一种鹿茸干细胞体外扩增培养体系及其方法与流程

1.本发明涉及干细胞体外扩增培养技术领域，尤其涉及一种鹿茸干细胞体外扩增培养体系及其方法。


背景技术：

2.鹿茸是哺乳动物中罕见的能够周期性完全再生的器官，是研究哺乳动物器官再生的绝好模型。而鹿茸的周期性再生是一个基于干细胞的过程，鹿茸干细胞(asc)存在于生茸区骨膜(ap)与角柄骨膜(pp)中。鹿茸干细胞不像胚胎干细胞那样嵌合到整个宿主的组织中，也不像间充质干细胞那样完全消失，而是有限地嵌合到一些组织中，特别是嵌合到了生殖系统中。对再生医学有着重要意义。因此如何高效的对鹿茸干细胞体外扩增培养成为当前需要解决的问题。


技术实现要素：

3.针对背景技术中存在的问题，提出一种鹿茸干细胞体外扩增培养体系及其方法。本发明中的一种鹿茸干细胞体外扩增培养体系以无血清培养基为基础培养基，更利于干细胞生长，便于纯化和下游加工，也可以消除来自血清的不均一性，避免病毒污染造成的危害。添加叶酸，使其刺激干细胞增殖。细胞生长因子促进干细胞的分裂、繁殖和分化。l-谷氨酰胺是培养杆细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢。二巯基乙醇作为一种强还原剂，可以中和干细胞培养基中积累的氧自由基，使得细胞分裂到很高的密度而不死亡，从而便于进行细胞增殖。青霉素、链霉素利于控制、消除细胞培养过程中的污染。本发明中的鹿茸干细胞体外扩增培养方法操作简单、易行，能高效实现鹿茸干细胞的体外扩增培养，对再生医学有着重要意义。
4.本发明提出一种鹿茸干细胞体外扩增培养体系，包括无血清培养基、细胞生长因子、血清替代物、叶酸、l-谷氨酰胺、二巯基乙醇、青霉素、链霉素和非必须氨基酸。
5.优选的，细胞生长因子为10ng/ml的il-3和100ng/ml的il-6。
6.优选的，无血清培养基为dmem培养基，含量为培养体系的80％-95％。
7.优选的，鹿茸干细胞来自生茸区骨膜与角柄骨膜中。
8.优选的，叶酸含量为培养体系的0.1％-0.5％；l-谷氨酰胺含量为培养体系的0.5％-2％；血清替代物含量为培养体系的5％-8％；二巯基乙醇为培养体系的0.1％-0.5％；非必须氨基酸为培养体系的0.1％-0.5％。
9.优选的，青霉素和链霉素均为100u/ml。
10.本发明又提出一种鹿茸干细胞体外扩增培养方法，即将鹿茸干细胞接种至上述的培养体系中，具体步骤如下：
11.s1、采用水浴方式融化冷冻的鹿茸干细胞，使其复苏；
12.s2、提前采用明胶、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白中的一种或几种组合对培养器皿进行包被处理；
13.s3、在培养器皿中建立鹿茸干细胞体外扩增培养体系；将复苏的干细胞接种至培养体系；在co2浓度为5％，37℃的培养箱中进行培养3-5天；
14.s4、离心、换液，每天观察细胞状态；
15.s5、扩大培养。
16.与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
17.本发明中的一种鹿茸干细胞体外扩增培养体系以无血清培养基为基础培养基，更利于干细胞生长，便于纯化和下游加工，也可以消除来自血清的不均一性，避免病毒污染造成的危害。添加叶酸，使其刺激干细胞增殖。细胞生长因子促进干细胞的分裂、繁殖和分化。l-谷氨酰胺是培养杆细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢。二巯基乙醇作为一种强还原剂，可以中和干细胞培养基中积累的氧自由基，使得细胞分裂到很高的密度而不死亡，从而便于进行细胞增殖。青霉素、链霉素利于控制、消除细胞培养过程中的污染。本发明中的鹿茸干细胞体外扩增培养方法操作简单、易行，能高效实现鹿茸干细胞的体外扩增培养，对再生医学有着重要意义。
附图说明
18.图1为本发明提出的一种鹿茸干细胞体外扩增培养方法的流程图。
具体实施方式
19.实施例一
20.本发明提出的一种鹿茸干细胞体外扩增培养体系，包括无血清培养基、细胞生长因子、血清替代物、叶酸、l-谷氨酰胺、二巯基乙醇、青霉素、链霉素和非必须氨基酸。
21.实施例二
22.本发明提出的一种鹿茸干细胞体外扩增培养体系，包括无血清培养基、细胞生长因子、血清替代物、叶酸、l-谷氨酰胺、二巯基乙醇、青霉素、链霉素和非必须氨基酸。
23.进一步的，细胞生长因子为10ng/ml的il-3和100ng/ml的il-6。无血清培养基为dmem培养基，含量为培养体系的94.2％。叶酸含量为培养体系0.1％；l-谷氨酰胺含量为培养体系的0.5％；血清替代物含量为培养体系的5％；二巯基乙醇为培养体系的0.1％；非必须氨基酸为培养体系的0.1％。青霉素和链霉素均为100u/ml。
24.进一步的，鹿茸干细胞来自生茸区骨膜与角柄骨膜中。鹿茸的处理方法如下：取生长期10-70天的鹿茸，无菌纱布去除鹿茸表面的灰尘及血污，备皮后用75％酒精进行消毒处理；在超净工作台中，用一次性无菌组织切片刀片切下3-5cm厚的鹿茸尖端组织，置于无菌培养皿中，然后沿纵向将其分割为0.5-lcm厚的薄片，舍弃最外侧的两片其余保留；薄片平放于无菌培养皿中，用刀片刮去表面血污后，沿着皮肤下结缔组织将皮层和皮下组织分割开来，取皮下组织中微微凸起的弧形半透明样组织，厚度5-8mm，此半透明组织即为鹿茸间充质层；利用手术刀将间充质层组织块分别切割成0.2mmx0.2mmx0.2mm规格，用pbs缓冲液反复冲洗，直至血污完全去除。
25.实施例三
26.本发明提出的一种鹿茸干细胞体外扩增培养体系，包括无血清培养基、细胞生长因子、血清替代物、叶酸、l-谷氨酰胺、二巯基乙醇、青霉素、链霉素和非必须氨基酸。
27.进一步的，细胞生长因子为10ng/ml的il-3和100ng/ml的il-6。无血清培养基为dmem培养基，含量为培养体系的91.2％。叶酸含量为培养体系0.3％；l-谷氨酰胺含量为培养体系的1％；血清替代物含量为培养体系的7％；二巯基乙醇为培养体系的0.3％；非必须氨基酸为培养体系的0.2％。青霉素和链霉素均为100u/ml。
28.进一步的，鹿茸干细胞来自生茸区骨膜与角柄骨膜中。鹿茸的处理方法如下：取生长期10-70天的鹿茸，无菌纱布去除鹿茸表面的灰尘及血污，备皮后用75％酒精进行消毒处理；在超净工作台中，用一次性无菌组织切片刀片切下3-5cm厚的鹿茸尖端组织，置于无菌培养皿中，然后沿纵向将其分割为0.5-lcm厚的薄片，舍弃最外侧的两片其余保留；薄片平放于无菌培养皿中，用刀片刮去表面血污后，沿着皮肤下结缔组织将皮层和皮下组织分割开来，取皮下组织中微微凸起的弧形半透明样组织，厚度5-8mm，此半透明组织即为鹿茸间充质层；利用手术刀将间充质层组织块分别切割成0.2mmx0.2mmx0.2mm规格，用pbs缓冲液反复冲洗，直至血污完全去除。
29.实施例四
30.本发明提出的一种鹿茸干细胞体外扩增培养体系，包括无血清培养基、细胞生长因子、血清替代物、叶酸、l-谷氨酰胺、二巯基乙醇、青霉素、链霉素和非必须氨基酸。
31.进一步的，细胞生长因子为10ng/ml的il-3和100ng/ml的il-6。无血清培养基为dmem培养基，含量为培养体系的88.5％。叶酸含量为培养体系0.5％；l-谷氨酰胺含量为培养体系的2％；血清替代物含量为培养体系的8％；二巯基乙醇为培养体系的0.5％；非必须氨基酸为培养体系的0.5％。青霉素和链霉素均为100u/ml。
32.进一步的，鹿茸干细胞来自生茸区骨膜与角柄骨膜中。鹿茸的处理方法如下：取生长期10-70天的鹿茸，无菌纱布去除鹿茸表面的灰尘及血污，备皮后用75％酒精进行消毒处理；在超净工作台中，用一次性无菌组织切片刀片切下3-5cm厚的鹿茸尖端组织，置于无菌培养皿中，然后沿纵向将其分割为0.5-lcm厚的薄片，舍弃最外侧的两片其余保留；薄片平放于无菌培养皿中，用刀片刮去表面血污后，沿着皮肤下结缔组织将皮层和皮下组织分割开来，取皮下组织中微微凸起的弧形半透明样组织，厚度5-8mm，此半透明组织即为鹿茸间充质层；利用手术刀将间充质层组织块分别切割成0.2mmx0.2mmx0.2mm规格，用pbs缓冲液反复冲洗，直至血污完全去除。
33.实施例五
34.本发明又提出一种鹿茸干细胞体外扩增培养方法，即将鹿茸干细胞接种至上述的培养体系中，具体步骤如下：
35.s1、采用水浴方式融化冷冻的鹿茸干细胞，使其复苏；
36.s2、提前采用明胶、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白中的一种或几种组合对培养器皿进行包被处理；
37.s3、在培养器皿中建立鹿茸干细胞体外扩增培养体系；将复苏的干细胞接种至培养体系；在co2浓度为5％，37℃的培养箱中进行培养3-5天；
38.s4、离心、换液，每天观察细胞状态；
39.s5、扩大培养。
40.进一步的，鹿茸干细胞制备方法如下：对处理好的鹿茸再次粉碎，转入50ml离心管中，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；向沉淀中加入30ml消化液，震荡进
行消化，每间隔lomin在显微镜下观察消化情况，在碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，加loml dmem原代培养液洗涤，然后在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；取沉淀0.5-1g，均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2-3ml的dmem原代培养液，置于co2浓度为5％，37℃的培养箱中培养2-4h，正置培养瓶继续静置培养，4-7天后在显微镜下观察组织块的贴壁及细胞发散情况，当细胞达到70％汇合，将细胞进行胰蛋白酶消化、冻存，获得原代鹿茸干细胞。
41.本发明中的一种鹿茸干细胞体外扩增培养体系以无血清培养基为基础培养基，更利于干细胞生长，便于纯化和下游加工，也可以消除来自血清的不均一性，避免病毒污染造成的危害。添加叶酸，使其刺激干细胞增殖。细胞生长因子促进干细胞的分裂、繁殖和分化。l-谷氨酰胺是培养杆细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢。二巯基乙醇作为一种强还原剂，可以中和干细胞培养基中积累的氧自由基，使得细胞分裂到很高的密度而不死亡，从而便于进行细胞增殖。青霉素、链霉素利于控制、消除细胞培养过程中的污染。
42.本发明中的鹿茸干细胞体外扩增培养方法操作简单、易行，能高效实现鹿茸干细胞的体外扩增培养，对再生医学有着重要意义。
43.上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于此，在所属技术领域的技术人员所具备的知识范围内，在不脱离本发明宗旨的前提下还可以作出各种变化。