一种靶向线粒体外膜转位因子复合体TOM20亚基的纳米抗体及其应用的制作方法

一种靶向线粒体外膜转位因子复合体tom20亚基的纳米抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及一种靶向线粒体外膜转位因子复合体tom20亚基的纳米抗体及其应用。


背景技术：

2.线粒体含有约1000-1500个蛋白质，其中99%由核基因编码，且大部分线粒体蛋白在胞质内翻译后通过线粒体转运酶复合体（the translocase of the outer mitochondrial membrane，tom）运送至线粒体内行使相应功能。tom是由7个亚基组成的膜蛋白复合体，其中tom20作为tom 复合体中最重要的受体亚单位，负责线粒体转运蛋白质的第一步，从众多蛋白中直接识别具有n端前导序列的前体蛋白，然后将其传递给tom40 蛋白复合体。tom20由三个结构域构成，即线粒体膜间隙区域（1-6）、跨膜区域（7-24）和胞质区域（25-145）。由于tom20只定位在线粒体外膜，其通常可作为线粒体的marker。
3.遗传性氧化磷酸化障碍导致的临床和遗传异质性疾病，称为线粒体疾病。线粒体dna以及编码线粒体蛋白的核基因发生突变是导致线粒体疾病的主要因素。在过去三十年中，在近290个基因中发现了导致这些疾病的突变，但许多患者仍然没有得到分子诊断。线粒体生物学和遗传学的复杂性仍是了解线粒体疾病分子机制的难点，所以到目前为止仍没有方法能够有效治疗线粒体疾病。
4.鉴于线粒体的重要性，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体dna等成分的结构、功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段。目前精提线粒体的方法主要是通过密度梯度离心，耗时长达数小时。而因细胞内很多生理生化反应十分迅速，有些蛋白或其它分子的半衰期很短，很难捕捉到，不利于对线粒体疾病分子机制的研究。因此我们希望能够开发一种新型的快速提取线粒体的方法，即利用tom20的纳米抗体通过免疫共沉淀的方法拉取线粒体。
5.除此之外，有研究表明，在药物诱导的癌细胞死亡中，线粒体在细胞信号、凋亡调节和能量代谢中发挥重要作用。因此，线粒体也被认为是癌症化疗的重要靶点。巨自噬是细胞内的一种降解途径，可以去除蛋白质，以及更大的细胞器，如功能失调的细胞器和细胞内病原体等。tom20的纳米抗体可以特异性靶向线粒体，利用自噬靶向嵌合体（auto-phagy-targeting chimera，autac）技术，可将线粒体递送至溶酶体，从而清除线粒体以达到治疗肿瘤以及其他线粒体相关疾病的目的。
6.噬菌体展示筛选技术是一种高通量快速鉴定与特定靶标分子结合的多肽或者抗体片段的方法。应用常规的分子生物技术，可以将大容量的多肽或者蛋白/抗体片段基因构建到噬菌体基因组中，利用噬菌体基因表型与蛋白表型的直接对应关系，从而将基因对应的多肽、蛋白/抗体片段表达在噬菌体外壳蛋白上。研究者可以在较短的时间内通过几轮的结合-漂洗-洗脱-扩增的生物筛选，得到和既定靶标分子的结合多肽、蛋白或者抗体片段。因此，如果研究者使用各种疾病的靶点蛋白作为研究对象，将纯化的蛋白包被在固体介质
（譬如elisa板中），筛选噬菌体多肽或者抗体文库，经过三到四轮的筛选，就可以得到与这一靶标蛋白特异结合的多肽或者抗体，而这些得到的多肽或者抗体1）可以作为载体，标记造影剂对疾病做分子图像诊断；2）可以与各种各样的化学药物、生物药（细胞因子、蛋白、免疫毒素）等偶联，对疾病做靶向治疗，降低药物使用量和副作用；3）某些多肽或者抗体，本身就具有激动或拮抗靶标蛋白功能的作用。目前为止，已有大量的通过噬菌体筛选鉴定的多肽或者抗体进入临床或者临床前试验阶段，被用于各种疾病的治疗或者作为载体进行靶向分子诊断和靶向治疗。
7.单域抗体（single-domain antibody，sdab）是一类仅由重链构成的抗体，是在驼类和软骨鱼类中天然存在的一种抗体形式。与传统抗体相比，单域抗体缺乏ch1结构域以及轻链；其功能仅仅依靠重链可变区来识别抗原。去除fc段的单域抗体也称为纳米抗体，其晶体宽为2.5nm，长4nm，分子量仅为传统完整抗体的1/10（约15kda），但依然具有完整的抗原识别能力。由于纳米抗体与人类抗体的vh的序列存在高度相似性，所以其作为治疗性抗体对人体并不具有很强的免疫原性。纳米抗体由于较小的分子量，其具有易于使用原核系统表达纯化，强的组织穿透性，并且展示较好的溶解度和对一定范围ph和温度的稳定性。同时纳米抗体易于通过基因工程进行修饰和改造或者进行各种化学标记，可以在较短时间内产生功能性抗体制剂。
8.噬菌体纳米抗体库已经被广泛使用来筛选鉴定各种靶标的纳米抗体，通过筛选构建好的天然纳米抗体文库或者免疫驼类后制备的免疫噬菌体纳米抗体文库，可以在两到三周的时间或者两到三个月内得到和靶标蛋白结合的纳米抗体。
9.目前鲜有关于靶向线粒体tom复合体的纳米抗体的报道。


技术实现要素：

10.本发明通过使用由超过103只羊驼外周血构建的天然大容量噬菌体纳米抗体文库，筛选与tom20线粒体外膜区结构域结合的纳米抗体，通过三轮的筛选后，随机挑取200个噬菌体克隆进行噬菌体elisa进行初步验证，将初步验证的阳性克隆进行测序分析，最后挑取其中六条序列进行验证，发现p2b7号纳米抗体与tom20具有较高的亲和力，且有较强的稳定性、易制备性、高产量高。
11.基于以上研究结果，本发明要求保护如下技术方案：一种靶向线粒体外膜转位因子复合体tom20亚基的纳米抗体，所述纳米抗体的互补决定区包括如seq id no.1所示的氨基酸序列cdr1、seq id no.2所示的氨基酸序列cdr2和seq id no.3所示的氨基酸序列cdr3。
12.所述纳米抗体的骨架区包括如seq id no.4所示的氨基酸序列fr1、seq id no.5所示的氨基酸序列fr2、seq id no.6所示的氨基酸序列fr3和seq id no.7所示的氨基酸序列fr4。
13.所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.8所示。
14.本发明还要求保护一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述任一所述的纳米抗体。
15.本发明还要求保护一种表达载体，所述表达载体含有前述的多核苷酸。
16.优选地，所述表达载体为pet-14b或pet28a-sumo。
17.本发明还要求保护一种重组细胞，所述重组细胞内包含前述的表达载体，或其基
因组中整合有前述的多核苷酸。
18.本发明还要求保护一种纳米抗体噬菌体，所述噬菌体的表面包括上述任一所述的纳米抗体。
19.本发明还要求保护一种用于检测线粒体外膜转位因子复合体tom20亚基的试剂盒，包括上述任一所述的纳米抗体或前述的纳米抗体噬菌体。
20.本发明还要求保护上述任一所述的纳米抗体的以下任一应用：1）用于检测线粒体外膜转位因子复合体tom20亚基；2）用于制备线粒体外膜转位因子复合体tom20亚基检测试剂或试剂盒；3）用于线粒体外膜转位因子复合体tom20亚基的富集和纯化；4）用于制备线粒体外膜转位因子复合体tom20亚基的富集和纯化试剂。
21.本发明具有如下有益效果：通过使用由超过103只羊驼外周血构建的天然大容量噬菌体纳米抗体文库，筛选与tom20线粒体外膜区结构域结合的纳米抗体，通过三轮的筛选后，随机挑取200个噬菌体克隆进行噬菌体elisa进行初步验证，将初步验证的阳性克隆进行测序分析，最后挑取其中六条序列进行验证，发现p2b7号纳米抗体与tom20具有较高的亲和力，且有较强的稳定性、易制备性、高产量高，在细胞水平验证了它与tom20蛋白的结合情况和特异性。
22.本发明的p2b7号纳米抗体可应用于：1）纳米抗体通过靶向tom20快速体外纯化细胞线粒体，以便研究线粒体疾病的分子机制；有望开发一种新型的快速提取线粒体的方法，即利用tom20的纳米抗体通过免疫共沉淀的方法拉取线粒体。
23.2）靶向线粒体tom20的纳米抗体可通过与自噬蛋白lc3等的纳米抗体融合，利用自噬靶向嵌合体（auto-phagy-targeting chimera，autac）技术，将线粒体递送至溶酶体以消除疾病细胞内的线粒体，从而诱导疾病细胞内线粒体的降解，以达到治疗肿瘤以及其他线粒体相关疾病的目的。
24.3）靶向线粒体tom20的各种诊断和治疗策略。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.其中：图1a是 tom20胞质结构域示意图；图1b是tom20（人和鼠）胞质结构域表达纯化后电泳考马斯亮蓝染色；图1c是tom20纳米抗体文库筛选效价。
27.图2a是elisa筛选得到的重复次数》2且tom20/bsa ratio》3的纳米抗体序列；图2b是sds-page鉴定结果；图2c是his-tag western blot鉴定结果；图2d是纯化的纳米抗体与tom20-human进行初步elisa验证，结果显示p2b7与tom20-human有较强结合；图2e是对照蛋白gfp与tom20-human的 elisa验证，结果显示gfp与tom20-human无结合活性。
28.图3a是p2b7与tom20-human的结合elisa检测结果；图3b、3c分别是biacore检测
p2b7纳米抗体与tom20-human、tom20-mouse抗原蛋白的亲和力结果，显示p2b7与2种抗原均能结合；图3d是利用激光共聚焦显微镜观察hela细胞内的线粒体与p2b7的共定位实验，结果显示p2b7能够定位在线粒体上。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中的实验方法步骤，如无特殊说明，均为本领域的常规方法步骤；所有生物、化学试剂，如无特殊说明，均为本领域的常规试剂，均可通过商购获得。
30.实施例1一、tom20胞质结构域表达纯化和纳米抗体筛选tom20线粒体胞质结构域蛋白（25-145）大小约 14 kd，结构域示意图如图1a所示，较适合作为纳米抗体筛选的靶蛋白。设计并合成tom20胞质结构域基因，经优化后合成，其核苷酸序列如seq id no.9所示，转化入大肠杆菌中进行诱导表达纯化，用于纳米抗体筛选。表达纯化步骤如下：a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，通过不同浓度（0.2 mm、0.4 mm、1 mm）的iptg（异丙基-β-d-硫代半乳糖苷）在16℃低温进行诱导条件摸索，最终确定用0.4 mm的iptg在16℃低温过夜进行诱导；b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000 w进行破菌；c)，17000 g，4℃离心30 min，取上清与ni填料4℃共孵育1小时；d)，梯度浓度咪唑洗脱目的蛋白；e)，ni柱纯化后进行分子筛分离以去除杂蛋白，akta参数设置0.5 ml流速/分钟，每1 ml收集一次。f)，根据电泳结果确定目的蛋白纯度，bca法测定蛋白浓度。
[0031] 采用免疫管法对由超过103只羊驼外周血构建的天然大容量噬菌体展示纳米抗体文库进行筛选，所选择的噬菌体展示库容量为2
×
109。筛选步骤如下：a)，将目的蛋白按50 μg/ml浓度包被在免疫管上，进行3轮富集筛选；b)，使用第三轮噬菌体洗脱液对文库编码抗体的基因进行测序。
[0032] 最后通过ni柱和分子筛纯化后我们得到了高纯度的目的蛋白用于后续纳米抗体筛选（图1b）。包被tom20胞质结构域进行三轮天然羊驼纳米抗体文库的筛选，三轮筛选后，噬菌体滴度显示文库被高度富集，提示有与tom20结合的纳米抗体被扩增，经过三轮噬菌体纳米抗体文库筛选之后，文库筛选效价由4
×
10
7 pfu/ml到4.4
×
10
9 pfu/ml，被富集了110倍（图1c）。
[0033]
二、噬菌体克隆elisa初步验证阳性克隆三轮筛选后，随机挑取200个噬菌体克隆，进行扩展和诱导纳米抗体的表达，使用噬菌体纳米抗体粗提物，与tom20包被的elisa板进行孵育，噬菌体抗体进行信号放大，与tom20结合的吸光值大于bsa对照2.5倍定义为阳性克隆；之后将阳性克隆提取质粒进行测序分析，提取序列获得纳米抗体蛋白序列，对序列进行对比分析，获得阳性序列的分布频率。
[0034]
通过 elisa单克隆验证技术，共得到88个阳性克隆，进行测序，测序结果显示有8
条无信号，80条正常。根据纳米抗体前后序列可以从测序结果中获得纳米抗体序列，将80条序列翻译成氨基酸后排序并进行多序列比对，共得到27条不同的纳米抗体序列。其中重复次数大于2次的克隆共12条（图2a），对其中6条重复次数较高且结合强于bsa三倍的纳米抗体序列进行表达纯化，其对应纳米抗体号分别为p2g2、p2g4、p2f4、p2h6、p2b7、p2f5（图2a）；进一步分别表达纯化这六条纳米抗体（图2b和2c），除p2g4未获得蛋白外，其余均获得高纯度重组蛋白；使用纯化所得纳米抗体，进行elisa初步验证，发现p2b7与tom20-human有明显结合，而与对照蛋白gfp无结合活性（图2d和2e），纳米抗体p2b7的氨基酸序列如下（seq id no.8）：mavqlvesggglvqaggslrlscvasgstfsnfvmgwyrqapgkqrvlvatissggstnyadsvkgrftisrdntkntvylqmnslkpedtsvyycnarrgsvivptlaydywgqgtqvtvss。
[0035]
三、纳米抗体的纯化表达将纳米抗体基因序列克隆入pet-14b（优宝生物）或pet28a-sumo（优宝生物）载体，同时融合表达血凝素标签（hemagglutinin ha tag）用于后续检测。表达纯化步骤如下：a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，使用0.2mm浓度的iptg在16℃低温进行诱导；b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000 w进行破菌；c)，17000 g，4℃离心30 min，取上清与ni填料4℃共孵育1小时；d)，梯度浓度咪唑洗脱目的蛋白；e)，ni柱纯化后进行分子筛分离以去除杂蛋白，akta参数设置0.5 ml流速/分钟，每1 ml收集一次。
[0036]
四、tom20纳米抗体的亲和力检测1、实验过程如下：（1）elisa实验此实验用来验证在体外表达纯化的纳米抗体与体外纯化的抗原蛋白是否能够直接相互作用。步骤如下：a)，将抗原蛋白用pbs稀释成10ug/ml，100ul/孔铺板，包被孔板，4℃静置过夜；b)，室温封闭2 h；c)，孵育不同浓度的纳米抗体，室温1h；d)，孵育二抗anti-ha hrp（北京义翘神州），室温1 h；e)，tmb显色；e)，终止液终止反应；g)，用酶标仪在450 nm处测定吸光值，并根据吸光值来制定曲线。
[0037]
（2）表面等离子共振实验（surface plasmon resonance，spr）此实验用来进一步验证抗原和纳米抗体的结合，并计算二者的平衡常数。纯化抗原蛋白被固定在芯片上，不同浓度的纳米抗体被顺序加入来分析与抗原蛋白的亲和力，记录360秒内的反应信号，制作动力学曲线，计算各相关参数。
[0038]
（3）纳米抗体与细胞线粒体的共定位实验复苏hela细胞，传代3次后将细胞接种在含有细胞爬片的24孔板中用于后续实验。具体步骤如下：a)，将细胞用pbs洗涤3次，4％多聚甲醛固定20分钟；b)，pbs洗涤3次，fdb（fluorescence dilution buffer: pbs containing 5% fetal bovine serum, 2% bsa, 0.1% saponin）稀释纳米抗体，使终浓度为2 um，室温与细胞孵育1 h；c)，pbs洗涤3次，用fdb按1:100稀释anti-ha和线粒体标记抗体coxiv，室温与细胞孵育1 h；d)，pbs洗涤3次，用fdb按1:100分别稀释alexa 488和594偶联的二抗，室温与细胞孵育1 h；f)，pbs洗涤3次，封片,待干燥后拍照。
[0039]
2、实验结果通过elisa进一步检测了p2b7纳米抗体与tom20胞质结构域的结合，结果（图3a）表
明p2b7和tom20显示较高的结合活性，但是与对照gfp蛋白基本不具有结合活性。表面等离子共振实验进一步发现p2b7纳米抗体不仅能够与tom20-human结合，还能与tom20-mouse结合，同时 p2b7与tom20-human和tom20-mouse的结合亲和常数kd分别为44.8 nm和412.6 nm（图3b和3c）。纳米抗体免疫荧光结果表明p2b7能够与细胞线粒体标记物coxiv共定位（图3d），结果显示p2b7纳米抗体可以特异性识别线粒体，其具备分离纯化线粒体的潜力。
[0040]
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。