一种大体积尿液的预处理方法及应用与流程

1.本发明涉及一种大体积尿液的预处理方法及应用。属于基因检测技术领域。


背景技术：

2.尿路上皮癌是起源于尿路上皮的一种多源性的恶性肿瘤，是最常见的泌尿系统肿瘤。其中尿路上皮癌可分为非肌层浸润性尿路上皮癌和肌层浸润性尿路上皮癌。而10～15％的肌层浸润性尿路上皮癌患者在确诊时已出现转移。西方国家的尿路上皮癌发病率位列第4，仅次于前列腺癌、肺癌、结直肠癌。从发生部位来看，包括发生于上尿路的肾盂癌和输尿管癌以及下尿路的膀胱癌和尿道癌。其中上尿路上皮癌较少，在临床上只占尿路上皮癌的5～10％，与膀胱癌不同的是上尿路上皮癌约60％是浸润性肿瘤，预后不佳。膀胱全切或肾输尿管全长切除术是治疗尿路上皮肿瘤的金标准，但是对高危的肿瘤的患者来讲，术后局部复发或远处转移是导致长期生存没有改善的主要原因。50％的浸润型膀胱癌患者在手术前，已经存在潜在转移灶。在中国，膀胱癌是十大常见癌种之一，因易复发、易转移、治疗手段有限，已经成为我国重要疾病负担之一，并严重威胁患者的生存时间和生活质量。尿路上皮癌(uc)是常见的一种膀胱癌，占所有膀胱癌病例的90％以上。
3.血尿是指离心沉淀尿中每高倍镜视野≥3个红细胞，或非离心尿液超过1个或1小时尿红细胞计数超过10万，或12小时尿沉渣计数超过50万，均示尿液中红细胞异常增多，是常见的泌尿系统症状。原因有泌尿系炎症、结核、结石或肿瘤、外伤、药物等，对机体影响甚为悬殊。轻者仅镜下发现红细胞增多，称为镜下血尿；重者外观呈洗肉水样或含有血凝块，称为肉眼血尿。通常每升尿液中有1ml血液时即肉眼可见，尿呈红色或呈洗肉水样。由于临床上血尿的原因众多，因此我们往往需要快速知道血尿是否为尿路上皮癌相关，也就是对血尿患者进行尿路上皮癌的早期筛查和诊断。同时由于尿路上皮癌复发率很高，临床上也需要对尿路上皮癌患者进行复发监测。
4.尿路上皮癌可以导致血尿，但并不是血尿就意味着尿路上皮癌。传统的尿路上皮癌诊断方法有癌胚抗原检测、膀胱镜检等方法。癌胚抗原检测检测的准确度仍有待提高，膀胱镜检往往给病人增加痛苦和心理负担。因此使用尿液进行尿路上皮癌的无创性检测正在成为一个更好的方法。
5.无创性检测是指采用尿液、外周血、指甲、头发、唾液等作为检测的取样材料来进行的检测。相对于有创性检测来讲，无创性检测可以极大减小对被检测者的心理压力，也可以减小甚至避免取样造成的组织或器官损伤，以及感染等情况。
6.尿路上皮癌的无创性检测可以使用患者的尿液来进行。健康人的尿液当中都含有游离dna，而对于尿路上皮癌患者，其尿液中不仅含有正常的游离dna，也会从病灶中释放癌症特异性的dna到尿液中。通过检测这些癌症特异性的dna就可以对尿路上皮癌进行无创性检测。
7.tert基因是端粒酶逆转录酶基因，它编码端粒酶中具有逆转录活性的催化亚基。该基因在维持端粒长度和基因组稳定性上具有重要作用。人类tert基因核心启动子区的激
活突变会导致转录因子ets/tcf结合能力增强，从而导致该基因转录活性增加2-4倍。tert基因核心启动子区突变是尿路上皮癌组织最高频的突变之一，其达到了80％以上。并且研究发现，tert基因核心启动子区突变是与尿路上皮癌进展期无关的突变。这意味着tert基因核心启动子区突变是可以作为尿路上皮癌早期筛查的生物标志物。
8.对于早期或超早期的尿路上皮癌患者，由于其病灶微小，病灶释放出来的癌症特异性dna会非常少，甚至可能少至几个拷贝的dna分子。成年人每天大概会产生3l左右尿液，每次尿量一般平均为400～500ml左右。这么少的dna释放到如此大量的尿液中，这对dna检测技术提出了相当大的挑战。目前市场上还没有一种对超大体积尿液进行高效低成本dna提取的方案。目前的商业化尿液dna检测方法一般为取尿液中的一小部分，如2～3ml，首先进行尿液dna提取，然后再通过qpcr定量或者测序的方法进行检测。尿液的抽提增加了实验的复杂程度，比较耗费时间，而且最重要的是由于只取一小部分尿液进行检测，这大大降低了含有微量癌症特异性dna的早期或超早期的尿路上皮癌患者的检测灵敏度。


技术实现要素：

9.本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种大体积尿液的预处理方法及应用。
10.为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
11.一种大体积尿液的预处理方法，具体步骤如下：
12.(1)先利用蛋白酶k对尿液进行蛋白质消化，得到尿液ⅰ；
13.(2)再利用交联聚乙烯吡咯烷酮pvpp去除尿液ⅰ中的qpcr分子生物学反应抑制剂成分，得到尿液ⅱ；
14.(3)再以多聚赖氨酸包被的二氧化硅颗粒对尿液ⅱ中的游离dna进行富集，即可得到可用于qpcr检测的尿液样本。
15.优选的，步骤(1)中，所述尿液为新鲜血尿或收集后迅速冷冻的血尿。
16.优选的，步骤(1)的具体方法为：先将血尿经冷冻离心机800g离心10分钟，取上清，然后向上清中加入蛋白酶k，55℃消化30分钟即可；其中，血尿与蛋白酶k的体积比为1000：1，蛋白酶k的浓度为20mg/ml。
17.优选的，步骤(2)的具体方法为：先向尿液ⅰ中加入交联聚乙烯吡咯烷酮pvpp，垂直混匀仪上颠倒混匀，接着经冷冻离心机1600g离心5分钟，取上清，即为尿液ⅱ；其中，血尿与pvpp的用量比为100ml：35mg。
18.优选的，步骤(3)中，多聚赖氨酸包被的二氧化硅颗粒，其制备方法如下：先将硅胶粉、粉末状多聚赖氨酸加入ph＝7的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐tris-hcl中，涡旋30分钟，离心取沉淀，清洗，即得；其中，硅胶粉、粉末状多聚赖氨酸、tris-hcl的配比为250mg：100mg：10ml，tris-hcl的浓度为100mm。
19.优选的，步骤(3)的具体方法为：先将多聚赖氨酸包被的二氧化硅颗粒均匀分散于tris-hcl中，得到处理液，接着将处理液加入尿液ⅱ中，垂直混匀仪上颠倒混匀30分钟，室温静置，沉淀完全后弃上清，然后将所得沉淀利用无菌去离子水悬浮起来，静置待完全沉淀后弃上清，重复无菌去离子水悬浮步骤，最后向所得沉淀中加入碳酸氢钠水溶液，80℃处理30分钟，洗脱两次即可；其中，硅胶粉、tris-hcl、尿液ⅱ、无菌去离子水、碳酸氢钠水溶液的
配比为13.33mg：40μl：100μl：1ml：30μl，碳酸氢钠水溶液的浓度为100mm。
20.上述一种大体积尿液的预处理方法在制备尿路上皮癌突变基因qpcr检测试剂盒尿液样本中的应用。
21.本发明的有益效果：
22.本发明可以从大量尿液中进行高效低成本的dna富集，并有效去除血尿中的血红素、尿素等影响后续分子生物学反应的抑制物，从而对富集产物直接进行检测，以达到更快速检测的目的。本发明的检测方法及其检测试剂盒可以从100ml尿液中精确检测5个拷贝的尿路上皮癌相关突变dna分子。
23.尿液预处理：本发明所使用的尿液可以是新鲜血尿，也可以是收集后迅速冷冻的血尿。由于尿液尤其是血尿中含有各种蛋白质及酶类物质，所以首先需要进行蛋白质消化，防止过多的蛋白质影响dna的富集。
24.去除抑制物：血尿中往往含有大量的免疫球蛋白g、血红蛋白、乳铁蛋白、铁离子等，会对后续的qpcr等分子生物学反应产生抑制作用。同时尿液中含有的大量尿素也是分子生物学反应的抑制剂。另外有些血尿样本收集时含有用于稳定样本的抗凝剂如edta等，也会严重影响分子生物学反应。从另一个角度讲，从如此大量的尿液样本中对游离dna进行富集，所附带的抑制物含量也比常规小量尿液时多很多。这些严重影响检测反应的抑制剂其抑制作用都需要通过各种方法消减或去除。同时，为了最大化的提高检测灵敏度，可以将所有富集的dna都用来检测，这就要求抑制剂的含量要更少才不会影响检测。pvp(聚乙烯吡咯烷酮)是一种水溶性聚合物。pvpp是一种高度交联的pvp聚合物。其交联时会吸水，导致聚合物膨胀。随着交联程度的增加，其水溶性会变差。pvp在制酒工业中广泛用于去除多酚类物质，在生物样本处理中也有用于中和酚类物质。本发明人在实验过程中发现其吸附并去除大体积尿液中的抑制剂成分具有非常好的效果。
25.游离dna富集：尿液当中含有的游离dna其因具有磷酸骨架而携带负电荷，本发明中使用带有正电荷的介质将其吸附起来，从而达到从大体积尿液中富集的目的。例如多聚赖氨酸包被的二氧化硅颗粒、包被各种带电基团的磁性颗粒等。二氧化硅颗粒一般是以正硅酸乙酯为原料制备的粒径分布均匀的球形二氧化硅。si-oh末端的二氧化硅颗粒具有亲水性的表面，化学活性，在有机溶剂和水溶液介质中长期稳定。二氧化硅颗粒表面的羟基，可以使多种物质结合到颗粒表面，改善颗粒表面状态，实现对其化学修饰。可以引入不同的有机官能团，如cooh、nh2、nhs、epoxy、ni-nta和c18等，使其表面功能化，也可以共价结合多种生物分子，如streptavidin、avidin和protein a等，提高其生物靶向性，应用于生物分析，生化检测等领域。本发明中优选使用多聚赖氨酸包被的二氧化硅颗粒。
26.qpcr检测：通过荧光pcr法检测tp53基因和tert基因的热点突变。如果对应的热点突变有荧光信号，则指示该份血尿样本中有对应的尿路上皮癌突变基因。
附图说明
27.图1为样本a-s1的qpcr图；
28.图2为样本a-s2的qpcr图；
29.图3为样本a-s3的qpcr图；
30.图4为样本b-s1的qpcr图；
lys)(碧云天，#st509)，加入10ml 100mm tris-hcl(ph＝7.0)，涡旋30分钟。颗粒使用10ml 100mm tris-hcl(ph＝7.0)清洗三次。再补100mm tris-hcl(ph＝7.0)至总体积750μl。4℃保存。
60.②
游离dna富集：
61.将硅胶颗粒重新混匀后取出40μl加入到100μl尿液样本中。垂直混匀仪上颠倒混匀30分钟。取下室温静置，待硅胶颗粒完全沉淀后去除上清。使用1ml无菌去离子水将沉淀颗粒悬浮起来，并转到1.5ml管中。静置待完全沉淀后弃上清；再使用1ml无菌去离子水将沉淀颗粒悬浮起来，静置待完全沉淀后弃上清；加入30μl100mm碳酸氢钠(ph＝11)，80℃30分钟。洗脱两次。
62.将各样本按表1中步骤进行操作，以说明本发明中尿液预处理、去除抑制物及游离dna富集各个步骤的重要性。
63.表1
[0064][0065]
2.qpcr检测
[0066]
每个样本取5μl根据表2进行qpcr反应：
[0067]
表2
[0068]
试剂加入量5
×
buffer a4μl2g robust dna聚合酶0.2μldna样本5μldntp(10mm each)1μl引物tert124-f(100um)1μl引物tert124-r(100um)1μl探针tert124-p(120um)1μl引物tert146-f(100um)1μl引物tert146-r(100um)1μl探针tert146-p(120um)1μl内参基因rp-f(100um)1μl内参基因rp-r(100um)1μl内参基因rp-p(120um)1μl去离子水0.8μl总体积20μl
[0069]
反应条件如表3：
[0070]
表3
lys)(碧云天，#st509)，加入10ml 100mm tris-hcl(ph＝7.0)，涡旋30分钟。颗粒使用10ml 100mm tris-hcl(ph＝7.0)清洗三次。再补100mm tris-hcl(ph＝7.0)至总体积750μl。4℃保存。
[0092]
②
游离dna富集：
[0093]
将硅胶颗粒重新混匀后取出40μl加入到100μl尿液样本中。垂直混匀仪上颠倒混匀30分钟。取下室温静置，待硅胶颗粒完全沉淀后去除上清。使用1ml无菌去离子水将沉淀颗粒悬浮起来，并转到1.5ml管中。静置待完全沉淀后弃上清；再使用1ml无菌去离子水将沉淀颗粒悬浮起来，静置待完全沉淀后弃上清；加入30μl100mm碳酸氢钠(ph＝11)，80℃30分钟。洗脱两次。
[0094]
2.pcr扩增：
[0095]
每个样本取5μl按照表4进行pcr反应：
[0096]
表4
[0097]
试剂加入量5x buffer a4μl2g robust dna聚合酶0.2μldna样本5μldntp(10mm each)1μl引物tert124-f(100um)1μl引物tert124-r(100um)1μl引物tert146-f(100um)1μl引物tert146-r(100um)1μl去离子水5.8μl总体积20μl
[0098]
反应条件如表5：
[0099]
表5
[0100][0101]
实验结果见图7，在该实例中，血尿样本a未掺入突变的tert序列片段，因此没有扩增。血尿样本b掺入了单突变tert(-124)序列片段，该突变会产生70bp的扩增产物。血尿样本c掺入了双突变tert(-124/-146)序列片段，会产生两个扩增产物：tert(-124)序列片段产生70bp的扩增产物，tert(-146)序列片段产生100bp的扩增产物，同时，这两个扩增产物又会结合扩增产生第三个复合扩增产物(153bp)。该复合扩增片段的设计能够帮助更精确地确认样本的具体突变类型。
[0102]
实施例3
[0103]
对84例临床已确诊尿路上皮癌并伴有血尿的样本进行检测。
[0104]
a.尿液预处理：
[0105]
将每份100ml血尿混匀后均分到2个50mlbd管中。冷冻离心机800g离心10分钟，去除沉渣，将上清转移至新的50mlbd管中。加入100μl(20mg/ml)蛋白酶k，水浴锅55℃消化30分钟。每10分钟进行颠倒混匀一次。
[0106]
b.去除抑制物：
[0107]
尿液预处理后的样本放至室温。加入35mg pvpp(ashland，#polyplasdone xl，粒径110-130um)，垂直混匀仪上颠倒混匀30分钟。冷冻离心机1600g离心5分钟。将上清转入新的50mlbd管中。
[0108]
c.游离dna富集：
[0109]
①
准备硅胶颗粒：
[0110]
取250mg silica gel 60n(kanto，#37565-79)，100mg粉末状多聚赖氨酸(poly-lys)(碧云天，#st509)，加入10ml 100mm tris-hcl(ph＝7.0)，涡旋30分钟。颗粒使用10ml 100mm tris-hcl(ph＝7.0)清洗三次。再补100mm tris-hcl(ph＝7.0)至总体积750μl。4℃保存。
[0111]
②
游离dna富集：
[0112]
将硅胶颗粒重新混匀后取出40μl加入到100μl尿液样本中。垂直混匀仪上颠倒混匀30分钟。取下室温静置，待硅胶颗粒完全沉淀后去除上清。使用1ml无菌去离子水将沉淀颗粒悬浮起来，并转到1.5ml管中。静置待完全沉淀后弃上清；再使用1ml无菌去离子水将沉淀颗粒悬浮起来，静置待完全沉淀后弃上清；加入30μl100mm碳酸氢钠(ph＝11),80℃30分钟。洗脱两次。
[0113]
2.qpcr
[0114]
引物、探针、反应试剂、反应条件参见实施例1。
[0115]
实验结果见表6：
[0116]
表6
[0117][0118]
本实施例中，本发明对84例尿路上皮癌进行检测，检测的准确度约为77％。
[0119]
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。