一种α-葡萄糖转苷酶突变体及其应用的制作方法

一种
α-葡萄糖转苷酶突变体及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种α-葡萄糖转苷酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides，imos)是一类功能性低聚糖，由2～10个α-1、6-糖苷键连接的葡萄糖基组成，包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等主要功能成分。imos可促进双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌在人体肠道中的增殖，调节肠道菌群；有低热量值，促进胃肠蠕动，改善便秘和脂质代谢，防龋齿等功能，因此，imos被广泛用作益生素、食品添加剂和饲料成分。
3.目前，一般通过酶促转化的方法生产imos，利用α-淀粉酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖苷酶从淀粉中催化生产，其典型的生产过程通常包括3个步骤：一是液化，其中淀粉被耐热α-淀粉酶液化产生低聚糖和糊精；二是糖化，低聚糖和糊精被β-淀粉酶和普鲁兰酶等糖化酶糖化；三是转糖基化，α-葡萄糖苷酶(ec3.2.1.20)可催化葡萄糖从底物的非还原末端释放，并将葡萄糖基残基转移到非还原葡萄糖单位的6-oh基团，产生imos。目前，商业α-淀粉酶，β-淀粉酶和普鲁兰酶等的研究及工业应用较为成熟，而工业上应用的α-葡萄糖苷酶大多来源于黑曲霉(aspergillus niger)，由于热稳定性差、反应速率不高和酶纯化及回收利用成本高等问题，限制了α-葡萄糖苷酶在规模化生产imos上的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种热稳定性提高的α-葡萄糖苷酶突变体。
5.技术方案
6.一种α-葡萄糖苷酶突变体，是对氨基酸序列如seq id no.1所示的α-葡萄糖转苷酶的第204位和/或第307位的氨基酸进行定点突变获得的，其中，将第204位的丝氨酸突变为亮氨酸，第307位的丙氨酸突变为谷氨酸，所述α-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5所示；编码所述α-葡萄糖转苷酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.上述α-葡萄糖苷酶突变体用于生产低聚异麦芽糖的应用。
8.一种制备上述α-葡萄糖苷酶突变体的方法：
9.(1)以seq id no.2所示核苷酸序列为模板，根据突变的位点，设计定点突变引物，进行pcr扩增获得含有突变位点的基因，然后构建含有编码突变体基因的载体。
10.(2)将含有编码突变体的基因载体转化到宿主细胞内。
11.(3)对上一步构建的重组细胞进行筛选验证，获得阳性克隆，然后通过培养发酵产酶，离心收集细胞，利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，离心，获得α-葡萄糖转苷酶突变体。
12.一种编码上述α-葡萄糖苷酶突变体的基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8所示。
13.一种携带上述基因的重组表达载体。
14.所述重组表达载体以pet-28a( )载体作为原始表达载体。
15.一种由上述重组表达载体转化得到的基因工程菌。
16.所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。所述大肠杆菌包括bl21(de3)。
17.本发明的有益效果：
18.1)本发明在天然α-葡萄糖转苷酶的基础上，通过理性设计，结合定点突变生物技术改造α-葡萄糖转苷酶分子结构，分析了突变后残基对酶热稳定性的影响，并最终获得了稳定性提高的突变菌株(s204l、a307e和s204l/a307e)。
19.2)天然α-葡萄糖转苷酶的半衰期为18.3h，本发明提供的α-葡萄糖转苷酶突变体s204l(第204位的丝氨酸突变为亮氨酸)在65℃时半衰期达到37.4h，是天然α-葡萄糖转苷酶的半衰期的2.06倍；α-葡萄糖转苷酶突变体a307e(第307位的丙氨酸突变为谷氨酸)在65℃时半衰期达到28.6h，是天然α-葡萄糖转苷酶的半衰期的1.56倍；s204l/a307e(第204位的丝氨酸突变为亮氨酸，第307位的丙氨酸突变为谷氨酸)在65℃时半衰期达到56.9h，是天然α-葡萄糖转苷酶的半衰期的3.1倍。
20.3)本发明提供的α-葡萄糖转苷酶突变体在热稳定显著提高的同时酶的活性不受影响。其中，在酶催化活性基本不变的情况下在65℃热处理40h后，突变体s204l(第204位的丝氨酸突变为亮氨酸)和a307e(第307位的丙氨酸突变为谷氨酸)以及组合突变体s207l/a307e分别保留49.1％，43.2％和91.2％的相对酶活，对照组则仅仅保留15.7％的相对酶活。
21.4)本发明所得的α-葡萄糖转苷酶突变体比野生型更适合于催化麦芽糖生成低聚异麦芽糖的应用，更利于生产工艺的灵活性。
附图说明
22.图1为野生型α-葡萄糖转苷酶及α-葡萄糖转苷酶突变体纯酶液的sds-page电泳图；
23.图2为65℃、ph7.0条件下孵育40h后野生型α-葡萄糖转苷酶及其突变体的残留活性测试结果；
24.图3为65℃条件下野生型α-葡萄糖转苷酶及α-葡萄糖转苷酶突变体s204l、a307e、s204l/a307e的半衰期；
25.图4为野生型α-葡萄糖转苷酶及α-葡萄糖转苷酶突变体s204l、a307e、s204l/a307e在不同ph下的酶活；
26.图5为野生型α-葡萄糖转苷酶及α-葡萄糖转苷酶突变体s204l、307e、s204l/a307e在不同温度下的酶活。
具体实施方式
27.下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。下述实施例中，涉及的pet-28a( )载体购自invitrogen；涉及的培养基及配方如下：
28.lb液体培养基：10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉、10g/l nacl。
29.lb固体培养基：在lb液体培养基的基础上添加2％琼脂。
30.下述实施例中所涉及的检测方法如下：
31.α-葡萄糖转苷酶酶活测定方法：取100μl 0.05mg/ml的纯酶加入到含有200g/l的麦芽糖的50mm ph 7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液的900μl反应体系中；于45℃水浴条件下反应10min，然后100℃沸水浴10min终止酶促反应，离心取上清，稀释20倍后，利用hplc检测反应溶液中低聚异麦芽糖0的含量。
32.酶活定义：定义在45℃、ph 7.0的条件下，每分钟催化麦芽糖生成lμmol低聚异麦芽糖所需的酶量，为一个酶活单位u。
33.比酶活：定义为单位蛋白的酶活u/mg。
34.实施例1含α-葡萄糖转苷酶突变体的重组质粒的构建
35.构建含有α-葡萄糖转苷酶突变体的重组质粒：
36.(1)含有野生型的α-葡萄糖转苷酶gsj的重组质粒的构建
37.化学合成核苷酸序列如seq id no.2所示的野生型的α-葡萄糖转苷酶gsj，与pet-28a( )载体采用ndeⅰ酶和mluⅰ酶酶切后连接，制备得到重组载体pet-28a( )-gsj。
38.(2)含有突变体的重组载体的获得：
39.利用全质粒pcr技术，将步骤(1)制备得到的重组载体pet-28a( )-gsj为模板进行定点突变，获得含有突变体基因的重组质粒pet-28a( )-s204l、pet-28a( )-i209m、pet-28a( )-s360l、pet-28a( )-n441m、pet-28a( )-g108p、pet-28a( )-s132f、pet-28a( )-a307e、pet-28a( )-s204l/a307e。
40.设计的引物序列如下：
41.s204l-f：aactgggagaatctcgaagtg
42.s204l-r：cttggcgcacttcgagat
43.i209m-f：gccgagctgtacgacatgttacgcttctggctg
44.i209m-r：cagccagaagcgtaacatgtcgtacagctcggc
45.s360l-f：ctgcaagaaaatgccttaaccttaactttagcccc
46.s360l-r：gctaaagttaaggttaaggcattttcttgcagactcgg
47.n441m-f：ggcatttacaaattaatgcaccaccaccacca
48.n441m-r：tggtggtggtggtgcattaatttgtaaatgcc
49.g108p-f：ttttggcgcgacccgaaacaaggtcaagctccgaat
50.g108p-r：ttgaccttgtttcgggtcgcgccaaaagtagtagtc
51.s132f-f：ttccgccaagttatcttccaaaccgatcgtgc
52.s132f-r：gcacgatcggtttggaagataacttggcggaa；
53.a307e-f：atctttggtgttccgctgagcgccatgcccgat；
54.a307e-r：atcgggcatggcgctcagcggaacaccaaagat。
55.其中，pcr扩增程序设定为：首先，95℃预变形5min；然后进入30个循环；95℃变性30s，72℃退火30s，58℃延伸3.5min,4℃保温。pcr产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
56.将最终扩增片段用dpn i酶在37℃水浴锅中作用1h用于去除模板，然后将pcr混合物化学转化到e.coli jm109感受态细胞中，转化液涂布含氨苄青霉素(50μg/ml)lb固体培养基上，提取质粒并测序，测序工作由苏州金唯智完成。
57.实施例2：产α-葡萄糖转苷酶突变体重组大肠杆菌工程菌的构建及α-葡萄糖转苷酶的表达、分离、纯化
58.具体步骤如下：
59.(1)分别将实施例1得到的重组质粒pet-28a( )-gsj、pet-28a( )-s204l、pet-28a( )-i209m、pet-28a( )-s360l、pet-28a( )-n441m、pet-28a( )-g108p、pet-28a( )-s132f、pet-28a( )-a307e、pet-28a( )-s204l/a307e，转化到e.coli bl21感受态细胞中，分别制备得到基因工程菌：e.coli bl21/pet-28a( )-gsj、e.coli bl21/pet-28a( )-s204l，e.coli bl21/pet-28a( )-i209m，e.coli bl21/pet-28a( )-s360l，e.coli bl21/pet-28a( )-n441m，e.coli bl21/pet-28a( )-g108p，e.coli bl21/pet-28a( )-s132f，e.coli bl21/pet-28a( )-a307e，e.coli bl21/pet-28a( )-s204l/a307e。
60.(2)分别将步骤(1)制备得到的基因工程菌接种至10ml含有50μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃、200rpm下培养过夜，制备得到种子液；
61.将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量转接至100ml含有50μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基中，在30℃条件下继续培养20h，得到发酵液。将制备得到的发酵液在8000
×
g，4℃条件下离心处理5min得到细胞菌体，并将细胞在洗涤3次后，用10ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(ph 7.0)重新悬浮。
62.用超声破碎仪在冰浴条件下处理重悬后的细胞30min，离心30min(8000
×
g，4℃)，去上清液即为粗酶液；
63.通过0.22-μm过滤器过滤上清液部分，然后进一步加载到1ml ni亲和柱上，该亲和柱用50mm洗涤缓冲液(20mm tris和500mm nacl，ph 7.4)预平衡，然后洗脱缓冲液(20mm tris、500mm nacl和500mm咪唑，ph 7.4)用线性梯度洗脱未结合蛋白和α-葡萄糖转苷酶；分别制备得到含有野生型gsj的纯酶液，含有s204l的纯酶液，含有i209m的纯酶液，含有s360l的纯酶液，含有n441m的纯酶液，含有g108p的纯酶液，含有s132f的纯酶液，含有a307e的纯酶液，含有s204l/a307e的纯酶液；
64.分别将上述纯酶液经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，电泳图如图1所示，其中：m，protein maker；1，野生型gsj纯酶液；2-9分别为：含有s204l，i209m，a307e，s360l，s132f，g108p，n441m，s207l/a307e纯酶液。结果显示：在63kda处有明显的条带，证明α-葡萄糖转苷酶得到表达。
65.对步骤(2)制备得到的纯酶进行热稳定性实验，进行初步筛选，方法如下：分别将步骤(2)制备得到的纯酶在65℃水浴锅中孵育处理40h后，取1ml，根据α-葡萄糖转苷酶酶活测定方法测定剩余酶的残余酶活，以未经过高温处理的纯酶液的酶活为空白对照，得到残余酶活的百分比，野生型α-葡萄糖转苷酶及其突变体的残留活性测试结果图2所示。
66.由图2可以看出，突变体s204l保留49.1％的相对酶活，对照组则仅仅保留9.7％的相对酶活；而其他突变体的相对酶活均在18％以下；因此本发明的突变体s204l的热稳定性显著高于其他突变体。
67.对步骤(2)制备得到的纯酶液进行比酶活测定
68.分别检测步骤(2)制备得到的含有野生型gsj的纯酶液，含有s204l的纯酶液，含有a307e的纯酶液，含有s204l/a307e的纯酶液，结果如表1所示：
69.表1不同α-葡萄糖转苷酶的比酶活
[0070][0071]
实施例3：α-葡萄糖转苷酶突变体酶学性质
[0072]
1、热稳定性
[0073]
分别取实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型gsj的纯酶液，含有s204l的纯酶液，含有a307e的纯酶液，含有s204l/a307e的纯酶液置于65℃恒温水浴中，每隔一段时间取样一次，根据α-葡萄糖转苷酶酶活测定方法测其残留酶活，比较其热稳定性，得到野生型gsj以及其突变体的半衰期结果如图3所示。
[0074]
2、最适ph
[0075]
将实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型gsj的纯酶液，含有s204l的纯酶液，含有a307e的纯酶液，含有s204l/a307e的纯酶液置于含有柠檬酸/磷酸钠(ph5.0～9.0)的50mm缓冲液中，以未孵育的初始酶活为100％，测定酶活性，结果如图4所示。
[0076]
由图4可以看出，突变体的最适ph为7.0，与野生型类似。
[0077]
3、最适温度
[0078]
将实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型gsj的纯酶液，含有s204l的纯酶液，含有a307e的纯酶液，含有s204l/a307e的纯酶液置于含有柠檬酸/磷酸钠(ph7.0)的50mm缓冲液中，设置反应温度为30～60℃，以未孵育的初始酶活为100％，测定酶活性，结果如图5所示。
[0079]
由图5可以看出，突变体的最适温度为45℃，与野生型类似。
[0080]
4、α-葡萄糖转苷酶的动力学参数
[0081]
以麦芽糖为底物，在标准测定条件下测定了实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型gsj的纯酶液，含有s204l的纯酶液，含有a307e的纯酶液，含有s204l/a307e的纯酶液的动力学参数。其中，麦芽糖底物浓度分别为14.6、29.2、58.4、102、146、234、292和584mm；纯酶液的添加量为10μg，在45℃条件下反应10min，反应结束后，利用graphpad prism 8.0对实验数据进行回归分析，确定vmax和km值；结果如表2所示：
[0082]
表2不同α-葡萄糖转苷酶的动力学参数
[0083][0084]
结果显示，与野生型相比，突变体表现出相似的活性。这些突变体的km和kcat/km等动力学参数变化较小，表明突变或热稳定性对酶的催化性质影响不大。
[0085]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
[0086]
序列表
[0087]
seq id no.1
[0088]
α-葡萄糖转苷酶的氨基酸序列
[0089]
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[0090]
seq id no.2
[0091]
编码α-葡萄糖转苷酶的核苷酸序列
[0092]
aaaaaaacgtggtggaaagaaggcgtggcgtatcagatctacccgcgtagctttatggacgccaatggcgacggcatcggcgatctgcgtggcatcatcgagaagctcgactatctggttgaactgggcgtggacatcgtttggatctgtccgatctatcgcagtccgaatgccgataacggctacgatatcagcgactactacgccatcatggacgagttcggcaccatggatgacttcgatgagctgctggcgcaagcccatcgtcgtggtctcaaggtgatcctcgatctggtgatcaatcacaccagcgatgaacacccgtggtttatcgaaagtcgcagcagtcgcgacaacccgaagcgcgattggtacatttggcgtgacggcaaagacggccgcgaaccgaacaactgggaaagcattttcggtggcagcgcgtggcagtacgatgaacgcacgggccagtactatctgcacattttcgacgtgaagcagccagatctgaactgggagaatagcgaagtgcgccaagcgctgtacgaaatggtgaactggtggctcgacaagggtatcgatggcttccgcatcgacgccatcagccatatcagcaagaagccgggtctgccggatctgccaaatccgaaaggtctgaaatacgtgccgagctttgccggccacatgaatcagccgggcatcatggaatatctgcgcgagctgaaagagcagaccttcgcccgctatgatatcatgaccgtgggcgaagcgaacggtgtgaccgttgacgaagccgaacagtgggtgggcgaggaaaacggtgtgttcaatatgatcttccaatttgagcatctgggtctctgggaacgtcgcgccgatggcagcatcgatgttcgtcgtctgaaacgcacgctgaccaaggcgcagaaaggcctcgaaaaccgcggttggaatgcgctgtttctggaaaaccacgatctcccgcgcagcgtgagtacgtggggcaatgaccgtgattactgggccgaaagcgcgaaagcgctcggtgcgctctatttcttcatgcaaggcaccccgtttatctaccaaggccaagagatcggcatgaccaatgttcgctttgacgacatccgcgactaccgcgatgttagcgccctccgcctctacgaactggaacgtgccaagggccgcacgcatgaagaggccatgaccatcatctggaaaacgggtcgcgacaacagtcgcacgccgatgcagtggagcggtgccagtaatgccggcttcacgaccggcaccccatggattaaggttaatgaaaactaccgcaccatcaatgtggaagcggaacgtcgcgacccgaacagcgtgtggagcttttatcgccagatgatccagctccgtaaagcgaacgagctgtttgtttacggcacgtacgatctgctgctggagaaccatccgagcatttacgcctatacccgtacgctgggtcgtgatcgtgcgctggtggttgttaatctcagcgaccgcccaagtctgtaccgctatgacggcttccgtctgcagagcagtgatctggcgctgagtaattacccagtgcgcccgcacaagaatgccacgcgcttcaaactcaagccgtacgaggcccgcgtgtacatctggaaggagtaa
[0093]
seq id no.3
[0094]
α-葡萄糖转苷酶突变体s204l的氨基酸序列
[0095]
kktwwkegvayqiyprsfmdangdgigdlrgiiekldylvelgvdivwicpiyrspnadngydisdyyaimdefgtmddfdellaqahrrglkvildlvinhtsdehpwfiesrssrdnpkrdwyiwrdgkdgrepnnwesifggsawqydertgqyylhifdvkqpdlnwensevrqalyemvnwwldkgidgfridaishilkkpglpdlpnpkglkyvpsfaghmnqpgimeylrelkeqtfarydimtvgeangvtvdeaeqwvgeengvfnmifqfehlglwerradgsidvrrlkrtltkwqkglenrgwnalflenhdlprsvstwgndrdywaesakalgalyffmqgtpfiyqgqeigmtnvrfddirdyrdvsalrlyelerakgrtheeamtiiwktgrdnsrtpmqwsgasnagfttgtpwikvnenyrtinveaerrdpnsvwsfyrqmiqlrkanelfvygtydlllenhpsiyaytrtlgrdralvvvnlsdrpslyrydgfrlqssdlalsnypvrphknatrfklkpyearvyiwke
[0096]
seq id no.4
[0097]
α-葡萄糖转苷酶突变体a307e的氨基酸序列
[0098]
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[0099]
seq id no.5
[0100]
α-葡萄糖转苷酶突变体s204l/a307e的氨基酸序列
[0101]
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[0102]
seq id no.6
[0103]
编码α-葡萄糖转苷酶突变体s204l的核苷酸序列
[0104]
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[0105]
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[0106]
编码α-葡萄糖转苷酶突变体a307e的核苷酸序列
[0107]
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[0108]
seq id no.8
[0109]
编码α-葡萄糖转苷酶突变体s204l/a307e的核苷酸序列
[0110]
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