果蔬废水资源化菌剂及其在制备微生物复合肥料中的应用的制作方法

1.本发明涉及一组果蔬废水资源化菌剂及其在微生物处理果蔬废水制备微生物复合肥料中的应用。


背景技术：

2.我国是一个果蔬废弃物产生大国，果蔬废弃物含水高达90%以上，果蔬废弃物在实现无害化、减量化、资源化的过程中必然会产生大量高浓度废水。其所产废水中cod高达50000mg/l，氨氮800mg/l，总磷150mg/l，如果作为污水处理，不论是达到地表水排放标准还是达到纳管标准，都面临巨大的处理压力。
3.微生物作为自然界分解者，果蔬残体分解为植物可吸收的成分返还给土壤，因此如果采用能分解果蔬中多糖、蛋白、纤维等物质的菌种将其转化为植物可吸收的氨基酸、速效磷、有效钾、水溶性氮及多种微量元素，因此若采用能分解尾菜中多糖、蛋白、纤维等物质的菌种将其转化为植物可吸收的物质制成微生物复合肥料，将大大减轻环境压力，且可变废为宝，对蔬菜产业具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供一组果蔬废水资源化菌剂，及其在微生物处理果蔬废水制备微生物复合肥料中的应用。
5.本发明采用的技术方案是：一组果蔬废水资源化菌剂，包括好氧菌剂hqy-hyd-003和好氧菌剂hqy-of-003，所述好氧菌剂hqy-hyd-003由地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis ）accc 01050、解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）cctcc no：m 2017040、蔬菜芽孢杆菌（bacillus oleronius）cctcc no：m2017039和凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）cctcc no：wb 2008523组成；所述好氧菌剂hqy-of-003由褐球固氮菌（azotobacter chroococcum）cctcc no：jb 2008159、苏云金芽孢杆菌（bacillus thuringiensis）cctcc no：kb 2008858、东方伊萨酵母（issatchenkia orientails）cctcc no：dy 20081398、毕赤酵母（pichia farinose）cctcc no：m 2017044和固氮类芽孢杆菌（paenibacillus azotofixans）accc 10251组成。
6.本发明微生物菌剂中的菌种选用《微生物肥料生物安全通用技术准则（ny1109-2006）》中免作毒理学试验的菌种及卫生部印发关于《可用于食品的菌种名单》的通知中的菌种，不含重金属和有毒害化学物质，实体产品无毒无刺激性。实际应用不会对环境造成二次污染，不会额外造成负担，属于环境友好亲和型微生物菌剂产品，并且，本菌剂储运和投放简便高效。本工艺操作简单，无外部化学药品添加，且发酵完成的植物营养液无外部化学药品添加，富含植物生长所需的大量及微量元素，对植物生长具有促进作用。
7.本发明微生物菌剂中的菌种选用《微生物肥料生物安全通用技术准则（ny1109-2006）》中免作毒理学试验的菌种及卫生部印发关于《可用于食品的菌种名单》的通知中的
菌种，再经过特定的培养基活化，按照不同比例将各菌种复合配制成果蔬废水发酵菌剂hqy-hyd
ꢀ‑
003和hqy-of-003。
8.优选的，以培养至对数中后期的活菌数量占比计，好氧菌剂hqy-hyd-003组成如下：地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis ）accc 01050 25~35%、解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）cctcc no：m 2017040 30%~40%、蔬菜芽孢杆菌（bacillus oleronius）cctcc no：m 2017039 20%~30%，凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）cctcc no：wb 2008523 10%~20%；好氧菌剂hqy-of-003组成如下：褐球固氮菌（azotobacter chroococcum）cctcc no：jb 2008159 20~30%、苏云金芽孢杆菌（bacillus thuringiensis）cctcc no：kb 200885820%~30%、东方伊萨酵母（issatchenkia orientails）cctcc no：dy 2008139820%~30%、毕赤酵母（pichia farinose）cctcc no：m 20170445%~10%和固氮类芽孢杆菌（paenibacillus azotofixans）accc 1025115%~25%。
9.优选的，以单个纯菌培养到对数中后期的活菌数量比（cfu/cfu）计，好氧菌剂hqy-hyd-003组成如下：地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis ）accc 01050 30%、解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）cctcc no：m 2017040 30%、蔬菜芽孢杆菌（bacillus oleronius）cctcc no：m 2017039 25%，凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）cctcc no：wb 2008523 15%；好氧菌剂hqy-of-003组成如下：褐球固氮菌（azotobacter chroococcum）cctcc no：jb 2008159 25%、苏云金芽孢杆菌（bacillus thuringiensis）cctcc no：kb 200885825%、东方伊萨酵母（issatchenkia orientails）cctcc no：dy 2008139822%、毕赤酵母（pichia farinose）cctcc no：m 20170448%和固氮类芽孢杆菌（paenibacillus azotofixans）accc 1025120%。
10.本发明好氧菌剂hqy-hyd-003的制备方法如下：将各菌种接入到液体菌种活化培养基，30℃~35℃好氧活化12h~18h制作进行活化，再以1%~3%的接种量接入到种子培养基，30℃~35℃好氧发酵20h~24h制作成种子液。然后将种子液按照各菌种比例混合后以3%~5%的接种量接入到菌体发酵培养基，30℃~35℃好氧发酵30h~36h制作菌剂hqy-hyd
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003。
11.好氧菌剂hqy-hyd-003的菌种活化培养基组成如下：0.8%~1.2%（w/v，1%表示100ml培养基中含有1g该物质，下同）蛋白胨，0.4%~0.6%酵母膏，1.8%~2.2%葡萄糖，0.8~1.2%氯化钠，1.8
‰
~2.2
‰
磷酸氢二钾，0.8
‰
~1.2
‰
氯化铵，0.18
‰
~0.22
‰
七水硫酸镁，0.048
‰
~0.052
‰
硫酸锰，ph调至约7.0，115℃条件下灭菌30分钟。种子培养基组成如下：1.8%~2.2%蛋白胨，0.8%~1.2%葡萄糖，0.8%~1.2%糖蜜，0.8~1.2%氯化钠， 1.8
‰
~2.2
‰
磷酸氢二钾，1.8
‰
~2.2
‰
氯化铵，0.18
‰
~0.22
‰
七水硫酸镁，0.048
‰
~0.052
‰
硫酸锰，ph调至约7.0，115℃条件下灭菌30分钟。发酵培养基组成特征在于：60%~70%果蔬废水，0.8~1.2 % 糖蜜，0.4~0.6 % 蛋白胨，0.5~0.8%氯化钠，1.8
‰
~2.2
‰
磷酸氢二钾，0.18
‰
~0.22
‰
七水硫酸镁，且调ph到约7.0，115℃条件下灭菌30分钟。
12.菌剂hqy-of-003的制备方法如下：将各菌种接入到液体菌种活化培养基，30℃~36℃好氧活化10h~16h制作成种子液进行活化，再以1%~3%的接种量接入到种子培养基，30℃~36℃好氧发酵12h~18h制作成种子液。然后将种子液按照各菌种比例混合后以3%~5%的接种量接入到菌体发酵培养基，30℃~35℃好氧发酵18h~24h制作成菌剂hqy-of-003。
13.本发明还涉及所述果蔬废水资源化菌剂在资源化微生物处理果蔬废水制备微生物复合肥料中的应用。
no：m2017039 25%，凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）cctcc no：wb 2008523 15%比例混合后以5%的接种量接入到菌体发酵培养基, 30℃~35℃好氧发酵24h即可制作成菌剂hqy-hyd-003。
25.（7）步骤（6）中所用菌体发酵培养基其配制方法为：70%果蔬废水，1.0 % 糖蜜，0.5 % 蛋白胨，0.6%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，0.2
‰
七水硫酸镁，且调ph到约7.0，并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
26.（8）步骤（6）中发酵完成的菌剂hqy-hyd-003，活菌数量》108cfu/ml，室温下能稳定保存6个月，能适应多种果蔬废弃物，最佳应用条件温度：30~40℃；ph：3.5~7.5。
27.实施例2：果蔬废水资源化菌剂hqy-of-003的制备该菌剂是经过以下步骤制备的：（1）-80℃冰箱中取出甘油冻管保藏的各菌种，在经紫外灭菌的超净工作台中融解，移液枪无菌吸取1 ml接入已灭菌的10 ml液体菌种活化培养基中，进行活化。
28.（2）本菌剂制备步骤（1）中所用液体菌种活化培养基其配制方法为：1.0%蛋白胨，0.5%酵母膏，2.0%葡萄糖，1.0%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，1.0
‰
氯化铵，0.2
‰
七水硫酸镁，0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
29.（3）本菌剂制备步骤（1）中菌种接入活化培养基后，在30℃~36℃好氧活化10h~16h即可制作成活化液。
30.（4）无菌条件下吸取（3）中活化好的菌种活化液，以3%的接种量接入到种子培养基，30℃~36℃好氧发酵12h制作成种子液。
31.（5）步骤（4）中所用种子培养基其配制方法为：2.0%蛋白胨，1.0%葡萄糖，1.0%糖蜜，1.0 %氯化钠， 2.0
ꢀ‰
磷酸氢二钾，2.0
‰
氯化铵0.2
‰
七水硫酸镁，0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
32.（6）无菌条件下吸取（4）中发酵完成的种子液，种子液按照褐球固氮菌（azotobacter chroococcum）cctcc no：jb 2008159 25%、苏云金芽孢杆菌（bacillus thuringiensis）cctcc no：kb 200885825%、东方伊萨酵母（issatchenkia orientails）cctcc no：dy 2008139822%、毕赤酵母（pichia farinose）cctcc no：m20170448%、固氮类芽孢杆菌（paenibacillus azotofixans）accc 1025120%比例混合后以5%的接种量接入到菌体发酵培养基， 30℃~35℃好氧发酵24h即可制作成菌剂hqy-of-003。
33.（7）步骤（6）中所用菌体发酵培养基其配制方法为：70%果蔬废水，1.0 % 糖蜜，0.5 % 蛋白胨，0.6%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，0.2
‰
七水硫酸镁，且调ph到约7.0，并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
34.（8）步骤（6）中发酵完成的菌剂hqy-of-003，活菌数量》108cfu/ml，室温下能稳定保存6个月，最佳应用条件温度：25~45℃；ph：4~8.5。
35.实施例3：果蔬废水资源化菌剂hqy-hyd-004的制备该菌剂是经过以下步骤制备的：（1）-80℃冰箱中取出甘油冻管保藏的各菌种，在经紫外灭菌的超净工作台中融解，移液枪无菌吸取1 ml接入已灭菌的10 ml液体菌种活化培养基中，进行活化。
36.（2）本菌剂制备步骤（1）中所用液体菌种活化培养基其配制方法为：1.0%蛋白胨，0.5%酵母膏，2.0%葡萄糖，1.0%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，1.0
‰
氯化铵，0.2
‰
七水硫酸镁，
0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
37.（3）本菌剂制备步骤（1）中菌种接入活化培养基后，在32℃~36℃好氧活化12h即可制作成活化液。
38.（4）无菌条件下吸取（3）中活化好的菌种活化液，以3%的接种量接入到种子培养基，30℃~36℃好氧发酵12h制作成种子液。
39.（5）步骤（4）中所用种子培养基其配制方法为：2.0%蛋白胨，1.0%葡萄糖，1.0%糖蜜，1.0 %氯化钠， 2.0
ꢀ‰
磷酸氢二钾，2.0
‰
氯化铵0.2
‰
七水硫酸镁，0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
40.（6）无菌条件下吸取（4）中发酵完成的种子液，种子液按照地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis ）accc 01050 50%、解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）cctcc no：m2017040 30%、蔬菜芽孢杆菌（bacillus oleronius）cctcc no：m2017039 20%比例混合后以5%的接种量接入到菌体发酵培养基, 30℃~35℃好氧发酵24h即可制作成菌剂hqy-hyd-004。
41.（7）步骤（6）中所用菌体发酵培养基其配制方法为：70%果蔬废水，1.0 % 糖蜜，0.5 % 蛋白胨，0.6%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，0.2
‰
七水硫酸镁，且调ph到约7.0，并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
42.（8）步骤（6）中发酵完成的菌剂hqy-hyd-004，活菌数量》108cfu/ml，最佳应用条件温度：30~40℃；ph：5.5~7.5。
43.实施例4：果蔬废水资源化菌剂hqy-of-004的制备该菌剂是经过以下步骤制备的：（1）-80℃冰箱中取出甘油冻管保藏的各菌种，在经紫外灭菌的超净工作台中融解，移液枪无菌吸取1 ml接入已灭菌的10 ml液体菌种活化培养基中，进行活化。
44.（2）本菌剂制备步骤（1）中所用液体菌种活化培养基其配制方法为：1.0%蛋白胨，0.5%酵母膏，2.0%葡萄糖，1.0%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，1.0
‰
氯化铵，0.2
‰
七水硫酸镁，0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
45.（3）本菌剂制备步骤（1）中菌种接入活化培养基后，在30℃~36℃好氧活化10h~16h即可制作成活化液。
46.（4）无菌条件下吸取（3）中活化好的菌种活化液，以3%的接种量接入到种子培养基，30℃~36℃好氧发酵12h制作成种子液。
47.（5）步骤（4）中所用种子培养基其配制方法为：2.0%蛋白胨，1.0%葡萄糖，1.0%糖蜜，1.0 %氯化钠， 2.0
ꢀ‰
磷酸氢二钾，2.0
‰
氯化铵0.2
‰
七水硫酸镁，0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
48.（6）无菌条件下吸取（4）中发酵完成的种子液，种子液按照解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）cctcc no：m 2017040 40%，蔬菜芽孢杆菌（bacillus oleronius）cctcc no：m 201703930%，毕赤酵母（pichia farinose）cctcc no：m 201704430%比例混合后以5%的接种量接入到菌体发酵培养基, 30℃~35℃好氧发酵24h即可制作成菌剂hqy-of-004。
49.（7）步骤（6）中所用菌体发酵培养基其配制方法为：70%尾菜废水，1.0 % 糖蜜，0.5 % 蛋白胨，0.6%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，0.2
‰
七水硫酸镁，且调ph到约7.0，并将培养基
在115℃条件下灭菌30分钟。
50.（8）步骤（6）中发酵完成的菌剂hqy-of-004，活菌数量》108cfu/ml，室温下能稳定保存6个月，最佳应用条件温度：25~45℃；ph：4~8.5。
51.实施例5：采用本工艺处理菜库所产果蔬：大娃菜、娃娃菜、西兰花、黄瓜、胡萝卜、西瓜、苹果、橘子等混合果蔬废水（该废水cod值48000 mg/l，氨氮含量750 mg/l，总磷134 mg/l），在废水中添加3
‰
菌剂hqy-hyd-003，35℃，ph：4~7，溶解氧控制在2mg/l~3mg/l条件下好氧发酵1天。之后再添加3
‰
菌剂hqy-of-003，35℃，ph：5~8，溶解氧控制在3mg/l~4mg/l条件下好氧发酵3天，发酵完成后添加8%尿素，得到富含氮素的复合微生物肥料。
52.采用浙江省嘉兴市嘉丰种子有限公司的四季快菜（小白菜）种子，挑选出里面籽粒饱满种子进行测试。测试方法参考农业行业标准《蔬菜废弃物高温堆肥无害化处理技术规程（ny/t3441-2019）》中的种子发芽指数，发芽法试验进行操作。吸取稀释100倍后的10ml复合微生物肥料于铺好滤纸的9cm培养皿中，每皿均匀放入50粒种子，之后放入30℃培养箱，发芽6d，统计发芽率及根长。每个样品做3个重复，以蒸馏水为对照组。
53.测种子发芽率达到100%（参见图1），种子发芽指数达到121%（参见图2）。
54.实施例6：采用本工艺处理菜库所产果蔬：大娃菜、娃娃菜、西兰花、黄瓜、胡萝卜、西瓜、苹果、橘子等混合果蔬废水（该废水cod值52000 mg/l，氨氮含量780 mg/l，总磷145 mg/l），在废水中添加3
‰
菌剂hqy-hyd-004，35℃，ph：4~7，溶解氧控制在2mg/l~3mg/l条件下好氧发酵1天。之后再添加3
‰
菌剂hqy-of-004，35℃，ph：5~8，溶解氧控制在3mg/l~4mg/l条件下好氧发酵3天，发酵完成后添加8%尿素，得到富含氮素的复合微生物肥料。
55.采用浙江省嘉兴市嘉丰种子有限公司的四季快菜（小白菜）种子，挑选出里面籽粒饱满种子进行测试。测试方法参考农业行业标准《蔬菜废弃物高温堆肥无害化处理技术规程（ny/t3441-2019）》中的种子发芽指数，发芽法试验进行操作。吸取稀释100倍后的10ml复合微生物肥料铺好滤纸的9cm培养皿中，每皿均匀放入50粒种子，之后放入30℃培养箱，避光发芽48h，统计发芽率及根长。每个样品做3个重复，以蒸馏水为对照组。
56.测种子发芽率达到87%，种子发芽指数达到92%。
57.实施例7：采用本工艺处理菜库所产果蔬：大娃菜、娃娃菜、西兰花、黄瓜、胡萝卜、西瓜、苹果、橘子等混合果蔬废水（该废水cod值52000 mg/l，氨氮含量780 mg/l，总磷145 mg/l），在废水中添加3
‰
菌剂hqy-hyd-003，35℃，ph：4~7，溶解氧控制在2mg/l~3mg/l条件下好氧发酵1天。之后再添加3
‰
菌剂hqy-of-003，35℃，ph：5~8，溶解氧控制在3mg/l~4mg/l条件下好氧发酵3天，发酵完成后发酵液添加8%尿素，得到富含氮素的复合微生物肥料。
58.采用浙江省嘉兴市嘉丰种子有限公司的四季快菜（小白菜）种子，挑选出里面籽粒饱满种子进行测试。测试方法参考农业行业标准《蔬菜废弃物高温堆肥无害化处理技术规程（ny/t3441-2019）》中的种子发芽指数，发芽法试验进行操作。吸取稀释100倍后的10ml复合微生物肥料铺好滤纸的9cm培养皿中，每皿均匀放入50粒种子，之后放入30℃培养箱，避光发芽6d，统计发芽率及根长。每个样品做3个重复，以蒸馏水为对照组。
59.测种子发芽率达到100%，种子发芽指数达到133%。
60.上述说明已经充分揭示了本发明的具体实施方式。需要指出的是，熟悉该领域的技术人员对本发明的具体实施方式所做的任何改动均不脱离本发明的权利要求书的范围。相应地，本发明的权利要求的范围也并不仅仅局限于前述具体实施方式。