一种热休克蛋白在制备抗胶质瘤药物中的应用及制备方法

1.本发明属于医药技术领域，具体地涉及一种具有抑制脑胶质瘤细胞增殖，延缓脑胶质瘤生长过程的多肽或其衍生物在治疗胶质瘤的潜在医学应用及其制备。


背景技术：

2.胶质瘤是成年人颅内最常见、致死率最高的原发性恶性肿瘤，在颅内肿瘤中发病率高达40％～50％。占所有中枢神经系统肿瘤的比例将近28％，占恶性肿瘤的80％左右。胶质瘤起源于胶质细胞，是中枢神经系统极具侵袭性和致命性的肿瘤。据病理特征可分为四级，其中whoⅲ级及whoⅳ级肿瘤因存在更多细胞间变和核异型，微血管增殖及坏死，将其统称为高级别胶质瘤。胶质瘤包括星形细胞瘤、少突胶质母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤，具有细胞迁移和扩散迅速、侵袭正常邻近组织、持续增殖能力和异质性，使得大多数高级别胶质瘤患者的总体生存期约为15个月，本病起病隐匿，进展缓慢，可发生于任何年龄。脑胶质瘤主要临床表现为癫痫、颅压增高所致的头痛、呕吐、视盘水肿症状，以及肢体偏瘫偏身感觉障碍等局灶性神经功能障碍。
3.胶质细胞是广泛存在于中枢神经系统和周围神经系统的支持细胞。中枢神经系统包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞；周围神经系统包括施万细胞、卫星细胞。由胶质细胞发生的肿瘤，称为胶质瘤细胞，胶质瘤，是发生于神经外胚层的肿瘤。
4.肿瘤依靠氧化磷酸化来提供其持续增长所需的大量atp。线粒体功能障碍是由于氧气和底物的供应减少导致atp生成受损和呼吸链结构改变，抑制细胞的增殖、迁移、侵袭，最终导致肿瘤细胞凋亡和坏死。
5.由于胶质瘤发生部位的特殊性(常发生于颅内深部和大脑功能区)以及胶质瘤细胞的侵袭性(可浸润到周围组织，导致与周围正常组织结构分界清)，目前对胶质瘤的研究以及治疗都存在一定难度。目前对脑瘤缺乏有效治疗手段：手术切除不仅难度高、副作用大，而且容易复发；血脑屏障的存在使大多数化疗药物难以到达脑病变部位而发挥有效作用；脑肿瘤大多对放疗不敏感。因此，探索新的脑瘤诊疗手段、有效改善患者生命质量成为神经科学领域基础研究工作者和临床医生亟需解决的医学难题之一。加强脑胶质瘤的基础研究，深入阐明其发生、发展及转移的分子机制机制，寻找具有关键作用的治疗靶点。在胶质瘤的综合治疗中急需寻找具有关键作用的治疗靶点对一种新型的生物学分子治疗手段来抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭，对改进脑胶质瘤的治疗现状具有重要的理论和实践意义。
6.人类的hsp22是一种分子量是21.6kda小热休克蛋白，也被称为hspb8、h11激酶和e2ig1，由位于12q24.23的基因编码。这种小热休克蛋白由196个氨基酸组成，等电点是4.7，是已发现的十种哺乳动物小热休克蛋白中等电点最低的一种。于shsp亚家族成员。虽然hsp22和其他小热休克蛋白具有同源性,也有标志性的
‘
α-晶体结构域’，但是它以单体的形式存在。在体外hsp22主要被蛋白激酶c和p44mapk磷酸化。hsp22不仅有分子伴侣的作用还有激酶活性、促凋亡或抗凋亡的作用，在延长生物体的寿命、抗缺血再灌注损伤、肿瘤和神
经系统疾病变等很多方面发挥着重要作用。
7.热休克蛋白22/h11激酶(hsp22)是一种应激诱导型蛋白，可对包括缺血在内的各种肿瘤微环境变化应激条件作出反应。在发现hsp22通过诱导可诱导的一氧化氮合酶(inos)的同工型，对抑制肿瘤具有强大的作用。本技术人在先前研究表明hsp22位于线粒体以及核和胞质组分中。这些观察结果支持hsp22的线粒体定位可能同时减少肝癌细胞存活和氧化代谢。在先前的小鼠肝癌模型中有很好的治疗作用。在新的研究中，我们采用胶质瘤细胞注射的方式建立裸鼠的胶质瘤模型，在给予hsp22后胶质瘤形成的瘤子体积明显减少。目前尚无有关通过hsp22来缓解胶质瘤病变过程的相关报道。hsp22有望成为胶质瘤症状缓解、改善和治疗的新药物选择。


技术实现要素：

8.本发明的目的针对目前对胶质瘤的研究以及治疗都存在一定难度，针对脑瘤缺乏有效治疗手段的现状，提供一种具有靶向抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤恶化、治疗胶质瘤活性的多肽或其衍生物，该多肽可以用于制备延脑胶质瘤发生、发展过程的药物。
9.本发明的发明人经过深入的研究和反复的试验发现，获得了具有靶向抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤恶化、治疗胶质瘤活性的热休克蛋白22(其氨基酸序列如序列表seq id no.1所示)。
10.热休克蛋白22，它还被命名为h11激酶和e2igig。hsp22的两端为氨基末端和羧基末端，其中氨基末端区域含有α螺旋结构，主要与分子伴侣活性和影响低聚物的结构有关。其羧基末端主要是具有保湿结构的α-晶体结构域，含有6-7个β片层结构，但是位于核心区域表面的ser-76、asn-78、lys-82和his-83等活性b3序列并不具有保守型，也被认为与分子伴侣活性相关联，整个α晶体结构与未见β2片段。
11.本发明的发明人经过深入的研究和反复的试验发现，热休克蛋白22的生物稳定性和特定位置氨基酸残基有关。如热休克蛋白22特定位置的氨基酸残基替换为侧链可以相连的非天然氨基酸，如s-戊烯丙氨酸(s5)，则改造后的多肽具有稳定的α螺旋的二级结构，使改造后的多肽具有极高的亲和力、抗酶解稳定性，从而具有极高的α螺旋稳定性、代谢稳定性，能够抑制多种肿瘤细胞增殖和转移，从而应用于制备治疗胶质瘤的药物中。
12.本发明提供的技术方案之一是一种用于靶向抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤恶化、治疗胶质瘤的热休克蛋白22或所述热休克蛋白22的衍生物，其中所述热休克蛋白22的氨基酸序列为：a.如序列表seq id no.1所示，或者，b.如将序列表seq id no.1所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸所示，或c.在a.中的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或几个氨基酸后形成的仍然具有靶向抑制胶质瘤细胞活性的多肽。。
13.本发明中，所述的氨基酸序列如序列seq id no.1所示的多肽称为热休克蛋白22。
14.本发明中，所述的抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤恶化、治疗胶质瘤的多肽的氨基酸序列也可以是将序列表seq id no.1所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸所示。
15.其中，所述的侧链可相连的非天然氨基酸是本领域常规的，较佳的为s-戊烯丙氨
酸(s5)、r-戊烯丙氨酸(r5)或者r-辛烯丙氨酸(r8)。
16.较佳的，所述的侧链可相连的非天然氨基酸的侧链进行反应，环化形成侧链相连的结构。更佳的，相邻非天然氨基酸的侧链在钌的催化作用下进行烯烃复分解反应(rcm)环化即得。
[0017][0018]
其中，所述替换的氨基酸的数目为两个。所述替换的氨基酸的分别为序列表seq id no.1所示的氨基酸序列的第i位和第i 3位的氨基酸、第i位和第i 4位的氨基酸，或者，第i位和第i 7位的氨基酸；其中，i为整数，且1≤i≤11。
[0019]
较佳的，所述第i位替换成的非天然氨基酸为r-戊烯丙氨酸、s-戊烯丙氨酸或者r-辛烯丙氨酸，所述第i 3、i 4或i 7位替换成的非天然氨基酸为s-戊烯丙氨酸。
[0020]
在一些实施方式中，所述的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。
[0021]
其中，本发明所述的细胞穿膜肽为本领域常规的细胞穿膜肽，其能辅助将所述多肽送入细胞以发挥作用。一般，所述的细胞穿膜肽为由10～30个氨基酸组成的短肽分子。在一些实施方式中，所述细胞穿膜肽连接在所述多肽的n端或者c端，在一些实施方式中所述细胞穿膜肽连接在所述多肽的n端；在一些实施方式中所述细胞穿膜肽和本发明多肽ej4之间以两个甘氨酸(gly-gly)连接。
[0022]
在一些实施方式中，所述细胞穿膜肽为如序列表seq id no.3所示的t a t肽(peptide)，所形成的嵌合多肽即本发明的多肽衍生物的氨基酸序列如seq id no.4所示。
[0023]
本发明中，上述seq id no.1所示的氨基酸序列中可进行适当地氨基酸替换、缺失或添加，只要使改造后的氨基酸序列仍然具有抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤恶化、治疗胶质瘤活性即可。例如，第8氨基酸可突变为精氨酸(arg)；较佳地，其氨基酸序列如序列表seq id no.5所示。
[0024]
本发明提供的技术方案之二是：一种抗胶质瘤的药物组合物，其含有本发明第一方面所述的靶向抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤的恶化、治疗胶质瘤的热休克蛋白22或所述热休克蛋白22的衍生物，还包括一种或多种药用载体。
[0025]
其中，所述靶向抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤的恶化、治疗胶质瘤的热休克蛋白22或所述热休克蛋白22的衍生物作为单一活性成分；或者，其含有技术方案一所述的靶向抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、缓解和改善胶质瘤的恶化、治疗胶质瘤的热休克蛋白22或所述热休克蛋白22的衍生物和其他具有抗胶质瘤活性的化合物一起作为活性成分。
[0026]
在一些实施方式中，所述组合物为片剂。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂、湿润剂、粘合剂、崩解剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的具有上述抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、缓解和改善胶质瘤的恶化、治疗胶质瘤的多肽或所述多肽的衍生物，和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
[0027]
在一些实施方式中，所述吸收剂与填充剂选用淀粉、糊精、蔗糖粉、微晶纤维素、糖醇类中的一种。
[0028]
在一些实施方式中，所述湿润剂与粘合剂选用水、乙醇、淀粉浆、糊精、淀粉蔗糖混合浆、纤维素衍生物、聚维酮(pvp)、peg4000、明胶浆、阿拉伯胶浆中的一中。
[0029]
在一些实施方式中，所述崩解剂选用纤维素类、淀粉衍生物中的一种。
[0030]
在一些实施方式中，湿润剂与粘合剂为30％～70％的水。
[0031]
在一些实施方式中，湿润剂与粘合剂为2％～10％的的丙基纤维素。
[0032]
在一些实施方式中，崩解剂为纤维素类如微晶纤维素(mcc，5％～20％)，交联羧甲基纤维素钠(ccna,5％～10％)，低取代羟丙基纤维素(l-hpc，2％～5％)等。
[0033]
在一些实施方式中，所述吸收剂与稀释剂是玉米淀粉60％～80％的淀粉。
[0034]
在一些实施方式中，所述稀释剂是玉米淀粉40％的乳糖。
[0035]
本发明所述的药物组合物的给药途径是常规的多肽药物给药途径，较佳地为注射给药或口服给药。
[0036]
在一些实施方式中，所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体注射剂或输注剂等。
[0037]
在一些实施方式中，所述组合物的给药为口服给药。
[0038]
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。
[0039]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0040]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0041]
本发明提供的技术方案之三是：技术方案之一所述的靶向抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤恶化、治疗胶质瘤的多肽或其衍生物和技术方案之二所述的药物组合物在制备靶向抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤恶化、治疗胶质瘤的药物中的应用。
[0042]
本发明中，所述神经胶质瘤可为本领域常规，较佳的为星形细胞瘤、胶质母细胞
瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质瘤、松果体瘤、少突-星形混合性胶质瘤、脉络丛乳头状瘤、未分类胶质瘤或神经元性肿瘤，所述胶质瘤的组织形态包括核异质型、有丝分裂型、微血管富集型以及坏死型。
[0043]
靶向抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤的恶化、治疗胶质瘤
[0044]
本发明中，所述增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤的恶化，是本领域常规的，较佳地指在存在可能的胶质瘤因素时，使用后防止或降低恶性胶质瘤的产生，也指存在肿瘤病灶时，减轻肿瘤的程度，或者治愈肿瘤使之正常化，或者减缓或延迟肿瘤的进程，或者减轻肿瘤引起的症状。
[0045]
本发明提供的技术方案之四是技术方案之一所述的热休克蛋白22的剂型制备方法，其中，所述剂型为蛋白冻干剂，所述制备方法包括基因工程方法和化学合成方法。
[0046]
在一实施方式中，所述热休克蛋白22的剂型制备方法为基因工程方法，包括步骤：
[0047]
(1)根据seq id no.2合成hsp22蛋白的基因序列，插入空白载体到构建表达载体；
[0048]
(2)将(1)所得表达载体导入宿主细胞，将导入22蛋白的基因序列的重组细胞涂布平板培养；
[0049]
(3)挑单菌落抗性液体诱导培养；
[0050]
(4)离心收集含目标蛋白的培养物，破碎细胞；再次离心分别收集沉淀和上清；
[0051]
(5)将离心后的上清过柱层析柱子纯化；
[0052]
(6)分步收集不同组分并电泳检测后含目的蛋白的组分混合在一起；
[0053]
在一实施方式中，所述空白载体为质粒。
[0054]
在一实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞。
[0055]
在一实施方式中，所述宿主细胞为真核细胞。
[0056]
在一实施方式中，所述宿主细胞为植物细胞。
[0057]
在一实施方式中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
[0058]
在一实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0059]
在本发明技术方案四中，所述热激酶蛋白hsp22为按常规药剂学制备成用于注射的蛋白冻干剂。
[0060]
在一实施方式中，所述步骤(6)之后还有步骤(7)各组分去除盐分及杂蛋白，冻干，得粉末，保存。
[0061]
其中，所述蛋白冻干剂在临床治疗中的使用方法为用纯水溶解后注射受试动物或人受试者。
[0062]
在一实施方式中，所述蛋白冻干剂用于临床前动物实验治疗的配制浓度为15～26mg/ml，所述蛋白冻干剂注射裸鼠的浓度为3～5.5mg/kg。
[0063]
在一实施例中，所述蛋白冻干剂的配制浓度为22mg/ml，所述蛋白冻干剂注射裸鼠的浓度为3.7mg/kg。
[0064]
在一实施例中，所述蛋白冻干剂的配制浓度为16mg/ml，所述蛋白冻干剂注射裸鼠的浓度为4.5mg/kg。
[0065]
在一实施例中，所述蛋白冻干剂的配制浓度为20mg/ml，所述蛋白冻干剂注射裸鼠的浓度为4mg/kg。
[0066]
配制所述蛋白冻干剂注射液的溶剂包括水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲亚砜，乙酸乙酯，乙酸和氨基乙醇。
[0067]
本发明经裸鼠脑胶质瘤细胞种植实验检测，结果表明，如seq id no:1所示的多肽分子能延缓皮下种植的脑胶质瘤细胞的发育。
[0068]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0069]
本发明所用试剂和原料均市售可得
[0070]
本发明的积极进步效果在于：本发明的hsp22蛋白或或其衍生物能够靶向抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、促进胶质瘤细胞凋亡、缓解和改善胶质瘤恶化、治疗胶质瘤的，从而应用于抗胶质瘤的药物的制备中。所制备的药物在抗胶质瘤中，具有疗效显著的优点。
附图说明
[0071]
图1为本发明蛋白质抗胶质瘤作用的统计图。(注：**出现显著差异)*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
[0072]
图2未使用本发明蛋白质的裸鼠脑胶质瘤成瘤裸鼠对照组的mri成像图
[0073]
图3为本发明蛋白质对裸鼠脑胶质瘤作用的成瘤裸鼠的mri成像图
具体实施方式
[0074]
现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
[0075]
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0076]
实施例1 hsp22蛋白冻干剂的制备
[0077]
(一)hsp22蛋白表达制粒构建
[0078]
1.hsp22蛋白的基因序列(如seq id no.2所示)合成并插入到pet28a载体中成功构建表达质粒；
[0079]
(二)hsp 22蛋白工程菌的构建
[0080]
1、将表达载体导入大肠杆菌中，挑取单菌落于10ml lb培养基
[0081]
(卡那抗性)中，37℃250rpm,过夜；
[0082]
(三)hsp22蛋白的诱导生产
[0083]
1)转接1％过夜菌于1000ml lb培养基(卡那抗性)中，37℃250rpm，3小时，然后加入0.5mm iptg 20℃诱导12小时。
[0084]
2)离心收集1000ml表达目标蛋白(如seq id no.1所示)的大肠杆菌培养物，超声(300w，超声10秒，间隙10秒，次数30次)破菌于100ml破菌缓冲液(50mm pbs，ph 7.4，0.15m nacl)中，离心后分别收集沉淀和上清；
[0085]
3)取离心后的上清用pbs溶解，上样于预先平衡好的nta纯化柱(1ml nta介质，10倍柱体积nta-0缓冲液平衡)；
[0086]
4)样品上样完成以后，使用nta-0缓冲液洗柱10个柱体积；
[0087]
5)顺序使用nta-x缓冲液(50mm pbs，ph 7.4，0.15m nacl，x mm咪唑为10/20/50/100/200/500mm不同咪唑浓度)各洗柱1个柱体积；
[0088]
6)分步收集不同组分并电泳检测，最终将含目的蛋白的组分混合在一起
[0089]
7)将各组分用pbs透析去除盐分及杂蛋白，得到的蛋白液体冻干成粉末保存。
[0090]
实施例2.包含实施例1所得hsp22蛋白的药用组合物制剂的制备
[0091]
(一)包含实施例1所得hsp22蛋白的片剂配方
[0092][0093][0094]
实施例3.包含实施例1所得hsp22蛋白的药用组合物制剂的制备
[0095]
用途组分含量有效成分hsp22蛋白20％吸收剂与稀释剂乳糖60％湿润剂与粘合剂聚维酮10％崩解剂微晶纤维素(mcc)，10％
[0096]
(二)包含实施例1所得hsp22蛋白的片剂的制备方法
[0097]
实施例4 包含实施例1所得hsp22蛋白的氨基酸序列和tat肽构成的衍生物的制备
[0098]
hsp22蛋白的氨基酸序列参见序列表seq id no.1，由北京赛百盛基因技术有限公司合成并纯化。
[0099]
引入两个非天然氨基酸进行固相多肽链合成。固相多肽链合成完成后采用钌作为催化剂进行烯烃复分解反应(rcm)环化即得目标多肽。最后将目标多肽从树脂上切割下来进行纯化。上述固相多肽链合成及纯化的步骤由中肽生化有限公司公司完成。其中，两个s-戊烯丙氨酸(s5)插入在hsp22氨基酸序列中的第i、i 4位，r-戊烯丙氨酸(r5)和s5分别插入在多肽ej4的第i、i 3位；r-辛烯丙氨酸(r8)和s5分别插入在多肽ej4的第i、i 7位。
[0100]
其中一替换氨基酸的hsp22蛋白与细胞穿模肽tat-肽(氨基酸序列见序列表seq id no.3)通过甘氨酸链接形成的嵌合肽如seq id no.4所示。
[0101]
实施例5实施例1所得的hsp22蛋白用于治疗胶质瘤的动物实验
[0102]
(一)胶质瘤细胞的制备
[0103]
人脑胶质瘤细胞u87-mg细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)复苏后分装于直径为10cm的培养血中，加入适量含10％胎牛血清的mem培养液,置于37℃，5％co2的恒温恒湿培养箱中培养。在细胞处于对数生长期大约80％时,使用1mlpbs清洗细胞3次，弃去pbs后以2.5g/l的胰酶消化，加入等量的mem终止消化，收集消化液后离心5min(1500rp/min)并除去上清液，以不含血清的mem液吹打后，以mem液制成浓度为10*7个/ml的细胞悬液。置于碎冰上备用。
[0104]
(二)裸鼠胶质瘤模型的制备
[0105]
1.瘤细胞悬液接种法
[0106]
选取balb/c裸鼠，雄性，鼠龄5～6周，体重15～20g,，将裸鼠称重后采取4％水合氯醛腹腔注射麻醉，用量约为0.1ml/10g。俯卧位将其头部固定在脑立体定向仪上。用碘伏消毒头顶部皮肤后，先于颅中线处眼裂后开个约1-2cm垂直切口，充分暴露出手术区，寻找进针点，进针点为前囟前0.5mm，旁开2mm用5ml注射器针头从进针点钻孔。用25ul微量注射器抽取5ul放置在冰上的鼠胶质瘤u87-mg细胞悬浮液，沿预先钻好的骨孔，用立体定位仪固定注射器，将其进针到硬脑膜下3.3mm时，注意需要缓慢并且垂直进针，按速度为1μl/min将其悬液注射入裸鼠的脑实质中，注射完后不要立即拔针，需要停留10min，再拔针。用5号带针缝线缝合头部手术切口并消毒手术区。
[0107]
2.裸鼠接种后饲养，裸鼠接种肿瘤麻醉苏醒后，将其置恒温(25c 2℃)、恒湿(45％～50％)、无菌净化屏障系统内饲养，定期观察裸鼠精神、饮食和排便。
[0108]
(三)实验结果
[0109]
1.肿瘤生长曲线细胞悬液接种法，需待细胞增殖达到到一定数量，才能观察到肿瘤，因此肿瘤的出现有一个潜伏期，且随肿瘤的类型、注射量不同而不同。本实验中肿瘤的潜伏期为两周(14天)，故在本实验开始的第二周肿瘤的体积开始增长，由(图1)得知肿瘤的体积在第二周之后有一个明显的增长，在第四周和第六周之间治疗组肿瘤体积出现了明显的减少。
[0110]
2.本实验中利用mri图像判断颅内注射肿瘤细胞的造模成功情况，并且判断药物的治疗情况。对照组中只注射肿瘤细胞，未加任何干预措施(图2a-f)。体外给与肿瘤细胞注射后三天后可见注射部位肿瘤横切面积增大(面积s＝a*b),胶质瘤形成形状不规则，故表现出横切面积大小差异(图2a)，胶质瘤形成后向脑部伸出延伸呈现多层次。注射胶质瘤三周后mri检查成瘤后注射上述实施例1中纯化获得序列为seq id n0.1的hsp22蛋白冻干剂加纯水配制成的注射剂，注射胶质瘤部位胶质瘤体积出现减小的趋势(图3)。
[0111]
实施例6流式细胞术检测多肽穿膜能力
[0112]
流式细胞术检测多肽穿过细胞膜的能力。具体操作步骤如下：
[0113]
1.收集对数生长期的人脑胶质瘤细胞u87-mg细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，用1640培养基(购自美国invitrogen公司)调整细胞浓度，制成20万个/ml的细胞悬液。
[0114]
2.将1ml步骤1所制得的细胞悬液加入6孔板进行培养，12小时后换成新的培养基，并且分别加入1μg/ml实施例1所制得的fam荧光基团标记的hsp22蛋白、tat肽-hsp22。
[0115]
3.6小时后，用胰酶消化制备成单细胞悬液，冷pbs重悬细胞。
[0116]
4.运用流式细胞计数仪，激发波长为465nm，发射波长为520nm，测定细胞内荧光的强弱，计算含荧光细胞占总细胞的百分比。结果如表2所示，含荧光细胞占总细胞百分比越高，说明多肽能穿过的细胞数越多，即多肽的穿膜能力越好。
[0117]
表2说明，给予tat肽-hsp22处理后，含荧光的细胞比例明显多于hsp22，因此tat肽-hsp22的穿膜能力明显优于hsp22.
[0118]
多肽名称含荧光细胞比例hsp221.2
tat肽-hsp2248
[0119]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
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