一种快速检测ROS1基因重排探针、FISH试剂盒及方法与流程

no.17 所示，第二组sgrna包括17条sgrna，第二组sgrna在ros1基因上的靶向位点序列如序列表seq id no.18
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seq id no.34 所示。
7.进一步的，第一组sgrna针对ros1基因断裂点上游设计，第二组sgrna针对ros1基因断裂点下游设计。
8.进一步的，绿色荧光染料为halotag
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alexa fluor
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488，红色荧光染料为janelia fluor
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646。
9.进一步的，绿色荧光染料标记的dcas9蛋白与第一组sgrna结合后组成第一组探针；红色荧光染料标记的dcas9蛋白与第二组sgrna结合后组成第二组探针；其中dcas9蛋白与sgrna组装的摩尔比例为1:1-1:4。
10.本发明的另一目的在于提供一种快速检测ros1基因重排fish试剂盒，该试剂盒可快速检测ros1基因重排，且特异性和准确性高。
11.本发明快速检测ros1基因重排fish试剂盒包括第一组探针和第二组探针，还包括bloking/reacting buffer 、复染液和对照dcas9蛋白。
12.本发明的另一目的在于提供一种快速检测ros1基因重排的方法。
13.利用上述的快速检测ros1基因重排fish试剂盒进行检测，包括以下步骤：（1）洗涤：pbst摇晃洗涤样品5min；（2）bloking/reacting buffer 37℃孵育样品15min；（3）将探针加入样品中，37℃孵育15min，其中对照组仅加入dcas9蛋白，sgrna用bloking/reacting buffer代替；（4）pbst洗涤样品，3次，每次5min；（5）dapi复染样品，室温，5min，洗涤，封片；（6）在荧光显微镜下观察采集图像。
14.本发明的有益效果在于：本发明dcas9蛋白介导的fish方法具有快速、经济、操作方便等优点：（1）传统fish操作需要加热和甲酰胺处理使得双链dna变性进行杂交，该方法需要数小时或更长时间。本发明dcas9蛋白介导的fish技术利用crispr系统进行dna快速杂交，本方法在优化的条件下仅需要约1小时；同时本发明sgrna-dcas9酶探针比核酸探针准确性更高，特异性更好、假阳性低等优点。
15.（2）本发明dcas9蛋白介导的fish技术操作条件温和(室温37
°
c)，因此可以更好地维持细胞形态和dna结构。
16.（3）传统fish每条探针均需要荧光标记，操作繁琐，成本高；而本发明dcas9蛋白介导的fish技术操作简便，成本低：一个标记荧光染料的dcas9蛋白（标记染料可变）可以与ros1基因断裂两端设计未标记的多条sgrna灵活组装。
17.附图说明
18.图1 ros1基因sgrna设计示意图图2 ros1基因重排检测
具体实施方式
19.为了充分了解本发明的目的、特征及功效，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围不局限于下面的实施例。
20.实施例 1一、探针准备1、 dcas9蛋白的表达和纯化将质粒pet302-6his-dcas9-halo（addgene，72269）转化入e. coli bl21 (de3)，进行原核表达并纯化蛋白。其中his tag利于蛋白纯化；halo tag用于荧光对蛋白的标记，具体操作如下：（1）质粒转化bl21（de3）感受态细胞，涂板后37℃倒置培养过夜；（2）选取单克隆于5ml lb培养液37℃培养过夜；（3）次日1:50接种到新lb培养基扩大培养至1l，至菌体od600为0.6-0.8，加入iptg至终浓度为1 mm，16
°
c培养16h后离心，收集菌体；（4）根据takara ni his标签纯化柱protocol洗脱并收集蛋白；（5）将洗脱蛋白透析至buffer[50 mm hepes (ph 7.5), 100 mm kcl, 1 mm tcep]中，并用50,000-mwco超滤管（millipore）超滤后收集纯化蛋白；（6）将已纯化蛋白加入甘油（含量20%），-80
°
c储存，备用。
[0021] 2、dcas9蛋白荧光标记将染料（halotag
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alexa fluor
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488和janelia fluor
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646，promega）按照以下步骤将1中备用dcas9蛋白进行标记：（1）染料：蛋白样品按照如下体系混匀后室温孵育30min，随后4
°
c孵育过夜，体系为lysate 20ul，ligand(50um) 1ul，1
×
50mm hepes(ph7.5）9ul，共30ul；（2） 50,000-mwco超滤管（millipore）超滤除去未结合的染料；（3）用buffer[50 mm hepes (ph 7.5), 100 mm kcl, 1 mm tcep，10%甘油]洗脱蛋白，分装，-80
°
c储存，备用。
[0022] 3、 sgrna合成3.1 sgrna核心序列设计ros1 基因位于6号染色体上，ros1基因重排的断裂点常见于 32-36号外显子，根据其基因的特点，利用麻省理工大学张锋教授实验室提供的在线网站（http : //crispr.mit.edu /）分析可能的 sgrna位点（pam 序列为ngg），分别设计两组sgrna （图1）：针对断裂点上游设计17条sgrna，即第一组sgrna，其在ros1基因上的靶向位点序列为seq id no.1
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seq id no.17（表1）；针对断裂点下游设计17条sgrna，即第二组sgrna，其在ros1基因上的靶向位点序列为seq id no.18-seq id no.34（表1）。第一组sgrna与halotag
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alexa fluor
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488标记的dcas9蛋白结合后组成第一组探针，第二组sgrna与janelia fluor
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646标记的dcas9蛋白结合后组成第二组探针。根据crispr-cas9原理，将已标记的dcas9蛋白与sgrna组装后进行特异性识别杂交染色体中ros1目标检测片段。
[0023]
表1 seqidno.序列1tgtttgaccaagcttaccgc
2ctgacacccttgtgatttac3gtctgggcagaccaccaact4tagaggcccaatatctaaag5ccctttcttactgtacatag6attaagctaaatgtctcagc7tcttgatggtttggaatgtt8tcagagctccttgaaatgtc9aagatatggcaatttgtcag10ccctgtagagtttcataaaa11ggtcacatcatttcattaaa12acttgttggcttctgacaaa13ctgtctccttcattatctgg14aaatagaactgctgatgtca15agctaagatgtctgagagtt16tattagttttctattcagta17gaggttcacagtaaatatta18tcacatcttcattcgggcca19gtggtcatataactcggtga20gcagagcaagtagtctatag21taaaacttcttacccatacc22cttctactagcaataacagg23tccgttaagtcatgtcattt24ggtgtgagatgtacatgttc25gtaatatctaccctgaaagc26aaaaactgctgaggcgggaa27tttgatcaattgcttgggac28ctgtgagctcagtgggttaa29ttggcctaaacaacaaaact30gctttcgatttatttcttgg31tcatcagatgtgcctccttc32ttcatctaaatgtgtgataa33ttgagagaactctctcttac34tcacatcttcattcgggcca35taatacgactcactatagg36gcaccgactcggtgcc3.2 sgrna序列合成（1）通用生物合成sgrna核心序列和骨架序列，sgrna序列连入puc57-simple质粒；（2）模板制备：将带有目标序列的质粒pcr后获得模板；操作如下：
上游引物：taatacgactcactatagg（seq id no.35）下游引物：gcaccgactcggtgcc（seq id no.36）反应体系如下：质粒模板1ul上游引物1ul下游引物1ul2
×
pcrmix25ulh2oto50ul每个sgrna序列反应5管，每管50ul，共计250ul。充分混匀放置pcr进行反应，设计程序如下：95℃ 5min；95℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 30sec，共进行35个循环。
[0024]
3.3 t7体外转录操作过程中采用无rna酶的吸头及离心管操作，并注意避免rna酶污染。
[0025]
3.3.1模板纯化（1）将250μl扩增产物收集到1个1.5ml微量离心管。加入250μl酚氯仿异戊醇，混匀。静置3-5min；（2）4℃ 12000rpm 离心5min；（3）小心吸取_上层液体到新管，加入3m naac25μl,冰乙醇500μl。混匀，冰上放置5-10min；（4）4℃ 12000rpm离心10min；（5）弃上清，加入1ml 70%乙醇，震荡洗涤沉淀；（6）4℃ 12000rpm离心5min；（7）用移液器尽量吸净液滴，室温放置2-3min,挥发残留乙醇；（8）加入10μl无rna酶水，轻弹管壁溶解沉淀；（9）定量dna,冻存到-20℃备用。
[0026]
3.3.2 体外转录试剂盒t7 transcription kit（thermo fisher，am1322）体外转录（1）配制体系为：5
×
transcriptaid reaction buffer 4ul，atp/ctp/gtp/utp mix* 8ul，template dna 1ug**，transcriptaid enzyme mix 2ul，depc-treated water to 20ul；共20ul；（2）充分混匀，37℃反应4h。
[0027]
3.4转录产物纯化3.4.1去除模板dna操作如下：（1）添加2 u dnasei（rnase-free）混匀后37
°
c孵育15min；（2）然后加入2
µ
l 0.5m edta（ ph值8.0）混匀后65
°
c孵育10min终止反应。
[0028]
3.4.2 rna纯化（1）向反应混合物中加入115 ul depc水，15 ul 3 m醋酸钠溶液（ph 5.2）。充分混匀；（2）取等量苯酚(ph 4.7)/氯仿混合物（1:1体积配制），充分混匀，12000rpm离心收集上层液体，并转移到新的ep管中。再按等量氯仿以相同方法萃取两次；
（3）加入2倍体积的无水乙醇沉淀rna。-20℃孵育30分钟，4℃,12000rpm离心10min，收集沉淀；（4）用500 ul 70%的预冷乙醇充分震荡洗涤沉淀1min，4℃,12000rpm离心5min，尽量吸尽乙醇，打开管盖，室温放置2-3min挥发残留乙醇；（5）加入30ul depc水溶解沉淀，定量；（6）将纯化的rna储存于-20℃或-80℃。
[0029]
二、探针组装探针组装：绿色荧光染料标记的dcas9蛋白与第一组17条sgrna结合后组成第一组探针，红色荧光染料标记的dcas9蛋白与第二组172条sgrna结合后组成第二组探针；其中dcas9蛋白:sgrna摩尔比例为1：1-1:4，在bloking/reacting buffer中室温孵育10min后置于冰上。
[0030]
实施例2 ros1基因重排检测对人肺癌细胞（a549）ros1基因重排进行检测，首先制备a549爬片，并按照以下步骤进行检测：（1）洗涤：pbst摇晃洗涤样品5min；（2）bloking/reacting buffer 37℃孵育样品15min；（3）将探针加入样品中，37℃孵育15min，其中对照组仅加入dcas9蛋白，sgrna用bloking/reacting buffer代替；（4）pbst洗涤样品，3次，每次5min；（5）dapi复染样品，室温，5min，洗涤，封片；（6）在荧光显微镜下观察采集图像（图2）。
[0031]
实验结果：结果见图2，图2d中三角形所指为融合信号，箭头所指为断裂信号；而阴性对照组则没有特异性的标记点（图2d）。结果表明：本发明探针准确性高，特异性好；同时本发明快速检测ros1基因重排fish试剂盒，可快速检测ros1基因重排，且特异性和准确性高。