量子点胶束球形核酸传感器及其制备方法和在Pb

量子点胶束球形核酸传感器及其制备方法和在pb
2
检测中的应用
技术领域
1.本发明属于生物传感技术领域，具体涉及量子点胶束球形核酸传感器及其制备方法和在pb
2
检测中的应用。


背景技术：

2.铅离子(pb
2
)是i类环境污染物，常见于蓄电池、电焊、铅锌冶炼等工业生产中，可通过消化道和呼吸道被人体摄入，并在体内积累，引起各种健康问题。进入人体后的铅，可与体内的生物分子发生作用导致机体慢性损伤，破坏消化系统，神经系统，呼吸系统，生殖系统等的功能。各大环境组织针对于铅离子制定了相关标准，如美国环境保护署(epa)设定的饮用水中铅离子含量上限为72纳摩，中国国标规定饮用水中铅离子含量上限为0.01mg/l。水环境中铅离子的精准检测目前已经发展出多种方法，比如传统的原子吸收光谱、原子发射光谱和电感耦合等离子体质谱法等，但以上方法均不适合现场检测。
3.荧光生物传感器法凭借其方便制备、检测灵敏、便于现场检测的特点应运而生。在荧光生物传感器中，功能性核酸如适配体(aptamer)通常被用作离子识别单元。适配体是通过体外筛选获得的单链核酸序列，通过与靶标结合形成独特结构，能特异性识别离子、小分子、生物大分子或细胞等一系列靶标，具有成本低、稳定性好、易于修饰、设计灵活等优点。常见的铅离子特异性适配体有ps2.m，agro100和t30695等。量子点又叫无机纳米晶，具有抗光漂白性好、亮度高、单一波长激发多色发射等优良的光学性质，广泛用作荧光生物传感器的信号显示单元。量子点胶束(qm)是直接在油溶量子点表面通过疏水作用包覆磷脂制成的水溶性胶束，具有制备简单、较高荧光量子产率、较大表面积便于进一步功能化修饰的优势。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种量子点胶束球形核酸传感器(qm-sna)，其利用dna酶行走机制，用于pb
2
荧光放大检测的方法，可以实现对重金属铅离子的高灵敏度和高特异性检测。
5.本发明还提出了所述量子点胶束球形核酸传感器的制备方法和应用。
6.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种量子点胶束球形核酸传感器，所述传感器通过在量子点胶束表面偶联两种核酸分子(适体酶和猝灭剂修饰的酶底物)制备得到，所述适体酶由5
’‑
氨基修饰的铅离子适配体与dna酶序列杂交形成；所述酶底物为包含ra位点的发夹结构dna，其5’端修饰氨基，3’端修饰猝灭剂。
7.其中，所述dna酶为镁离子或锌离子特异性核酸酶序列。
8.其中，所述猝灭剂为bhq2，同时可以根据不同的量子点的荧光发射波长可以选择不同的荧光猝灭剂。
9.其中，所述5
’‑
氨基修饰的铅离子适配体、dna酶序列、酶底物分别为：
10.nh
2-(ch2)
6-ttttttacacagtacaccgccttgtcgcagtcatacgaatccacatgggtgggtgggtgggt；
11.catgttcagcgatccggaacggcacccatgtggatt；
12.nh
2-(ch2)
6-ttttttacacagtacaaatccraggaacatgagcgatccggaacggcacccatgtactgtgttttttt-bhq2。
13.其中，所述量子点胶束通过量子点与二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(dspe-peg-cooh)通过薄膜水化超声的方法制备得到，具体是将：将量子点溶解于三氯甲烷当中，然后向其中加入二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(dspe-peg-cooh)，通过旋转蒸发仪制备得到含有量子点胶束的薄膜，向其中加入去离子水进行超声处理制备得到均匀分散的量子点胶束。
14.本发明所述的量子点胶束球形核酸传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
15.向含qm缓冲液中加入edc溶液，sulfo-nhs溶液活化；向该缓冲液中加入适体酶溶液、酸底物溶液，搅拌反应后，超滤提纯得到量子点胶束球形核酸传感器。
16.本发明所述的量子点胶束球形核酸传感器在pb
2
检测中的应用。
17.其中，所述量子点胶束球形核酸传感器在pb
2
定量检测中的应用。
18.其中，所述量子点胶束球形核酸传感器中的适体酶特异性结合pb
2
形成g-四链体，释放dna酶，dna酶在镁离子的辅助下以酶底物为轨道自动行走；采用荧光分光光度计测量行走结束后量子点胶束的荧光信号，实现对pb
2
的检测分析。
19.其中，加入的靶标pb
2
与适体酶中的适配体单元特异性结合形成g-四链体，同时释放dna酶单元，释放的dna酶自动识别酶底物，结合金属离子后酶活性激活，特异性剪切底物上的ra位点，释放带有猝灭剂的片段，dna酶行走导致大量猝灭剂远离量子点胶束表面，荧光共振能量转移效应消失，量子点胶束荧光恢复。
20.本发明中量子点胶束是油溶性量子点通过薄膜水化法制备而成的。适体酶为5’端氨基修饰的铅离子适配体与dna酶杂交形成，dna酶底物为包含ra位点的发夹结构dna，其5’端修饰氨基，3’端修饰猝灭剂。适体酶和底物5’端均通过酰胺键连接于量子点胶束表面，由于底物修饰猝灭剂，量子点胶束的荧光处于猝灭状态。靶标触发并在镁离子辅助下，dna酶沿量子点胶束球形核酸表面dna轨道(底物序列)的自动化行走。靶标不存在的条件下，适体酶为dna酶与适配体序列形成的杂交双链，上下臂封闭。加入靶标，pb
2
与适体酶中的适配体单元特异性结合形成g-四链体，将原本结合的dna酶释放出来；释放的dna酶上下臂与底物杂交，结合金属离子后酶活性激活，特异性剪切底物上的ra位点，释放带有猝灭剂的片段；依次自驱动行走。最终dna酶行走结束，导致大量猝灭剂远离量子点胶束表面，荧光共振能量转移效应消失，量子点胶束荧光恢复。采用荧光分光光度计测量dna酶行走结束后量子点胶束的荧光信号，实现pb
2
的高灵敏度、高特异性检测分析。qm荧光强度标定靶标pb
2
数量，qm荧光强度与靶标丰度之间存在线性关系，绘制标准曲线。
21.本发明将量子点胶束与适体酶相结合，设计了一种特定的核酸适体酶，既保持着适配体高特异性的识别能力，又具备dna酶的高效信号放大的能力，从而构建量子点胶束球形核酸传感器，可用于靶标铅离子的高灵敏度、高特异性分析，其中适配体与核酸酶偶联形成适体酶兼具适配体和核酸酶的优点，即可以实现特异性分子识别，又具有催化信号放大
器功能。本发明中基于qm-sna的dna酶行走用于pb
2
荧光放大检测的方法，实现了pb
2
的高灵敏、高特异性检测，为检测重金属离子提供了新的检测方法。
22.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
23.本发明制备了量子点胶束球形核酸结构的荧光传感器，利用适体酶技术将高特异性的适配体与金属依赖性dna酶介导的信号放大结合起来，通过靶标触发dna酶自动行走介导的qm荧光增强，实现对靶标pb2 的高灵敏度和高特异性检测；该量子点胶束球形核酸传感器可用于后期铅离子现场检测。
24.本发明检测(行走)时间只需要45分钟；检测限低可以达到5皮摩(pm)，检测范围宽，重复性好；并且可通过荧光强度的变化进行靶标的检测。
附图说明
25.图1为qm-sna传感器利用dna酶行走机制检测pb
2
示意图；
26.图2为qm与qm-sna的近红外吸收、水动力尺寸、荧光性质表征；
27.图3为pb
2
触发适体酶构象变化；
28.图4为基于qm-sna的dna酶行走动力学；
29.图5为qm-sna传感器检测pb
2
的灵敏度和标准曲线；
30.图6为qm-sna传感器检测pb2 的特异性。
具体实施方式
31.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
32.实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.实施例1
34.适配体、dna酶、底物的序列设计
35.如图1所示，针对靶标pb
2
，设计了相对应的适体酶dna和底物(substrate)。适体酶包括适配体序列和dna酶序列，适配体序列主要包含靶标结合区和dna酶互补区，5’端修饰氨基用于偶联至qm表面。其中，靶标结合区为靶标的特异性识别序列，用于与靶标结合形成g-四链体，破坏适体酶的双链结构将dna酶释放出来。dna酶序列主要包括三个部分：适配体互补区、(底物)轨道结合区、催化中心区。其中，适配体互补区序列为适配体的互补序列，用于与适配体序列杂交形成适体酶，固定和抑制酶活性的作用；轨道结合区包括上下臂两段序列，用于与底物的结合；催化中心区用于结合金属离子后识别并剪切ra位点。底物序列主要包括上下臂的互补序列、ra位点，5’端修饰氨基用于偶联至qm表面，3’端修饰bhq用于猝灭qm荧光。所有适配体、dna酶、底物序列均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
36.各序列如表1所示，aptamer中，碱基序列第47位到第62位(gggtgggtgggtgggt)为靶标结合区；下划线部分(aatccacatgggtg)为dna酶互补区。dnazyme中，下划线(cacccatgtggatt)部分为适配体互补区；碱基序列第1位到第7位(catgttc)和第32位到第36位(ggatt)为轨道识别区；碱基序列第8位到第31位(agcgatccggaacggcacccatgt)为催化中心区。substrate中碱基序列第17位到第21位(aatcc)和第24位到第30位(gaacatg)为dna酶识别区；碱基序列第22位为ra位点(dna酶识别剪切的位点)。
37.表1适配体、dna酶以及底物核酸的序列设计
[0038][0039]
实施例2
[0040]
制备负载酶和底物的qm-sna
[0041]
量子点胶束qm通过薄膜水化超声制备：所用量子点为cdse/zns(苏州星烁纳米科技有限公司购买)。将0.1mg量子点与4mg二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(dspe-peg2000-cooh)溶解于1ml三氯甲烷中。在45℃条件下利用旋转蒸发仪反应15min得到含有qm的薄膜；向其中加入1ml的去离子水通过超声的方式进行分散制备得到qm溶液。
[0042]
qm-sna通过化学交联法制备：在总体积为500μl的反应体系里，向含有10nm的qm缓冲液(磷酸盐缓冲溶液：0.01m，ph 7.4)中加入10μl edc溶液(1mm)，10μlsulfo-nhs溶液(0.5mm)，在室温下活化30min。向该缓冲液中加入适体酶溶液16.7μl(1μm)、酶底物溶液66.7μl(1μm)，搅拌反应4h，利用5k超滤管离心进行提纯，其中适体酶通过100μl的aptamer(2μm)与100μl的dnazyme(2μm)在37℃条件下杂交1h得到，适体酶和酶底物的溶液均为0.01m ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液。
[0043]
对所制备的qm-sna的组成、水动力尺寸以及荧光性质进行了系统的测定，qm胶束作为阴性对照，结果如图2所示。从图2a中发现，相比于qm，qm-sna的红外光谱中出现了核酸特有的苯环(1556cm-1
)与磷氧双键(1062cm-1
)红外特征峰，说明qm表面核酸的成功连接。如图2b所示，相比qm，qm-sna的水动力尺寸增加了～7nm，表明qm表面偶联了较高密度的核酸。从图2c中发现，qm在连接修饰bhq的底物后，其荧光会被猝灭，猝灭效率约为86％。
[0044]
实施例3
[0045]
pb
2
触发适体酶构象变化
[0046]
使用chirascan圆二色光谱仪测量dna的cd光谱。将适体酶样品溶解在0.01m ph 7.4的磷酸盐缓冲中使得终浓度为5μm，测量其cd光谱。然后向其中加入5000pm pb
2
，室温反应30min后测量其cd光谱。使用2mm光程长的石英池和仪器扫描仪进行记录，扫描范围是200到320nm，扫描三次取平均值。
[0047]
结果如图3所示，无pb
2
条件下，适体酶在275nm处出现一个正峰，285nm出现峰肩，呈现双链dna的特征。加入pb
2
(5000pm)后，适体酶在242nm处出现负峰，在270nm处出现一个正峰，与适配体结合pb
2
形成的典型g-四链体特征相同，说明pb
2
能够将适体酶双链结构打开，释放出dna酶。
[0048]
实施例4
[0049]
qm表面靶标触发的dna酶行走
[0050]
采用荧光分光光度计测定10nm qm-sna传感器与pb
2
充分反应后量子点胶束的荧
光光谱，观察量子点胶束的荧光响应情况。将195μl混合溶液(包括10nm的qm-sna，50mm的pb
2
，0.01m ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液)在37℃条件下充分反应1h，使靶标pb
2
与适体酶充分反应。再加入5μl的mg
2
(2m)溶液，每隔5min测量一次荧光光谱。
[0051]
qm的荧光强度变化如图4所示，所设计的dna酶行走过程中，随着行走时间的不断延长，qm荧光不断增强，并在45min时荧光达到最大值，有利于实现pb
2
的较快速检测。
[0052]
实施例5
[0053]
qm-sna传感器检测pb
2
的灵敏度和标准曲线
[0054]
将qm-sna和mg
2
溶液加入0.01m ph 7.4磷酸盐缓冲溶液中得到两者的终浓度分别为10nm和50mm，分别与不同浓度的靶标pb
2
共同孵育(加入浓度分别为0、1、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、50000、105pm)，在37℃条件下充分反应2h。荧光光谱仪测量量子点的荧光光谱，绘制标准曲线为：y＝2.902x-0.309。
[0055]
如图5所示，荧光光谱和照片均显示，随着pb
2
浓度的增加，qm红色荧光逐渐增强。绘制的标准曲线表明，qm-sna在5～5000pm范围内对pb
2
具有良好的线性响应，即定量检测pb
2
的线性动态范围为3个数量级；根据三倍标准差法则计算得到的pb
2
检出限为5pm，相关系数≥0.99。以上结果表明，该qm-sna传感器利用dna酶行走介导的信号放大机制，检测pb
2
具有较高的灵敏度。
[0056]
实施例6
[0057]
qm-sna传感器检测金属离子的特异性
[0058]
将qm-sna(终浓度10nm)和mg
2
(终浓度50mm)溶液加入0.01m ph 7.4磷酸盐缓冲溶液中，分别与pb
2
、k

、na

、ca
2
、mg
2
、cu
2
、zn
2
、fe
2
、mn
2
、cd
2
、cr
3
、fe
3
、ag

、hg
2
(浓度均为5000pm)37℃共同反应2h，测量qm-sna荧光光谱，绘制柱状图。
[0059]
结果如图6所示，只有pb
2
存在时，qm-sna传感器产生明显的荧光响应，而其它离子存在时，均不会产生荧光响应。以上结果表明，该qm-sna传感器检测pb
2
具有较高的特异性。