对普通大蓟马高致病力及高抗紫外性的航天虫生真菌菌株SCAUHT18及其应用

对普通大蓟马高致病力及高抗紫外性的航天虫生真菌菌株scauht18及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物保护领域，具体涉及生物防治领域，尤其涉及普通大蓟马的生物防治中。


背景技术：

2.伴随着可持续性发展，生态环境的保护显得格外重要。在农业技术的发展过程中，农药的应用不合理很容易导致各种生态环境污染问题的形成。在生产中通常采用化学防治，不但效果不理想，反而导致害虫产生抗药性、天敌昆虫大量死亡、生物多样性丧失、农药残留超标、生态环境污染等一系列问题（杨广军.农药的危害性及绿色植保技术探讨[j].农业开发与装备，2021(04):132-133.）。随着近些年农业经济的持续性发展，农药的使用量不断提高，每年全球为了防治农作物病虫害而使用的农药量约为600万t，农药的有效利用率仅为30%，其中剩余的70%均属于流失量（何云峰.农药的危害性及绿色植保技术研究[j].农业技术与装备，2021(01):94-95.）。环境当中农药的残留会通过雨、风等气象条件而不断的扩散，从而导致全球空气、海洋、土壤以及生物等形成大量的农药残留。我国属于农业大国，农业生产产量相当庞大，这也促使我国农药用量占据全球榜首。正是因为农药使用量的不断扩大，导致农药污染问题越发严重，甚至还频率出现农药中毒案例（刘广.农药环境危害问题及对策研究[j].绿色科技，2020(12):158-160.）。
[0003]
此时需要有意识的强化绿色植物的保护技术方式，尽可能减少农药污染问题的防控工作。因此，要改变使用化学农药为主的传统防治方式，贯彻“预防为主，综合防治”的植保方针，坚持农业防治为主、生物防治为基础，并结合其他防治措施对害虫进行综合治理的可持续建康发展具有极其重要的意义（杨运华, 杜开书, 石明旺. 虫生真菌的生物防治研究进展[j]. 河南科技学院学报, 2011, 39(1):34-37）。
[0004]
虫生真菌是一类寄生真菌，通过侵染进入昆虫体内，并吸收昆虫营养最终导致寄主死亡。其与化学杀虫剂的作用方式不同，对环境和人体安全，常用于害虫的生物防治。虫生真菌侵染昆虫的途径主要有两种：外部途径，与昆虫接触，从体壁、气门及伤口等侵入；内部途径，在昆虫取食、呼吸时，通过消化道、呼吸道侵入。外部侵染以体表侵入为例，首先虫生真菌以分生孢子附着于寄主体表，之后分生孢子萌发长出芽管，芽管穿透寄主体壁进入寄主的血腔内部，在内部先以菌丝体的形式或通过小的独立繁殖体快速扩繁，在血淋巴内吸取虫体养分并不断产生和释放毒性物质，最终导致寄主昆虫的死亡（李月, 姜春杰, 赵宇鹰, 等. 虫生真菌在林业害虫生物防治中的应用[j]. 植物保护, 2016, 10(20): 10-24）。内部侵入是以虫生真菌通过昆虫消化道、呼吸道等途径侵入，然后在寄主体内萌发生长直至把虫体中的营养消耗殆尽。目前，我国已报道的虫生真菌种类超过400种，其中绿僵菌metarhiziumspp. 和白僵菌beauveria spp. 商业化推广和应用最为广泛。白僵菌beauveria寄主范围广泛，包括重要的农业和森林害虫、病媒介昆虫和蜱螨类，易培养，且对温血动物和植物无害，另外，不仅对成虫治病力强，还能侵染幼虫、蛹、成虫等虫态，对下一
代有持续作用并在农林害虫的管理方面发挥了重要作用。虫生真菌以种类多、安全有效、应用期长、不伤害天敌、不易产生抗性及能快速大量生产等优点著称，在生物防治中有着无可比拟的反复侵染性和生产便利性（王清海, 万平平, 黄玉杰, 等. 虫生真菌在害虫生物防治中的应用研究[j]. 山东科学, 2005, 18(4): 37-40.）。
[0005]
航天育种是利用返回式卫星等所能到达的空间环境对植物(种子)的诱变作用产生有益的变异，在地面选育植物新种质、新材料，培育新品种的高新技术育种途径和方法，称为航天诱变育种或空间诱变育种也称太空育种（马成,马伟超,安建平,李师翁.我国微生物航天诱变育种的应用及研究进展[j].湖南农业大学,2012(19):5-8.）。太空环境的特有条件有可能引起生物体发生遗传性变异，这些特有条件包括超高真空、超洁净、微重力、强辐射，并且与地面条件有很大差异，另外，还有强烈的紫外线照射等。太空环境是太空科学研究的一个特殊的重要领域。突变频率高、突变谱广、变异幅度大是空间变异最大的特点，并且突变后的变异性状稳定，从而使育种周期缩短、生物安全性提高（lionheart g, vandenbrink j p, hoeksema j d, et al. the impact of simulated microgravity on the growth of different genotypes of the model legume plant medicagotruncatula[j]. microgravity science and technology, 2018, 30(4): 491-502.）。微生物的航天诱变为微生物的诱变选育提供了新的途径，航天诱变可以明显地改变微生物的生长性状，表现在生长速度、生长形态、生长特性等方面。航天诱变为生物防治优良菌株遗传改良提供了新途径，虫生真菌通过航天搭载，在太空环境作用下，可能会提高菌株毒力、加强菌株对环境的抗逆性，从而获得高效工程菌。这些性状的改变，使微生物产生代谢产物的能力发生改变。与同等情况下传统诱变育种相比，航天诱变育种的效果明显，且性状的遗传稳定性较好，具有很大的应用潜力，能带来巨大的经济效益（蒋培霞,张瑞萍,王海胜,肖溯,杨程,邢新会.紫色杆菌素合成工程菌太空诱变效应及其高产菌株的筛选[j].化工学报,2010,61(02):455-461.）。
[0006]
普通大蓟马megalurothripsusitatus（bagrall）又称豆大蓟马、豆花蓟马，是缨翅目thysanoptera蓟马亚族thripina（stephens）priesner大蓟马属megalurothrips昆虫，该虫广泛分布于中国、马来西亚、印度、澳大利亚等世界泛热带地区（韩运发. 中国经济昆虫志第五十五册：缨翅目[m]. 北京：科学出版社, 1997:39-59.）。目前，蓟马的防治还主要依赖化学防治手段。该虫属杂食性害虫，据不完全统计，寄主植物有9科28种，其中16种为豆科植物（miyazaki m, kudo i, iqbal a. notes on the thrips (thysanoptera) occurring on the soybean in java[j]. library wur, 1984, 52(4): 482-486.）。可在寄主植物的整个生育期进行为害，其危害主要以锉吸寄主植物的生长点、花器等幼嫩组织和器官的汁液，造成叶片皱缩、变小、弯曲或畸形，严重时植株生长缓慢或停止，偏好取食花器和果实。但是，由于蓟马个体小，善隐藏，繁殖力强，适生范围广等生活习性，导致近年来蓟马的抗药性不断增强，化学防治手段很难达到良好的控制效果（唐国文, 龚信文, 孟国玲. 武汉地区蔬菜蓟马种类研究[j]. 华中农业大学学报, 2002, 21(1): 5-9.）。由于化学农药的长期使用，一些害虫产生很强的抗药性，还有许多害虫的天敌在防治过程中被误杀。依赖化学防治导致农田生态平衡破坏、环境污染、食品安全问题，且近年来普通大蓟马对多种常用杀虫剂产生不同程度的抗药性。
[0007]
虫生真菌在生活史的各个阶段均面临多种环境因子的影响，如紫外照射、温度、湿
度、和其他生物或非生物因子的胁迫，这些因子会交互作用影响孢子的活力和侵染力，也制约着真菌杀虫剂在生产上的大规模应用，筛选出高毒力高抗逆性的菌株对田间生产推广极为重要。


技术实现要素：

[0008]
本发明将在出航天诱变高毒力球孢白僵菌菌株中筛选出抗紫外性较高的菌株应用到普通大蓟马的生物防治技术手段当中。因此，本发明的目的在于对比原始菌株，航天诱变高毒力菌株的抗紫外性而研发，提供一株对普通大蓟马具有高毒力且高抗紫外性的航天返回球孢白僵菌菌株。该菌株对不仅普通大蓟马有较优良的杀虫效果，并且菌株具有高抗紫外线的优点。为了获得普通大蓟马生物防治效果的优良菌株，对原始菌株和前期航天返回确定为对普通大蓟马具有高毒力的白僵菌菌株，本发明人采用对航天高毒力菌株其进行生物学特性的研究，测定了在不同紫外时间照射下分生孢子存活率，由此来获得对普通大蓟马雌虫致病强且具有高抗紫外性的优良菌株。菌株在不同时间紫外照射下的产孢量、菌落生长速率及孢子活力等是筛选优良菌株的重要指标。
[0009]
实验发现，航天菌株中对普通大蓟马具有高毒力的菌株20株与原始菌株的抗紫外性相互之间都可能存在差异，因而有着不同程度的抗紫外性。根据本发明的实验结果，结合优良菌株筛选的指标综合考虑，其中抗紫外性是衡量高毒力真菌菌株室外生物防治潜力的重要指标，航天菌株scauht18，scauht38，scauht56在0h，1h、2h、4h、8h紫外照射下，其菌落直径、产孢量、孢子萌发率对比其他航天菌株和原始菌株都更高，航天菌株scauht18，scauht38，scauht56的抗紫外性相比原始菌株和其他供试菌株要更加稳定，。
[0010]
进一步地，本发明还提供航天菌株scauht18在普通大蓟马的室外生物防治中的应用，该菌株于2022年1月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc，地址中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所），保藏号为gdmcc no: 62188，分类命名为beauveriabassiana。而航天菌株scauht38和scauht56将通过另外提出专利申请。
[0011]
在具体实施时，可将所述菌株培养后制成孢子液、或含孢子的菌剂。优选地，在施用时菌株的孢子浓度为10
6 孢子/ml至109孢子/ml，最优选为10
7 孢子/ml至108孢子/ml。
[0012]
本发明人在筛选原始菌株与航天菌株中发现此前对普通大蓟马一定效果的原始菌株球孢白僵菌菌株hnsb110，在航天诱变返回后对普通大蓟马的效果特别突出且生物学特性有明显提高。经过的生物学实验表明，本发明的航天诱变菌株对普通大蓟马控制效果达到90%(以10
7 孢子/ml进行实验)，而同等条件下通常的原始菌株效果下仅为60%；在1
×
10
7 孢子/ml 浓度液条件下，scauht18，scauht38，scauht56在不同处理时间紫外照射下，其菌落直径、产孢量、孢子萌发率都显著高于其他菌株，在紫外照射8h时，第10d的菌落直径达：40mm、40mm、37.5mm，其产孢量达：2.6
×
107/ml、2.35
×
107/ml、2.4
×
107/ml；其萌发率在72h达：62.5%、62.5%、60.5%。远高于其他菌株（见具体实施例的实验结果和表格）。因此，本发明的球孢白僵菌菌株scauht18, scauht38, scauht56可有效抑制室外普通大蓟马种群，且对人、畜、植物和环境安全，可部分替代蓟马化防农药，在室外生物防治上具有很大的应用潜力。
附图说明
[0013]
图1 本发明航空育种步骤示意图。
[0014]
图2航天育种获得的诱变菌株的4个pe管。
[0015]
图3 菌株scauht18，scauht38，scauht56及野生型菌株的菌落直径比较。其中，a为平板的正面图，b为平板的背面图。
具体实施方式
[0016]
下面通过本发明的研发过程和具体实施方式进行介绍，但不构成对本发明的限制。
[0017]
实施例一：航天育种1.供试菌株hnsb110：球孢白僵菌（beauveriabassiana）该菌株于2007年9月在云南省昆明市森林土壤分离而来，保藏于华南农业大学生物防治教育部生物防治中心。
[0018]
由于前期实验发现该菌株生长速度比较快，且对普通大蓟马有一定防治效果，因此选择该菌株进行航天育种。
[0019]
2.实验方法将原始菌株hnsb110接种到4个pe管中，用保鲜膜封口，将样品汇总后实验箱装仓。进行飞船发射在太空中进行在轨试验，返回舱收回，返回舱开舱，试验箱开箱后，最后进行样品分发（具体操作步骤如图1）。
[0020]
3.实验条件（1）载具：长征五号b运载火箭（2）时间：2020.5.5-2020.5.8（在轨飞行约67小时）（3）发射场地：海南文昌航天基地（4）在轨高度：300~8000公里（5）所处环境：多次穿越范艾伦辐射带（高能粒子辐射带）4.实验结果共获得诱变菌株4个pe管（图2），菌株搭载返回后保藏于华南农业大学生物防治教育部生物防治中心，放至4℃中保存，用于后续试验。
[0021]
实施例二：菌株的生物测定1、供试昆虫：普通大蓟马种群采自广州市朱村豇豆田，在实验室饲养多代，饲养条件为温度26℃，相对湿度 65% ，光周期 l∶d = 12∶12。
[0022]
2、供试菌株：（1）hnsb110：球孢白僵菌（beauveriabassiana）保藏于华南农业大学生物防治教育部生物防治中心，为原始的野生菌株。
[0023]
（2）采用实施例一获得的航空诱变菌株，挑取100个单菌落孢子，得到100个航天菌株。对100个航天菌株进行普通大蓟马初步毒力实验，然后针对毒力较高前20株菌株进行普通大蓟马毒力生测实验。
[0024]
3、实验方法（1）孢子悬浮液的配制
在 pda 平板上 26
±
1℃培养 7 d 后，充分产孢的虫生真菌分生孢子用 0.05%吐温-80无菌水洗脱孢子，用磁力搅拌器搅拌，再置于摇床180 rpm 25℃振荡培养 25 min 后用双层擦镜纸过滤，用血球计数板计数，测量母液的浓度，配制成 1
×
10
7 孢子/ml的孢子悬浮液。
[0025]
（2）虫生真菌对普通大蓟马的毒力测定将配制好的孢子悬浮液和发酵液置于平底指型管（15mm
×
75mm）中，浸泡 2h 后倒出孢子悬浮液，指型管自然风干后备用；豇豆切段（1cm，两端无孔），浸入孢子悬浮液，30s 取出，自然风干后对应放入处理好的指型管中，同时接入普通大蓟马雌成虫 50 头，棉花封口，置于人工气候箱中，以 0.05%吐温-80 无菌水为空白对照，每个处理重复 4 次。连续 7d 记录其死亡率。
[0026]
(3)数据处理利用 spss 19.0 软件进行试验处理分析，采用单因素方差分析对各结果进行分析，并运用tukey检验差异显著性。
[0027]
4 实验结果实验结果显示，不同菌株孢子悬浮液对普通大蓟马的致病力差异显著，不同菌株，同一浓度、不同处理时间致病力存在差异，普通大蓟马雌成虫的死亡率随着浓度和处理时间的增加而上升(表1)；当浓度为 1
×
107孢子/ml时（表1），scauht18, scauht38, scauht56在第6d的累计死亡率为100%，100%，100%结果表明，菌株scauht18, scauht38, scauht56对普通大蓟马均有较好致死效果，属于潜在优良生防菌。
[0028]
表1不同菌株普通大蓟马的校正死亡率（%）注: 经tukey检验, 同一列的不同小写字母表示不同菌株间致病力差异显著（p＜0.05）。
[0029]
实施例三：航天高毒力菌株的抗紫外生物学特性1.供试菌株hnsb110：球孢白僵菌（beauveriabassiana）保藏于华南农业大学生物防治教育部生物防治中心。
[0030]
实施例二菌株中筛选的20个菌株。其中scauht18，scauht38，scauht56保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），保藏号分别为gdmcc no: 62188、gdmcc no: 62187和gdmcc no: 62199。
[0031]
2.试验方法（1）孢子悬浮液的配制在 pda 平板上 26
±
1 ℃培养 7 d 后，充分产孢的虫生真菌分生孢子用 0.05%吐温-80无菌水洗脱孢子，用磁力搅拌器搅拌，再置于摇床 180 rpm 25℃振荡培养 25 min 后用双层擦镜纸过滤，用血球计数板计数，测量母液的浓度，配制成 1
×
107孢子/ml的孢子悬浮液。
[0032]
（2）紫外照射将1
×
107孢子/ml的孢子悬浮液分别在分别紫外（uv-b）照射0、1、2、4、8h。
[0033]
（3）菌落直径、产孢量、萌发率取200μl 悬浮液滴加到pda 平板中央，26℃培养10d，每天测量记录其菌落直径，待最后一天测量完成后，用100 ml 0.05% 的tween-80 洗脱，制成分生孢子悬浮液，用血球计数板计算分生孢子产量。
[0034]
取2ml悬浮液加入到的18ml sda培养基中，轻摇混匀，置于160 rpm 25℃振荡摇床中培养，分别在24h、48h、72h 镜检各处理的孢子萌发情况。
[0035]
（4）数据处理利用 spss 19.0 软件进行试验处理分析，采用单因素方差分析对各结果进行分析，并运用tukey检验差异显著性3.实验结果（1）菌落直径、产孢量实验结果显示，在（uv-b）照射0、1、2、4、8h后，航天菌株scauht18, scauht38, scauht56对比原始菌株菌落直径在生长10d后，其航天菌株scauht18, scauht38, scauht56的菌落直径和产孢量显著高于原始菌株和其他菌株。在（uv-b）照射4h后，生长第10d时航天菌株scauht18, scauht38, scauht56的菌落直径为49.5mm、45mm、47mm，而原始菌株hnsb110的菌落直径为：31.5mm。原始菌株hnsb110产孢量在10d时为1.5
×
107，而航天菌株scauht18, scauht38, scauht56在第10d产孢量分别为：3.3
×
107/ml、3.35
×
107/ml、2.95
×
107/ml。
[0036]
结果表明：航天菌株航天菌株scauht18，scauht38，scauht56在不同紫外时间照射下，其菌落直径（图3，其中，a为平板的正面图，b为平板的背面图）和产孢量均大于原始菌株和其他航天菌株，有较好的孢子活力，属于潜在田间优良生防菌。
[0037]
表2.不同菌株在不同时间紫外照射下菌落直径
注: 经tukey检验, 同一列的不同小写字母表示不同菌株间菌落直径差异显著（p＜0.05）。
[0038]
表3.不同菌株在不同时间紫外照射下1
×
106/ml产孢量注: 经tukey检验, 同一列的不同小写字母表示不同菌株间产孢量差异显著（p＜0.05）。
[0039]
（2）萌发率实验结果显示，在不同紫外照射时间后，航天菌株scauht18，scauht38，scauht56在24h、48h、72h时的孢子萌发率均高于原始菌株和其他菌株。在紫外照射4h后，航天菌株scauht18，scauht38，scauht56在24的萌发率为26.5%、24.5%、24%，在48h的萌发率为：38.5%，36.5%、36.5%，在72h的萌发率为：74.5%、72.5%、70.5%。而原始菌株在紫外照射4h后，在24h、48h、72h下的萌发率为：11.5%、28.5%、52%。
[0040]
结果表明，航天菌株scauht18, scauht38, scauht56在孢子萌发率均大于原始菌株和其他航天菌株，属于潜在优良田间生防菌。
[0041]
表4.不同菌株在紫外0h照射射下的萌发率注: 经tukey检验, 同一列的不同小写字母表示不同菌株间萌发率差异显著（p＜0.05）。
[0042]
表5.不同菌株在紫外1h照射射下的萌发率
注: 经tukey检验, 同一列的不同小写字母表示不同菌株间萌发率差异显著（p＜0.05）。
[0043]
表6.不同菌株在紫外2h照射射下的萌发率
注: 经tukey检验, 同一列的不同小写字母表示不同菌株间萌发率差异显著（p＜0.05）。
[0044]
表7.不同菌株在紫外4h照射射下的萌发率
注: 经tukey检验, 同一列的不同小写字母表示不同菌株间萌发率差异显著（p＜0.05）。
[0045]
表8.不同菌株在紫外8h照射射下的萌发率
注: 经tukey检验, 同一列的不同小写字母表示不同菌株间萌发率差异显著（p＜0.05）。