一种产高活性纤维素酶的复合菌剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物处理技术领域，尤其涉及一种产高活性纤维素酶的复合菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.农村生活污水处理是将生活污水中的有害物质和污染环境成份清除、降解做无害处理，其中化粪池作为一种传统的环保设施，在处理农村粪污过程中发挥了重要作用。但是，由于化粪池中有机质分解速度慢，导致化粪池底部沉积污泥，化粪池清掏时间一般为3个月到一年，清掏频率低，使得化粪池出水的污水系统负荷增加，运行要求和维护成本提高。尤其是化粪池排污水中所含的纤维素，给后端尤其是农村污水的分散处理带来了很大的难度，很不利于农村粪污的分散处理模式。所以现在亟待寻找一种能够高效处理农村粪污污水的方法以解决农村污水处理的问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种产高活性纤维素酶的复合菌剂及其制备方法和应用，本发明所述复合菌剂能够解决传统化粪池中有机质的分解速度慢、清掏频率大、化粪池出水的污水系统负荷增加、运行要求和维护成本等问题，能够有效分解水中纤维素，使污水处理中以污泥形式存在的纤维素的量得以减少，减轻处理负荷。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种产高活性纤维素酶的复合菌剂，包括以下体积份数的菌剂：地衣芽孢杆菌25～40份、胶冻样类芽孢杆菌25～40份、枯草芽孢杆菌15～25份、酿酒酵母15～25份；所述各菌剂中菌的浓度为1.0
×
109～1.5
×
109个/ml。
6.本发明还提供了一种产高活性纤维素酶的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将地衣芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母分别活化培养，得到原种；
8.(2)将步骤(1)得到的原种进行发酵扩大培养，得到发酵菌液；
9.(3)将步骤(2)得到的发酵菌液分别接种于纤维素酶富集培养基中培养；
10.(4)将步骤(3)得到的菌液混合得到产高活性纤维素酶的复合菌剂。
11.进一步地，步骤(1)中活化培养的温度为28～32℃，活化培养的时间为24～48h，活化培养时的震荡频率为160～170rpm。
12.进一步地，步骤(2)中发酵扩大培养时原种的接种体积比例为1～5％，所述发酵扩大培养的培养基为lb培养基。
13.进一步地，步骤(2)中发酵扩大培养的温度为28～32℃，发酵扩大培养时搅拌的转速为100～150r/min，溶解氧为2～3mg/l，当发酵菌液中微生物总菌数达到1.0
×
109～1.5
×
109个/ml时停止发酵。
14.进一步地，步骤(3)中纤维素酶富集培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：牛
肉膏1～3g/l、蛋白胨4～6g/l、纤维素粉22～28g/l、硫酸铵1～2g/l、磷酸二氢钾0.5～1.5g/l、氯化钠0.2～1g/l、七水硫酸镁0.2～1g/l，所述纤维素酶富集培养基的ph值7.1～7.3。
15.进一步地，步骤(3)中培养的温度为28～32℃，培养的时间为24～72h，培养时震荡频率为160～170rpm。
16.本发明还提供了一种产高活性纤维素酶的复合菌剂在降解农村粪污污水中纤维素的应用，所述复合菌剂的使用量为污水质量的0.1～0.5％。
17.本发明的有益效果为：
18.(1)本发明的复合菌剂由多种微生物组成，经过24小时发酵所产生的纤维素酶的活力通过滤纸酶活测定在4.2u/ml以上，具有很高的纤维素酶活性；
19.(2)本发明的复合菌剂可以加快化粪池中纤维素有机质如纸、果蔬残渣、粪渣等的分解，防止化粪池的堵塞，降低化粪池清掏的频率；
20.(3)本发明的复合菌剂可降低农村粪污分散式处理装置的容量，降低农村分散式污水处理的设施投入，具有较高的经济效益，而且随着化粪池排放水进入污水处理系统后，随着污水中纤维素的分解，使污水处理中以污泥的形式存在的纤维素的量得以减少，从而降低生活污泥的生成量，特别有利于农村污水处理过程中的“无人值守”状态；
21.(4)在化粪池中投加本发明复合菌剂后，随着化粪池发酵后的粪水用于农田灌溉时，该生物菌群进入土壤中，进一步促进土壤中微生物的“激发效应”，使土壤中的有机质更加得以利用，促进农作物的生长，增加粮食、蔬菜等的产量。
附图说明
22.图1为不同比例条件下复合菌剂产纤维素酶活测定结果图；
23.图2为不同比例条件下复合菌剂纤维素降解性能测定图。
具体实施方式
24.本发明提供了一种产高活性纤维素酶的复合菌剂，包括以下体积份数的菌剂：地衣芽孢杆菌25～40份、胶冻样类芽孢杆菌25～40份、枯草芽孢杆菌15～25份、酿酒酵母15～25份。
25.在本发明中，按体积份数计，制备所述产高活性纤维素酶的复合菌剂包括地衣芽孢杆菌25～40份，优选为28～38份，更优选为30～35份。
26.在本发明中，按体积份数计，制备所述产高活性纤维素酶的复合菌剂包括胶冻样类芽孢杆菌25～40份，优选为28～38份，更优选为30～35份。
27.在本发明中，按体积份数计，制备所述产高活性纤维素酶的复合菌剂包括枯草芽孢杆菌15～25份，优选为18～23份，更优选为19～21份。
28.在本发明中，按体积份数计，制备所述产高活性纤维素酶的复合菌剂包括酿酒酵母15～25份，优选为18～23份，更优选为19～21份。
29.在本发明中，所述各菌剂中菌的浓度为1.0
×
109～1.5
×
109个/ml，优选为1.1
×
109～1.4
×
109个/ml，更优选为1.2
×
109～1.3
×
109个/ml。
30.在本发明中，所述地衣芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母均
为市售。
31.本发明还提供了一种产高活性纤维素酶的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
32.(1)将地衣芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母分别活化培养，得到原种；
33.(2)将步骤(1)得到的原种进行发酵扩大培养，得到发酵菌液；
34.(3)将步骤(2)得到的发酵菌液分别接种于纤维素酶富集培养基中培养；
35.(4)将步骤(3)得到的菌液混合得到产高活性纤维素酶的复合菌剂。
36.在本发明中，将地衣芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母分别活化培养，得到原种。
37.在本发明中，所述活化培养的培养基优选为lb培养基；所述活化培养的温度优选为28～32℃，更优选为29～31℃；所述活化培养的时间为24～48h，优选为30～45h，更优选为32～40h；所述活化培养时的震荡频率优选为160～170rpm，更优选为162～168rpm。
38.本发明在获得原种后，进行发酵扩大培养。在本发明中，所述发酵扩大培养时的原种的接种体积比例优选为1～5％，更优选为2～4％；所述发酵扩大培养的培养基优选为lb培养基。
39.在本发明中，所述发酵扩大培养的温度优选为28～32℃，更优选为29～31℃；所述发酵扩大培养时搅拌的转速为100～150r/min，优选为110～140r/min，更优选为120～130r/min；培养基中溶解氧为2～3mg/l，优选为2.2～2.8mg/l，更优选为2.4～2.6mg/l；当发酵菌液中微生物总菌数达到1.0
×
109～1.5
×
109个/ml时停止发酵，所述总菌数优选为1.1
×
109～1.4
×
109个/ml，更优选为1.2
×
109～1.3
×
109个/ml。
40.本发明在得到发酵菌液后分别接种于纤维素酶富集培养基中培养。在本发明中，所述纤维素酶富集培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：牛肉膏1～3g/l、蛋白胨4～6g/l、纤维素粉22～28g/l、硫酸铵1～2g/l、磷酸二氢钾0.5～1.5g/l、氯化钠0.2～1g/l、七水硫酸镁0.2～1g/l。
41.在本发明中，制备所述纤维素酶富集培养基包括牛肉膏1～3g/l，优选为1.5～2.5g/l，更优选为1.8～2.2g/l。
42.在本发明中，制备所述纤维素酶富集培养基包括蛋白胨4～6g/l，优选为4.5～5.5g/l，更优选为4.8～5.2g/l。
43.在本发明中，制备所述纤维素酶富集培养基包括纤维素粉22～28g/l，优选为24～26g/l，更优选为24.5～25.5g/l。
44.在本发明中，制备所述纤维素酶富集培养基包括硫酸铵1～2g/l，优选为1.4～1.6g/l，更优选为1.45～1.55g/l。
45.在本发明中，制备所述纤维素酶富集培养基包括磷酸二氢钾0.5～1.5g/l，优选为0.8～1.2g/l，更优选为0.9～1.1g/l。
46.在本发明中，制备所述纤维素酶富集培养基包括氯化钠0.2～1g/l，优选为0.4～0.8g/l，更优选为0.5～0.6g/l。
47.在本发明中，制备所述纤维素酶富集培养基包括七水硫酸镁0.2～1g/l，优选为0.4～0.8g/l，更优选为0.5～0.6g/l。
48.在本发明中，所述纤维素酶富集培养基的ph值优选为7.1～7.3，更优选为7.15～
7.25。
49.在本发明中，所述培养的温度优选为28～32℃，更优选为29～31℃；所述培养的时间为24～72h，优选为36～60h，更优选为45～50h；培养时震荡频率优选为160～170rpm，更优选为162～168rpm。
50.本发明还提供了一种产高活性纤维素酶的复合菌剂在降解农村粪污污水中纤维素的应用，所述复合菌剂的使用量优选为污水质量的0.1～0.5％，更优选为0.2～0.4％，进一步优选为0.3％。
51.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
52.实施例1
53.本实施例提供了一种产高活性纤维素酶的复合菌剂，包括以下体积份数的菌剂：地衣芽孢杆菌40份、胶冻样类芽孢杆菌40份、枯草芽孢杆菌20份、酿酒酵母20份；所述各菌剂中菌的浓度为1.0
×
109个/ml。所述复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将地衣芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母分别活化培养，所述活化培养的具体步骤为：
①
将保存于-80℃冰箱的装有干粉菌种的安瓿瓶放在-20℃的冰箱中放置24h；
②
以沾有70％酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端；
③
滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以镊子敲破尖端；
④
向安瓿管中加入1ml培养液，待管中的固体溶解后将其加入已灭菌的lb培养液中进行活化培养。活化培养的温度为30℃，活化培养的时间为36h，活化培养时的震荡频率为160rpm，得到原种；(2)将步骤(1)得到的原种进行发酵扩大培养，发酵扩大培养时原种的接种体积比例为3％，所述发酵扩大培养的培养基为lb培养基，发酵扩大培养的温度为28℃，发酵扩大培养时搅拌的转速为120r/min，溶解氧为2mg/l，发酵菌液中微生物总菌数达到1
×
109个/ml时收集发酵菌液；(3)将步骤(2)得到的发酵菌液分别接种于纤维素酶富集培养基中培养，所述纤维素酶富集培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：牛肉膏1g/l、蛋白胨4g/l、纤维素粉22g/l、硫酸铵1g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、氯化钠0.2g/l、七水硫酸镁0.2g/l，所述纤维素酶富集培养基的ph值为7.1；所述培养的温度为28℃，培养的时间为48h，培养时震荡频率为160rpm；(4)将步骤(3)得到的菌液混合得到产高活性纤维素酶的复合菌剂。
54.实施例2
55.本实施例提供了一种产高活性纤维素酶的复合菌剂，包括以下体积份数的菌剂：地衣芽孢杆菌30份、胶冻样类芽孢杆菌35份、枯草芽孢杆菌15份、酿酒酵母20份；所述各菌剂中菌的浓度为1.3
×
109个/ml。所述复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将地衣芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母分别活化培养，所述活化培养的具体步骤为：
①
将保存于-80℃冰箱的装有干粉菌种的安瓿瓶放在-20℃的冰箱中放置24h；
②
以沾有70％酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端；
③
滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以镊子敲破尖端；
④
向安瓿管中加入1ml培养液，待管中的固体溶解后将其加入已灭菌的lb培养液中进行活化培养。活化培养的温度为28℃，活化培养的时间为24h，活化培养时的震荡频率为165pm，得到原种；(2)将步骤(1)得到的原种进行发酵扩大培养，发酵扩大培养时原种的接种体积比例为2％，所述发酵扩大培养的培养基为lb培养基，发酵扩大培养的温度为30℃，发酵扩大培养时搅拌的转速为100r/min，溶解氧为2.5mg/l，发酵菌液
中微生物总菌数达到1.2
×
109个/ml时收集发酵菌液；(3)将步骤(2)得到的发酵菌液分别接种于纤维素酶富集培养基中培养，所述纤维素酶富集培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：牛肉膏2g/l、蛋白胨5g/l、纤维素粉25g/l、硫酸铵1.5g/l、磷酸二氢钾1.0g/l、氯化钠0.5g/l、七水硫酸镁0.5g/l，所述纤维素酶富集培养基的ph值为7.2；所述培养的温度为30℃，培养的时间为36h，培养时震荡频率为165rpm；(4)将步骤(3)得到的菌液混合得到产高活性纤维素酶的复合菌剂。
56.实施例3
57.本实施例提供了一种产高活性纤维素酶的复合菌剂，包括以下体积份数的菌剂：地衣芽孢杆菌35份、胶冻样类芽孢杆菌30份、枯草芽孢杆菌20份、酿酒酵母15份；所述各菌剂中菌的浓度为1.5
×
109个/ml。所述复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将地衣芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母分别活化培养，所述活化培养的具体步骤为：
①
将保存于-80℃冰箱的装有干粉菌种的安瓿瓶放在-20℃的冰箱中放置24h；
②
以沾有70％酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端；
③
滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以镊子敲破尖端；
④
向安瓿管中加入1ml培养液，待管中的固体溶解后将其加入已灭菌的lb培养液中进行活化培养。活化培养的温度为32℃，活化培养的时间为48h，活化培养时的震荡频率为170rpm，得到原种；(2)将步骤(1)得到的原种进行发酵扩大培养，发酵扩大培养时原种的接种体积比例为5％，所述发酵扩大培养的培养基为lb培养基，发酵扩大培养的温度为32℃，发酵扩大培养时搅拌的转速为150r/min，溶解氧为3mg/l，发酵菌液中微生物总菌数达到1.5
×
109个/ml时收集发酵菌液；(3)将步骤(2)得到的发酵菌液分别接种于纤维素酶富集培养基中培养，所述纤维素酶富集培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：牛肉膏3g/l、蛋白胨6g/l、纤维素粉28g/l、硫酸铵2g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、氯化钠1g/l、七水硫酸镁1g/l，所述纤维素酶富集培养基的ph值为7.3；所述培养的温度为32℃，培养的时间为72h，培养时震荡频率为170rpm；(4)将步骤(3)得到的菌液混合得到产高活性纤维素酶的复合菌剂。
58.实验例1单一菌株有机质降解实验
59.将产纤维素酶活性较高的地衣芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母四株单菌，分别接种于纤维素酶富集培养基中，37℃摇床培养24h后，以5％的接种量分别接种在装有100ml取至化粪池底泥的三角瓶中，每个样品做6个平行，分别在30℃，160r/min条件下摇床培养，取2、3、4天的样品，每个样品取2个平行测定mlss，计算平均值，对照组接种等体积的不含菌株的纤维素富集培养液。初始底泥的mlss为2832mg/l，结果如表1所示：
60.表1：单一菌株对有机质的降解
[0061][0062]
从表1中可以看出，对比对照组来看，单一菌株的投加后都能产生较好的有机质分解效果，其中地衣芽孢杆菌的效果最好。在有机质分解过程中，出现去除率先升高后降低的情况，分析其中的原因是微生物在最初培养的1天内可以利用水样中的营养物质生长，第二天营养物质耗尽，而且微生物开始从生长的稳定期进入衰亡期，第三天微生物大多数处于衰亡期，菌体发生自溶，释放出一些内生水解酶降解了细胞壁、细胞膜的大分子成分，同时导致活性污泥絮体结构遭到破坏。絮体结构的破坏让这些微生物产生的酶能够渗透到衰老的絮体中，导致结构进一步解体，从而产生更多小分子物质被微生物利用，再次产生更多的生物酶，达到有机质降解的效果，但因新生的微生物利用营养物质，其数量增加会形成新的絮体，但是总体上活性污泥还是减少的。
[0063]
实验例2复合菌剂有机质降解实验
[0064]
将菌种分别接种于纤维素酶富集培养基中，在37℃摇床培养24h后，以体积比v(地衣芽孢杆菌)：v(胶冻样类芽孢杆菌)：v(枯草芽孢杆菌)：v(酿酒酵母)，混合后接种于装有100ml取至化粪池底泥的三角瓶中，检测有机质的分解效果，有机质的初始mlss为2682mg/l，如表2所示：
[0065]
表2：复合菌株在不同配比条件下对有机质的分解
[0066][0067]
从表2中可以看出，复配比例为2:2:1:1、培养3天时，有机质的分解效果最好，高达13.91％，比单一的任何一株单菌的效果都好。由于底泥的有机质中含有的纤维物质，在纤维酶的作用下加速分解，而且底泥中的絮体的胞外物质主要是碳氢化合物和蛋白质组成，所以菌体自溶后导致絮体结构破坏，使这些物质被微生物加以利用。同样在第四天出现了
分解效果下降的现象，原因还是微生物利用分解产物自身又生长起来，导致有机质增加，但是总体的有机质分解效果还是非常明显。
[0068]
实验例3产纤维素酶活测定
[0069]
将产纤维素酶活性较高的地衣芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母四株单菌，按照体积比为1:1:1:1、1:2:1:2、2:1:2:1、1:1:2:2和2:2:1:1进行混合后培养10天，于第二天开始每天取样并测定其纤维素酶活，测定结果见图1。由图中可以看出，复合菌剂产纤维素酶活均在4.88u/ml以上，复合菌剂能够产生大量纤维素酶。
[0070]
实验例4纤维素降解性能测定
[0071]
滤纸崩解培养基：(nh4)2so41.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，kh2po41.0g/l，酵母膏0.1g/l，1/4片滤纸/三角瓶，ph7.0；滤纸条崩解实验可以反映不同菌株所分泌的各种纤维素酶的综合酶活力水平。用无菌水将所获得的地衣芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母四株单菌分别菌悬液，按照体积比为1:1:1:1、1:2:1:2、2:1:2:1、1:1:2:2和2:2:1:1进行混合后分别接种2ml于装有100ml滤纸条崩解培养基的250ml三角瓶中，摇床培养(30℃，130r/min)，定期观察滤纸条崩解情况，测定结果见图2，图中从左到右依次为空白对照组(接种等体积不含菌剂的培养液)、接种体积比1:1:1:1组、接种体积比1:2:1:2组、接种体积比2:1:2:1组、接种体积比1:1:2:2组和接种体积比2:2:1:1组。
[0072]
对比纤维素酶活性测定和滤纸崩解实验，可以得出菌株地衣芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母按照一定比例混合后的复合菌剂针对有机质的降解具有很好的作用，这与纤维素酶活性较高的几株菌能对应，并且按照一定体积比混合后的复合菌剂也能够产生大量纤维素酶。
[0073]
由以上实施例可知，本发明提供了一种产高活性纤维素酶的复合菌剂及其制备方法和应用，本发明所述复合菌剂能够解决传统化粪池中有机质的分解速度慢、清掏频率大、化粪池出水的污水系统负荷增加、运行要求和维护成本等问题，能够有效分解水中纤维素，使污水处理中以污泥形式存在的纤维素的量得以减少，减轻处理负荷。
[0074]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。