反应液抽滤，滤饼回收催化剂，滤液分离纯化，获得l-草铵膦。所述反应体系中，催化剂用量以反应介质体积计10-50g/l(优选10g/l)，底物终浓度100-400mm(优选400mm)，甲酸铵终浓度100-800mm(优选600mm)，nad

终浓度0.05-2mm(优选0.1mm)。
21.所述湿菌体按如下方法制备：将含草铵膦脱氢酶突变体基因与甲酸脱氢酶基因的重组基因工程菌接种到含终浓度50μg/ml氨苄霉素的lb液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/ml氨苄霉素的lb液体培养基中，37℃、180转/分钟培养2小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mm iptg，18℃培养14小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得相应的湿菌体。
22.所述重组基因工程菌固定化细胞按如下方法制备：将所述重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入ph6.0-8.0的磷酸缓冲液(优选ph 7.5的磷酸缓冲液)中，加入载体，充分搅拌20～30min，再加入聚乙烯亚胺，充分搅拌20～30min，然后加入交联剂，充分搅拌20～30min，减压抽滤，滤饼水洗，获得所述重组基因工程菌固定化细胞；所述磷酸缓冲液体积用量以湿菌体重量计为5-20ml/g(优选10ml/g)；所述载体为活性炭、硅藻土、膨润土或蒙脱土(优选硅藻土)，所述载体质量用量为菌体质量的2～10％(优选2-3％)；所述聚乙烯亚胺分子量为600～70000(优选10000)，用量以菌体质量计为1～10ml/100g(优选3ml/100g)；所述交联剂为戊二醛、乙二醛或双醛淀粉，用量以菌体质量计为1～10ml/100g(优选3ml/100g)。
23.与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
24.(1)本发明通过筛选获得热稳定性提高的草铵膦脱氢酶突变体，其中突变体kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l在35℃、50℃、65℃下的半衰期分别由突变前的18.4h提高到294.7h、11.2h提高到143.0h和6.9h提高到25.7h，热稳定性得到了显著提高。同时，草铵膦脱氢酶突变体在催化还原2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸制备l-草铵膦时，采用价格较低的nadh作为辅酶替换价格昂贵的nadph辅酶，显著降低了成本。
25.(2)本发明方法制备的草铵膦脱氢酶突变体与甲酸脱氢酶共表达工程菌的固定化细胞，进一步提高其热稳定性和操作稳定性，并实现重复使用。固定化细胞酶活为162.5u/g，酶活回收率为78.1％，可以通过过滤回收，并可重复使用20批次以上保持100％转化率，极大降低了生产成本。
26.(3)本发明利用草铵膦脱氢酶突变体和辅酶循环系统，直接以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸底物催化还原为l-草铵膦，进而实现不对称合成l-草铵膦，无需昂贵的化学拆分试剂，也无需合成草铵膦衍生物。草铵膦脱氢酶突变体具有更好的催化效率和更高的稳定性，与野生型母本相比，酶活提高至3856％，35℃下的半衰期从18.4h延长至294.7h，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸为底物进行催化反应时，转化率远高于野生型酶，草铵膦产率也大幅提升。
(四)附图说明
27.图1为草铵膦脱氢酶突变体偶联甲酸脱氢酶不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸制备l-草铵膦的反应示意图。
28.图2为实施例2中kmgdh和psefdh双酶偶联sds-page图。其中泳道1：标准蛋白分子量；泳道2：草铵膦脱氢酶母本与甲酸脱氢酶出发共表达菌株细胞。泳道3：草铵膦脱氢酶母本工程菌细胞。
29.图3为实施例3中2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸标准曲线。
30.图4为实施例3中l-草铵膦标准曲线。
31.图5为实施例7中草铵膦脱氢酶母本纯酶在35℃、50℃、65℃下的半衰期曲线。
32.图6为实施例7中草铵膦脱氢酶突变体kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l纯酶在35℃、50℃、65℃下的半衰期曲线。
33.图7为实施例9中工程菌e.coli bl21(de3)-kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l-psefdh固定化细胞催化400mm ppo的转换率曲线图。
34.图8为实施例9中工程菌e.coli bl21(de3)-kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l-psefdh游离细胞和固定化细胞的反应批次转化率柱形图。
(五)具体实施方式
35.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
36.以下实施例中，硅藻土分子式为sio2，分子量为60.08，中位粒径19.6μm，购自阿拉丁公司。膨润土分子式为al2o3·
4(sio2)
·
h2o，分子量360.31，购自阿拉丁公司。活性炭分子式为c，分子量12.01，购自阿拉丁公司。蒙脱土成分为al2o316.54％、mgo
4 65％、sio
2 50.95％，购自阿拉丁公司。聚乙烯亚胺分子量分别为700、1800、10000、70000，购自阿拉丁公司。
37.实施例1：草铵膦脱氢酶突变体文库的构建及筛选
38.1、草铵膦脱氢酶母本工程菌
39.将来源于马赛库特氏菌(kurthia massiliensis)的野生型草铵膦脱氢酶kmgdh核苷酸序列(ncbi登录号wp_010290083.1)进行密码子优化，由杭州擎科生物技术有限公司进
行基因合成，获得的kmgdh基因(核苷酸序列为seq id no.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示)，克隆到质粒petduet的mcs1(多克隆位点1)的ncoi上，构建重组表达载体petduet-kmgdh，保留质粒本身的his-tag基因，转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)，送杭州擎科生物技术有限公司合成草铵膦脱氢酶母本工程菌e.coli bl21(de3)/petduet-kmgdh。
40.seq id no.1
41.atggcagaaaacctgaacttatttacgagcacccaggcgattattaaagaagcgctgcagaaactgggctacgatgaggcgatgtatgacttactgaaagaaccgctgcgtatgctgcaggttagaatcccggtccgtatggacgacggcaccgttaccgttttcacaggttatcgtgcccaacataatgatgcagttggcccgaccaagggtggcgtacgttttcatccgaatgttagtgaagaagaagttaaagcactgagcatgtggatgaccctgaaagcaggtattgttgatttaccatatgggggtggtaaaggcggcgtgatttgtgatcctcgtcagatgagcatgggtgaactggaaagattaagccgtggatatgttcgggcaacctcgcagattgttggtccgaccaaagatattccggcaccggatgtttttaccaatgcacaaattatggcatggatgatggatgaatatagccgtatggatgaatttaatagcccgggctttataacgggtaaacctattgtgttaggtggtagtcaggggcgtgatcgtgccacagcccagggcgtaacgattgttatagaacaggcagcaaaacggcggaatctgcaaatcgaaggtgcaagagtggtgattcagggatttggaaatgcaggtagctttctggctaaattcatgaatgatctgggcgcgaaagtggtgggtattagtgacgcaaatggcgcactgtacgatccggaaggactggatattgattatctgttagaccgtcgtgatagttttggtaccgttactaatctgtttgaaaataccattaccaacgaagaacttttagaattagagtgtgatatcctggttccggctgccattgaaaaccaaattacagcagaaaatgcacataatatcaaggccaacattgttgtggaagcagcaaacggaccgaccacccaggaagccacaaaaatactgaccgagcgtggagttctgctggtgccggacgttttagcaagcgcaggtggcgttacagtaagctactttgaatgggttcagaataatcagggctattactggagtgaagaagaggttaatgataaattatacaagaagatggtggaggcgtttgataatatttataatgtggcagaagcccgcaaaatagatatgagactggcggcatatatggtgggcgttagaaaaacagcagaagcaagccggtttagaggctgggtt。
42.seq id no.2
43.maenlnlftstqaiikealqklgydeamydllkeplrmlqvripvrmddgtvtvftgyraqhndavgptkggvrfhpnvseeevkalsmwmtlkagivdlpygggkggvicdprqmsmgelerlsrgyvratsqivgptkdipapdvftnaqimawmmdeysrmdefnspgfitgkpivlggsqgrdrataqgvtivieqaakrrnlqiegarvviqgfgnagsflakfmndlgakvvgisdangalydpegldidylldrrdsfgtvtnlfentitneellelecdilvpaaienqitaenahnikanivveaangpttqeatkiltergvllvpdvlasaggvtvsyfewvqnnqgyywseeevndklykkmveafdniynvaearkidmrlaaymvgvrktaeasrfrgwv。
44.2、出发共表达菌株
45.再合成绿脓杆菌(pseudomonas sp.)来源的甲酸脱氢酶基因psefdh(pdb登录号为2gug_a所示，核苷酸序列如seq id no.3所示)，通过vazyme公司的one step cloning kit构建至重组表达载体petduet-kmgdh的mcs2(多克隆位点2)的ndei上，获得共表达载体petduet-kmgdh-psefdh，转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)，获得草铵膦脱氢酶母本与甲酸脱氢酶出发共表达菌株e.coli bl21(de3)/petduet-kmgdh-psefdh。
46.seq id no.3
47.atggccaaagttctgtgtgtactgtatgacgacccggttgatggttaccctaaaacttacgcacgtgacgatctgccgaaaatcgaccactacccgggcggccagaccctgccgacgccgaaagcgatcgatttcactccgggc
caactgctgggttctgtttctggtgaactgggcctgcgtaaatatctggaatccaacggccacaccctggtggtgaccagcgacaaagatggtccggactccgtgttcgaacgtgaactggttgatgctgacgttgtcattagccagccgttctggccggcgtatctgaccccggaacgcatcgccaaagctaaaaacctgaaactggcactgaccgcaggtattggttctgaccacgttgatctgcagtccgccatcgatcgtaacgttaccgttgccgaagtaacctactgtaactctatctccgtggctgaacatgtggttatgatgatcctgtctctggttcgcaactatctgccgtctcatgaatgggcgcgtaaaggcggctggaacatcgctgattgtgtcagccatgcgtatgacctggaagcaatgcatgtgggcactgttgcagctggtcgcatcggcctggctgtcctgcgtcgcctggcaccattcgacgtacacctgcactacactgaccgtcaccgtctgccagaaagcgtggagaaagaactgaacctgacctggcatgctactcgcgaagacatgtacccggtgtgcgacgttgttaccctgaactgtccactgcacccggagaccgaacacatgattaacgatgaaaccctgaagctgttcaaacgtggcgcgtacatcgtaaacacggctcgtggtaagctgtgcgatcgtgacgctgtggcacgtgcgctggaatctggtcgcctggccggttacgctggtgatgtatggtttccacagccggctccgaaagaccacccgtggcgcaccatgccttacaatggtatgaccccgcacatttctggtaccactctgaccgcacaggcgcgttacgcagcgggtacccgtgaaattctggagtgcttctttgaaggtcgcccgatccgtgatgaatacctgatcgttcagggtggtgcgctggctggcactggtgctcattcctactctaaaggtaacgcgaccggtggttctgaagaggcggcgaaattcaaaaaggccgtt。
48.3、草铵膦脱氢酶突变体文库
49.草铵膦脱氢酶突变体文库的制备通过7轮定点饱和突变来实现，引物设计如表1，具体操作如下：
50.(1)以载体petduet-kmgdh-psefdh为模板，以表1中序列(p145)为引物，进行pcr定点饱和突变，pcr结果进行dna琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将阳性pcr产物中加入dpni酶用于消化模板，在37℃、220转/分钟下反应1小时后，65℃，1分钟灭活，获得消化后的pcr产物。将消化后的pcr产物热击转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞中，置于37℃、220转/分钟活化1小时，培养物再涂布于含50μg/ml氨苄霉素抗性的lb平板上，37℃倒置培养过夜，获得p145位点的饱和突变(seq id no.2所示氨基酸序列第145位突变为其他19种氨基酸)的阳性克隆。
51.(2)将步骤(1)中引物分别替换为表1所示，重复步骤(1)进行定点饱和突变，分别获得下列克隆：突变体s348(seq id no.2所示氨基酸序列第348位丝氨酸突变为其他19种氨基酸)、v384(seq id no.2所示氨基酸序列第384位缬氨酸突变为其他19种氨基酸)、k70(seq id no.2所示氨基酸序列第70位赖氨酸突变为其他19种氨基酸)、a292(seq id no.2所示氨基酸序列第292位丙氨酸突变为其他19种氨基酸)、a202(seq id no.2所示氨基酸序列第202位丙氨酸突变为其他19种氨基酸)、n78(seq id no.2所示氨基酸序列第78位天冬酰胺突变为其他19种氨基酸)、q134(seq id no.2所示氨基酸序列第134位谷氨酰胺突变为其他19种氨基酸)、d146(seq id no.2所示氨基酸序列第146位天冬氨酸突变为其他19种氨基酸)、r74(seq id no.2所示氨基酸序列第74位精氨酸突变为其他19种氨基酸)、k106(seq id no.2所示氨基酸序列第106位赖氨酸突变为其他19种氨基酸)。
52.(3)多突变
53.以步骤(2)获得的单突变体质粒为模板，继续用表1所示的其他引物进行第二轮、第三轮、第四轮定点饱和突变，获得突变文库。具体的，以p145突变体为模板，用s348引物进行第二轮突变，获得p145-s348双位点的饱和突变；以p145突变体为模板，用v384引物进行第二轮突变，k70引物进行第三轮突变，获得p145-v384-k70三位点的饱和突变；以p145突变
体为模板，用v384引物进行第二轮突变，n78引物进行第三轮突变，获得p145-v384-n70三位点的饱和突变；以p145突变体为模板，用v384引物进行第二轮突变，k70引物进行第三轮突变，a292引物进行第四轮突变，获得p145-v384-k70-a292四位点的饱和突变；以p145突变体为模板，用v384引物进行第二轮突变，s348引物进行第三轮突变，a292引物进行第四轮突变，a202引物进行第五轮突变，获得p145-v384-s348-a292-a202五位点的饱和突变。
54.突变pcr体系(100μl)为：2倍phanta max缓冲液25μl，dntps 1μl，突变上下引物各1μl，模板1μl，phanta super-fidelity dna聚合酶0.5μl，补ddh2o至50μl。pcr条件为：95℃预变性5分钟，经30个循环：90℃30秒，62℃30秒，72℃7分钟，最后72℃终延伸5分钟。
55.将步骤(1)、(2)、(3)构建的突变共表达菌株按实施例2方法进行诱导表达，按实施例3方法进行优势突变体的筛选，将获得的优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司进行测序确认，并保存。
56.表1草铵膦脱氢酶定点饱和突变引物设计
[0057][0058]
表1中n代表a、t、g、c四种碱基任意一种，k代表g、t两种碱基的任意一种，nnk组合形成的密码子可覆盖所有20种氨基酸。
[0059]
实施例2：草铵膦脱氢酶突变体工程菌的诱导表达
[0060]
将实施例1中的草铵膦脱氢酶母本工程菌、草铵膦脱氢酶母本与甲酸脱氢酶出发共表达菌株和草铵膦脱氢酶突变体与甲酸脱氢酶共表达菌株分别接种到含终浓度50μg/ml氨苄霉素的lb液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/ml氨苄霉素的lb液体培养基中，37℃、180转/分钟培养2小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mm iptg，18℃培养14小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得相应的湿菌体。lb液体培养基组成：10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉、10g/l氯化钠，溶剂为水，ph值自然。
[0061]
将草铵膦脱氢酶母本工程菌(泳道3)、草铵膦脱氢酶母本与甲酸脱氢酶出发共表
达菌株(泳道2)的湿菌体进行sds-page检测，结果见图2所示。
[0062]
以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于制备固定化细胞。
[0063]
实施例3：突变文库筛选
[0064]
以实施例2方法制备的草铵膦脱氢酶母本工程菌、草铵膦脱氢酶母本与甲酸脱氢酶出发共表达湿菌体或草铵膦脱氢酶突变体与甲酸脱氢酶共表达湿菌体为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸为底物，以甲酸铵为辅酶再生底物，外源添加微量nad

，以ph 7.4、100mm磷酸盐缓冲液为反应介质构成1ml反应体系，催化剂用量以湿菌体重量计终浓度10g/l，底物终浓度100mm，甲酸铵终浓度125mm，nad

终浓度1mm，35℃、600转/分钟反应5min。取反应液50μl，加5μl盐酸(6mol/l)终止反应，反应液用蒸馏水稀释100倍，取200μl稀释后的反应液 400μl衍生化试剂(含15mm邻苯二甲醛、15mm n-乙酰-l-半胱氨酸的ph9.8的硼酸缓冲液)30℃衍生化5min，再加400μl超纯水补足至1ml，12000转/分钟离心1分钟，取上清，过0.22μm微滤膜，收集滤液作为液相样品，采用高效液相色谱检测2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸、l-草铵膦、d-草铵膦峰面积，并根据各自标准曲线获得各自含量，计算e.e.值。以产物l-草铵膦和e.e.为指标，筛选优势突变体，实验结果示于表2。
[0065]
2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸液相检测条件：色谱柱c18(4.6
×
250mm，acchrom，china)柱，流动相乙腈：50mm磷酸二氢铵溶液(ph3.8，含10％四丁基氢氧化铵)体积比为12∶88。流速为1ml/min，检测波长为232nm，进样量10μl，柱温30℃，2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸保留时间为：9.7分钟。
[0066]
草铵膦液相检测条件：色谱柱c18(4.6
×
250mm，acchrom，china)柱，流动相甲醇∶0.05m乙酸铵(ph 5.7)体积比为10∶90，流速1.0ml/min，检测波长ex＝340nm、em＝450nm，进样量10μl，柱温35℃。l-草铵膦、d-草铵膦保留时间分别为：10.6分钟，12.6分钟。
[0067]
利用2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸和草铵膦标准品绘制浓度-峰面积标准曲线(分别为图3和图4)，利用标准曲线计算样品浓度，根据产物生成量计算细胞活力。
[0068]
表2包含kmgdh及优势突变体的湿菌体催化性能和立体选择性
[0069]
突变位点l-草铵膦(mm)e.e(％)野生型酶-psefdh0.32599.9p145g-psefdh14.22199.9s348a-psefdh9.23799.9r74a-psefdh1.21599.9k106a-psefdh2.02399.9p145g-v384q-n78s-psefdh20.26599.9d134g-v384q-a292c-psefdh5.25699.9p145g-v384f-k70a-psefdh25.26899.9d146a-v384q-k70a-psefdh4.02599.9p145g-d134g-n78s-psefdh1.59999.9p145g-v384y-s348a-a292c-a202l-psefdh38.25999.9
[0070]
注：p145g-v384q-n78s代表的是kmgdh的145位脯氨酸突变为甘氨酸、384位缬氨酸
突变为谷氨酰胺、78位天冬酰胺突变为丝氨酸。
[0071]
筛选得到优势突变体的共表达菌株e.coli bl21(de3)-kmgdh-p145g、
[0072]
e.coli bl21(de3)-kmgdh-s348a、
[0073]
e.coli bl21(de3)-kmgdh-p145g-v384q-n78s-psefdh、
[0074]
e.coli bl21(de3)-kmgdh-p145g-v384f-k70a-psefdh、
[0075]
e.coli bl21(de3)-kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l-psefdh。
[0076]
实施例4：草铵膦脱氢酶母本及其突变体的纯化
[0077]
将实施例1构建的草铵膦脱氢酶母本共表达工程菌及实施例3筛选的优势突变体共表达的工程菌按实施例2方法制备相应湿菌体。
[0078]
取草铵膦脱氢酶母本共表达工程菌及草铵膦脱氢酶突变体共表达工程菌的湿菌体各0.2g，分别用10ml结合缓冲液(含0.3m nacl的ph 7.4、100mm磷酸钠缓冲液)悬浮，超声破碎15分钟(冰浴，功率400w，破碎1秒、暂停5秒)，4℃、12000转/分钟离心20min，取上清，作为上样样品。使用ni亲和柱(1.6
×
10cm，bio-rad公司，美国)纯化得到kmgdh单体蛋白，具体操作如下：
①
用5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3m nacl的ph 7.4、50mm磷酸钠缓冲液)平衡ni柱，至基线稳定；
②
样品上样，流速1ml/min，上样量在2倍柱体积使目标蛋白吸附于ni柱上；
③
用6倍柱体积的缓冲液a(含0.3m nacl、30mm咪唑的ph7.4、50mm磷酸钠缓冲液)冲洗杂蛋白，流速1ml/min，至基线稳定；
④
用2倍柱体积的缓冲液b(含0.3m nacl、500mm咪唑的ph 7.4、50mm磷酸钠缓冲液)洗脱，流速1ml/min，收集目的蛋白。将目的蛋白置于ph 7.4、20mm磷酸盐缓冲液中透析过夜，收集截留液，分别获得草铵膦脱氢酶母本纯酶10ml和草铵膦脱氢酶突变体纯酶10ml；
⑤
5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3m nacl的ph 8.0、50mm磷酸钠缓冲液)冲洗ni柱直至基线稳定，用5倍柱体积含20％乙醇的超纯水保存ni柱。
[0079]
纯酶的蛋白浓度用bca蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定，如表3所示。
[0080]
实施例5：草铵膦脱氢酶母本及其突变体比酶活测定
[0081]
酶活单位(u)定义为：在35℃、ph 7.4条件下，每分钟每生成1μmol的l-草铵膦所需的酶量定义为一个酶活单位，u。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，u/mg。
[0082]
酶活检测标准条件：100mm 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸，添加50mm nadh，含有200μg蛋白含量的纯酶液(实施例4方法制备)，以ph7.4、50mm磷酸钠缓冲液为反应介质构成1ml的反应体系，30℃、ph 7.4，600转/分钟条件下反应10分钟，采用实施例3方法进行hplc检测分析，相对酶活见表3。
[0083]
表3草铵膦脱氢酶母本及其突变体比酶活
[0084]
[0085]a：在标准条件下，每个草铵膦脱氢酶母本的初始酶活均指定为100％。
[0086]
实施例6：草铵膦脱氢酶母本及其突变体的动力学参数测定
[0087]
考察草铵膦脱氢酶母本及其突变体的动力学参数，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸作为底物，浓度设置为20-200mm(20、50、100、150、200mm)，添加足量辅酶，加入适量的纯酶液(实施例4方法收集)。
[0088]
反应体系选择为500μl：实施例4方法收集的母本及突变体纯酶液以ph7.4、100mm磷酸盐缓冲液稀释。取稀释后的纯酶液，加入底物和外源性辅酶nadh，ph7.4、100mm磷酸盐缓冲液为反应介质构成500μl反应体系，其中纯酶加入量以蛋白含量计为200mg/l，底物为20-200mm(20、50、100、150、200mm)，nadh加入浓度为50mm，35℃、600转/分钟反应10min，取反应液采用实施例3方法检测l-草铵膦浓度。
[0089]
通过双倒数作图可计算得出k
cat
、v
max
、km，结果如表4所示，通过比较k
cat
和km，可以发现，kmgdh对2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸的km值是8.56mm，其余突变体对2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸亲和力有增加趋势。突变体kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l对2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸的催化效率k
cat
/km达到396.8s-1
*m-1
，母本(k
cat
/km＝3.2s-1
*m-1
)提高124倍。
[0090]
表4母本kmgdh及其突变体动力学参数比较
[0091]
酶k
cat
(s-1
)km(m)k
cat
/km(s-1
*m-1
)kmgdh1.30
±
0.10.41
±
0.023.2kmgdh-p145g54.1
±
4.20.35
±
0.07154.6kmgdh-s348a33.6
±
3.80.40
±
0.0384.0kmgdh-p145g-v384q-n78s71.4
±
3.10.32
±
0.01223.1kmgdh-p145g-v384f-k70a72.4
±
2.80.22
±
0.05329.1kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l75.4
±
1.20.19
±
0.01396.8
[0092]
实施例7：草铵膦脱氢酶母本及其突变体的热稳定性的测定
[0093]
考察草铵膦脱氢酶母本及其突变体共表达酶的热稳定性，将实施例4方法收集的母本和突变体kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l纯酶液20ml分别放置于35℃、50℃、65℃的水浴下保温，每隔4h取出适量酶液用于活力测定(按实施例5进行)。连续测量24h后将获得的数据拟合后计算半衰期。草铵膦脱氢酶母本和突变体kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l的热稳定性分别如图5和图6所示，拟合计算后，草铵膦脱氢酶母本在35℃、50℃、65℃下的半衰期分别为18.4h、11.2h和6.9h；突变体kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l在35℃、50℃、65℃下的半衰期分别为294.7h、143.0h和25.7h。
[0094]
实施例8：草铵膦脱氢酶突变体工程菌的固定化细胞的制备
[0095]
(1)按实施例2方法制备突变体共表达e.coli bl21(de3)-kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l-psefdh工程菌的湿菌体100g，加入ph7.5的磷酸缓冲液1l，配制成100g/l的悬浮液，加入2.25g硅藻土，充分搅拌30min；
[0096]
(2)向步骤(1)的混合液中加入聚乙烯亚胺(分子量10000)3ml(用盐酸预调ph至7.0)，充分搅拌30min；
[0097]
(3)向步骤(2)的混合液中加入戊二醛3ml，继续充分搅拌30min；
[0098]
(4)步骤(3)真空抽滤使得固液分离，收集固定化细胞150g(湿菌体含量0.67g/g固
定化细胞)，并用水洗涤3次，保存于4℃冰箱中。
[0099]
实施例9：固定化细胞性能测定及用于l-草铵膦合成
[0100]
1、酶活
[0101]
取实施例8制得的固定化细胞0.5g(含湿菌体0.2g)于10ml ph 7.5磷酸盐缓冲液中，加入100mm的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸，150mm甲酸铵，1mm nad 构成1ml的反应体系，35℃、600rpm反应10min，取样，采用实施例3所述hplc检测产物l-草铵膦的浓度，根据实施例5酶活测试方法计算固定化细胞酶活。
[0102]
同样条件下，检测突变体共表达e.coli bl21(de3)-kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l-psefdh工程菌的湿菌体的酶活，作为游离细胞酶活。
[0103]
固定化细胞酶活除以游离细胞酶活计算出固定化细胞酶活回收率。
[0104]
结果表明，固定化细胞酶活为162.5u/g，酶活回收率为78.1％。
[0105]
2、重复使用
[0106]
取实施例8方法制得的固定化细胞37.5g(含湿菌体25g)于3l装有1l磷酸盐缓冲液(ph＝7.5，100mm)的机械搅拌反应器中，加入2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸400mm，甲酸铵600mm，nad

0.1mm，35℃，600rpm搅拌转速反应8h，每隔0.5h取样，采用实施例3所述方法检测底物和产物l-草铵膦的浓度，计算底物转化率和ee值，结果见图7所示。图7表明以固定化细胞为催化剂，可以实现4h内完全转化400mm底物ppo，产物对ee值大于99.9％。
[0107]
反应结束后，反应液真空抽滤进行固液分离后，沉淀(即固定化细胞)用蒸馏水洗涤三次后，进行下一批转化，计算每一批次的转化率，结果见图8所示。同样条件下，将固定化细胞替换为e.coli bl21(de3)-kmgdh-p145g-v384y-s348a-a292c-a202l-psefdh工程菌的湿菌体。
[0108]
图8结果表明，固定化细胞连续操作22批次仍能保持100％的转化率，而未经固定化的湿菌体在相同的反应条件下，第二批次开始转化率明显下降，重复使用4批次后完全失去活力。
[0109]
实施例10：草铵膦脱氢酶突变体固定化细胞的制备及性能检测
[0110]
制备方法同实施例8，不同之处在于，步骤(1)中载体改为活性炭，步骤(2)中聚乙烯亚胺分子量为1800，步骤(3)中所用交联剂为双醛淀粉。
[0111]
经测定，所得固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为106.4u/g，连续转化20批次后转化率为68.7％。
[0112]
实施例11：草铵膦脱氢酶突变体固定化细胞的制备及性能检测
[0113]
制备方法同实施例8，不同之处在于，步骤(1)中载体改为膨润土，步骤(2)中聚乙烯亚胺分子量为700，步骤(3)中所用交联剂为戊二醛。
[0114]
经测定，所得固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为154.3u/g，连续转化20批次后转化率为65.1％。
[0115]
实施例12：草铵膦脱氢酶突变体固定化细胞的制备及性能检测
[0116]
制备方法同实施例8，不同之处在于，步骤(1)中载体改为蒙脱土，步骤(2)中聚乙烯亚胺分子量为70000，步骤(3)中所用交联剂为乙二醛。
[0117]
经测定，所得固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为80.7u/g，连续转化20批次后转化率为56.6％。