一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法。


背景技术：

2.抗生素现已广泛应用于医疗卫生和畜牧养殖业，可治疗或预防细菌感染。但抗生素的过度使用导致水体、土壤、空气中残留的抗生素不断增加。抗生素滥用所产生的抗生素选择压力引起细菌自身产生抗生素抗性突变，过度使用抗生素会对环境细菌形成选择性压力，长期大量使用抗生素会使耐药细菌数量增多，耐药性增强。抗生素的滥用是细菌产生抗生素抗性基因的重要因素。
3.抗生素可以通过再生水灌溉、用于作物或填埋场的污泥和粪肥，以及使用牲畜粪便作为土壤肥料来引入土壤。来自屠宰场、私人使用和医院应用的废水可能含有高浓度的抗生素以及许多耐药致病菌，它们在农田上的应用会影响土壤微生物的结构。因此，分离鉴定耐药菌，分析其基因型和表型，可揭示抗生素抗性基因、耐药菌的污染流通过程，为进一步有效抑制抗生素污染，分离鉴定耐药菌具有重要的意义。
4.目前运用稀释涂布平板法分离土壤微生物，将土壤样品溶液逐级稀释，得到不同浓度梯度的土壤悬液，分别稀释10-4
、10-5
、10-6
三个梯度的液体涂布于抗性培养基上，培养划线分离得到纯培养，后进行菌种保藏、16s测序等相关实验。该实验方法适用于较少的土壤样本，若需要大量筛选土壤样本中所有可培养的抗生素抗性菌，工作量巨大，耗费时间较长，效果欠佳。且运用抗生素抗性平板筛选抗性细菌，抗生素浓度难以把控，根据clsi或eucast提供的最小抑菌浓度也很难确定合适抗生素浓度能尽可能筛选出样本中所有抗性菌。抗性平板浓度过低会导致细菌生长速度较快，且种类繁杂，只能排除对该抗生素敏感的细菌，容易携带杂菌；抗性平板浓度过高易导致细菌生长速度缓慢，且筛选不出来中敏(i)的细菌，使筛菌效果大打折扣。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供了一种高效批量、筛选鉴定抗生素抗性菌的方法。
6.本发明的上述目的通过如下方案方式实现：一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法，所述方法包括如下步骤：
7.s1、取土壤样品于pbs缓冲液中充分摇匀，依次稀释不同梯度的土壤悬浮液；
8.s2、在lb培养基中加入抗生素溶液得到培养液；
9.s3、将s2培养液进行倒平板，然后取s1土壤悬浮液进行平板涂布，然后将平板倒置培养，观察菌落确定最优稀释浓度；
10.s4、根据最优稀释浓度进行批量平板涂布，分别进行倒置培养后用移液枪灭菌枪头挑菌完成接种，然后进行振荡培养；
11.s5、采用甘油保藏法进行菌种保藏；
12.s6、利用细菌16s rdna引物f27和r1492进行pcr扩增，将得到的序列进行对比鉴定。
13.本发明通过将不同浓度梯度的土壤悬浮液进行涂布，根据平板上生长的菌落情况确定有效挑选单菌落的最优稀释浓度，主要通过观察菌落数目(cfu)或者密集程度，所需菌落尽可能独立生长，不同菌落之间不连续不粘连，从而达到易于挑取接种的目的。在确认有效挑选单菌落的最优稀释梯度后，在后续批量筛选中直接在最优稀释梯度的基础上进行批量平板涂布和挑菌接种，不需要对每个浓度梯度进行涂布操作。
14.在上述的一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法中，步骤s2培养液中加入的抗生素溶液为红霉素浓度、链霉素浓度、硫酸多粘菌素b溶液中的一种。
15.在上述的一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法中，培养液中红霉素浓度为13-18ug/ml。
16.在上述的一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法中，培养液中链霉素浓度为45-55ug/ml。
17.在上述的一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法中，培养液中硫酸多粘菌素b浓度为8-12ug/ml。
18.本发明需要合理控制抗性培养基中红霉素、链霉素、硫酸多粘菌素b的浓度，如果抗生素含量过高极有可能导致抗性菌生长缓慢，不利于观察和筛选。另外，抗生素浓度过低会导致中度敏感的细菌生长，不能准确筛选耐药细菌。
19.作为优选，步骤s2中lb培养基分为固体培养基和液体培养基，其中步骤s3倒平板使用的为固体培养基，步骤s4接种过程中使用的为液体培养基。
20.在上述的一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法中，链霉素溶液、硫酸多粘菌素b溶液经过0.20-0.25um水膜滤器过滤。
21.在上述的一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法中，培养液的ph为5-6。由于培养基偏碱会损伤细胞，偏酸环境更有利于细胞生长，本发明所用lb培养基未使用naoh溶液进行ph的调整。并且在其他条件相同的情况下，本发明实验时发现当ph为7时培养基筛选得到的抗性菌数量较少，当ph为5-6时，抗性菌数量较多，且活性良好。
22.在上述的一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法中，步骤s4振荡培养温度为28-32℃，转速为170-185rpm，时间为12-24h。
23.在上述的一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法中，菌种保藏为在-20℃下将甘油与菌液混匀保藏，其中甘油终浓度为15％-30％。
24.在上述的一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法中，引物f27的序列为5'-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3'；引物r1492的序列为5'-ggt tac ctt gtt acg act t-3'。
25.在上述的一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法中，对比鉴定具体为：将序列在ncbi上进行对比，若序列相似性在97％以上，则为同种；序列相似性在85％-97％则为不同种；序列相似性小于85％，则为不同属。
26.与现有技术相比，本发明通过将不同浓度梯度的土壤悬浮液进行涂布，根据平板上生长的菌落情况确定有效挑选单菌落的最优稀释梯度，以便于后续大批量筛选鉴定抗生素抗性菌；本发明通过控制抗性培养基中红霉素、链霉素、硫酸多粘菌素b的浓度控制抗性菌生长速度，达到准确筛选耐药细菌的目的；而且本发明用灭菌枪头代替传统的接种环挑
选单菌落，反复吹打即可完成挑菌步骤，避免灼烧冷却接种环消耗大量时间，且难以掌控冷却程度，无故烫死细菌。
附图说明
27.图1为10-2
梯度的土壤稀释悬液在30℃下倒置培养20h的平板图。
28.图2为10-3
梯度的土壤稀释悬液在30℃下倒置培养20h的平板图。
29.图3为10-4
梯度的土壤稀释悬液在30℃下倒置培养20h的平板图。
具体实施方式
30.以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
31.实施例1：
32.s1、lb培养基制备：
33.lb液体培养基：称取蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加900ml蒸馏水后定容至1l，然后将培养基分装至锥形瓶，盖上封口膜，高压灭菌(121℃，20min)，冷却至室温备用。
34.lb固体培养基：称取蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉20g，加900ml蒸馏水后定容至1l，然后将培养基分装至锥形瓶，盖上封口膜，高压灭菌(121℃，20min)，冷却至45℃，倾倒平板备用。
35.s2、称量0.5g红霉素于试管中，加入10ml无水乙醇充分溶解(浓度为50mg/ml)，分装成小份于-20℃冷藏，最终以15ug/ml的浓度加入lb固体培养基；溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量水，定容至10ml(浓度为50mg/ml)，分装成小份于-20℃冷藏，最终以50ug/ml的终浓度添加于lb固体培养基；溶解0.2g硫酸多粘菌素b于足量水中，定容至10ml(浓度为20mg/ml)，分装成小份于-20℃冷藏，最终以10ug/ml的终浓度添加于lb固体培养基得到培养液，然后倒入无菌平板中。
36.s3、称取10g土壤样品置于90ml已灭菌的pbs中，然后在摇床中充分摇匀1h，为10-1
的土壤悬液。之后，用无菌吸管吸取1ml 10-1
的菌悬液加入到9ml无菌pbs中，洗吹3次混匀成10-2
稀释液，依此稀释后获得10-3
、10-4
、10-5
、10-6
不同梯度的土壤悬液，取100μl土壤悬浮液涂布于平板上，然后将平板在30℃下倒置培养20h，观察菌落数目得最优稀释梯度为10-3
，进行大批量取10-3
土壤悬液100μl涂布在各个lb固体培养基上，在25℃条件下培养30h。
37.s4、使用200μl移液枪灭菌枪头分别进行挑取单菌落，将挑取的单菌落接种到含有5ml lb液体培养基的15ml离心管中，其中接种为将枪头没于5ml lb液体培养基液面下方，反复吹打4次完成接种。
38.s5、将接种后的lb液体培养基置于180rpm、30℃的摇床中振荡培养24h到培养液变浑浊，在-20℃下以体积比1：1将甘油与菌液混匀保藏，其中甘油终浓度为20％。
39.s6、取100μl保藏菌液至1.5ml无菌离心管中，以10000rpm离心2min，用枪吸去上清，加入100μl的无菌水，振荡重悬菌体；于100℃水浴锅中煮10min以破壁，冷却至室温后以12000rpm离心2min，吸取50μl上清至另一个无菌的离心管中作为16srdna扩增的dna模板；
40.采用细菌16s rdna通用引物f27(5'-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3')及r1492
(5'-ggt tac ctt gtt acg act t-3')，进行pcr扩增。将扩增产物进行测序分析，得到序列在ncbi上进行对比分析。若序列相似性在97％以上，则可将他们看成相同的种；相似性在85％-97％之间则可定位不同的种；如果相似性小于85％，则分属于不同的属。
41.表1：实施例1中pcr反应程序
[0042][0043]
表2：实施例1中pcr反应体系
[0044][0045]
表3：实施例1筛选部分样本序列在ncbi上进行对比的相似度结果
[0046]
样本编号序列相似度(％)菌株编号199.01nr_025228.1299.29nr_157777.1398.95nr_042349.1498.97nr_118568.1598.86nr_024640.1699.44nr_024910.1799.57nr_114226.1898.65nr_024640.1999.30nr_114226.11099.72nr_114226.1
[0047]
图1-3为10-2
、10-3
、10-4
梯度的土壤稀释悬液在30℃下倒置培养20h的平板图。10-2
浓度下涂布所得平板菌落长得过于密集，互相粘连，无法挑取单菌落。10-4
浓度下涂布所得平板菌落生长缓慢，且菌落数目较少，无法大量挑取目标菌落。
[0048]
表3为部分筛选的菌株在ncbi上比对之后的结果，由表可得，用本发明分离筛选的抗性菌均能在数据库中鉴定出相对应的菌株编号和名称。
[0049]
综上所述，本发明通过取不用浓度梯度的土壤悬浮液进行涂布，根据菌落情况确定有效挑选单菌落的最优稀释梯度，以便于后续大批量筛选鉴定抗生素抗性菌；本发明通过控制抗性培养基中红霉素、链霉素、硫酸多粘菌素b的浓度控制抗性菌生长速度，达到准确筛选除耐药细菌的目的；而且本发明用灭菌枪头代替传统的接种环挑选单菌落，反复吹打即可完成挑菌步骤大大减少接种时间，且避免了接种环灼烧无故烫死细菌的情况。
[0050]
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
[0051]
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。