一株曲霉菌S53及其在抑制植物病原菌中的应用的制作方法

一株曲霉菌s53及其在抑制植物病原菌中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物农药领域。具体而言，本发明涉及一株曲霉菌 s53及其在抑制植物病原菌中的应用。


背景技术：

2.灰葡萄孢(botrytis cinerea)是灰霉病的病原菌，被列为世界十大 植物真菌病害之一。灰葡萄孢能够侵染植物的根茎、叶片、花和果实， 影响超过200种农作物。在我国，灰葡萄孢严重危害番茄、草莓及葡 萄等重要经济作物生长，每年造成巨大的经济损失。灰葡萄孢是一种 适宜在低温、高湿环境下生长的植物病原菌。在农业生产中，温室内 温度通常保持在15～20℃，且具有较高的相对湿度，极易引起灰霉 病大范围的发生。而在作物采摘后的贮藏和运输过程中，灰葡萄孢也 会加速其腐烂变质，导致严重的物流损失。
3.截止目前，灰葡萄孢的防治手段以施加化学杀菌剂为主，虽可高 效抑制病害，但与其他植物病原菌相比，灰葡萄孢的遗传变异性强， 易于对作用靶点相对单一的化学杀菌剂产生抗药性，并成为当前灰葡 萄孢防治亟需解决的“卡脖子”难题。此外，长期过量应用化学杀菌 剂也会导致农药残留超标、污染环境并危害人畜健康。与灰葡萄孢类 似，苹果腐烂病菌(valsa mali)作为苹果生产的重要植物病害之一， 也面临化学杀菌剂长期应用所导致的上述问题。
4.与化学杀菌剂相比，生物杀菌剂的研究与开发已经成为植物病害 防治的重要措施之一。其中，从微生物中寻找抑制植物病原菌的潜力 菌株已经成为生物杀菌剂的最重要方向之一。截止目前，芽孢杆菌、 链霉菌等细菌及木霉菌、青霉菌等真菌中的部分菌株已经成功开发为 商品化杀菌剂。生物杀菌剂的应用能够有效减少化学农药的使用，与 环境兼容性好，也符合我国绿色、健康农产品生产的发展趋势。


技术实现要素：

5.本发明的目的为提供一株曲霉菌s53及其在抑制植物病原菌中的 应用。该菌株易于规模发酵生产，其发酵产物能够显著抑制多耐药灰 葡萄孢及苹果腐烂病菌等重要经济作物病原菌，且具有显著的抗逆性 及耐盐碱性，能够开发为广谱防治多种植物病原菌的生物杀菌剂。
6.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
7.一种碱蓬来源曲霉菌(aspergillus sp.)菌株s53，分离于青岛市洋河入 海口采集的碱蓬根际土壤；该菌株于2021年11月11日保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏编号为cctcc no.m 20211401。
8.本发明所述的曲霉菌菌株s53在制备抑制植物病原菌的发酵产物 中的用途；所述植物病原菌为多耐药灰葡萄孢及苹果腐烂病菌。
9.在上述方案的基础上，所述曲霉菌菌株s53的发酵产物制备方法， 该方法包括下列步骤：
到土壤悬浮母液，并依次稀释至10-1
、10-2
及10-3
浓度；(3)分别吸 取100μl上述稀释液，均匀涂布于含3.5％海盐的pda双抗培养基平 板，每个梯度设置三个平行；(4)将平板28℃静置培养，挑取培养 基表面不同形态的菌落，并在含3.5％海盐的pda双抗培养基平板上 进行划线分离，定时观察菌落生长情况；(4)继续采用平板划线法分 离纯化菌株，编号保存。
28.(2)菌株鉴定
29.将菌株s53接种至含3.5％海盐的pda平板表面，28℃培养3d观 察，见图1。可见，菌株s53培养3d，菌丝即可铺满整个平板，具 有显著的抗逆性及耐盐碱性。菌落中央的菌丝呈棕褐色、边缘显黄褐 色，并散布大量褐色分生孢子。菌落背面中央呈黄褐色，边缘显淡黄 色。
30.所述菌株的rdna基因序列测定结果(its-5.8s-its2区)如下：
31.gggttctgagtgaggtcctcggggcccaacctcccacccgtgtataccgt accttgttgcttcggcgggcccgccgcgcaagcggccgccggggggggcgtc aaacccccctccctaggcgagcgcccgccggagacaccaacgtgaacactgtc tgaagttttgttgtctgagttcgattgtatcgcaatcagttaaaactttcaacaa tggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataattaat gtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcaccccc tggtattccggggggtatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggc ttgtgtgttgggtcgtcgtccccccggggacgggcccgaaaggcagcggcgg caccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctcttgtaggccc ggccggcgctggccgacgctgaaaagcaaccaactatttctccaggttgacct cggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaaaagccggagga
32.该序列信息与genbank数据库中已知菌株相应序列信息比较，其 与菌株aspergillus subramanianii(accession number:kp329614.1)的相 似度最高，为99.31％。
33.综上所述，菌株s53鉴定为曲霉菌(aspergillus sp.)，该菌株于2021 年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no.m20211401。
34.实施例2：曲霉菌菌株s53的发酵产物制备
35.(1)挑取少量保存于含3.5％海盐的pda培养基斜面的曲霉菌菌 株s53，接种于含3.5％海盐的pda平板表面，28℃培养至菌落铺满平 板表面，待用；
36.(2)切取上述平板表面的曲霉菌菌株s53(约2cm
×
2cm)，接 种至已灭菌的、盛有液体培养基的锥形瓶中，28℃静置发酵30d；所 述液体培养基为蔗糖2％，甘露醇2％，蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.3％， 20％人工海水(3.5％海盐)土豆浸出液配制，ph 7；
37.(3)发酵培养基以乙酸乙酯提取，提取液减压蒸馏得到发酵产 物。
38.实施例3：抑菌活性测定
39.抑菌活性测定方法采用滤纸片法，具体步骤如下：
40.(1)供试植物病原菌
41.多耐药灰葡萄孢sg1-3与sg1-4，均分离自山东寿光的蔬菜大棚。 其中，菌株sg1-3对灰葡萄孢常用化学防治杀菌剂：啶酰菌胺、嘧菌 酯及异菌脲具有耐药性；而菌株sg1-4则对啶酰菌胺、嘧菌酯、异菌 脲及嘧霉胺均具有耐药性。
42.(2)样品溶液的制备
43.曲霉菌菌株s53的发酵产物以甲醇溶解，配制为200mg/ml溶液， 备用。
44.(3)试验方法
45.以打孔器在供试植物病原菌的菌落边缘打取5mm左右的菌饼， 将其与5mm无菌滤纸片分别放置于9cm的pda平板表面。两者距 离平板边缘均为25mm，且处于同一直线上。吸取5μl的曲霉菌菌 株s53发酵产物溶液至滤纸片(上样量为1mg)，以加入等体积的甲 醇为对照。28℃、培养5d，观察发酵产物能否抑制供试植物病原菌 的生长。
46.结果见图2～图4。可见，曲霉菌菌株s53发酵产物能够显著抑制 供试植物病原菌的生长。其对多耐药灰葡萄孢sg1-3、sg1-4及苹果 腐烂病菌的抑菌圈分别为28mm、39mm及38mm。这表明，曲霉 菌菌株s53具有开发为广谱防治多种植物病原菌的生物杀菌剂潜力。
47.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效 果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具 体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精 神和原则之内，所做的任何修改、等同替换改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。