一种提高核桃粕蛋白利用率的方法

1.本发明涉及核桃蛋白加工领域，尤其涉及一种提高核桃粕蛋白利用率的方法。


背景技术：

2.核桃(juglaus regia l.)又名胡桃、羌桃、万岁子，系胡桃科核桃属植物，是世界四大干果之一，素有“木本油料之王”的美称。中国作为世界核桃原产地之一，核桃种植面积和产量均位居世界第一。我国核桃的种植面积及产量呈逐年增长的趋势，2017年中国核桃种植面积超过6000万亩，产量超过330万吨。云南是我国核桃生产的第一大省，核桃种植面积为4230万亩左右，产量、产值和种植面积均位居全国首位，近年来，云南的核桃产量不断攀升，核桃供应量持续增长，但精深加工产品严重不足，核桃开发率依然较低，附加值始终不高，严重制约核桃产业健康发展。为推进云南核桃产业健康、可持续发展，同时又能带动其他特色农业产业以更高质量发展，云南省政府印发实施了《云南省核桃产业发展行动方案》。
3.核桃仁中含蛋白质、油脂、碳水化合物、矿物质元素等营养物质，有益于人体健康。据报道，经常食用核桃可以降低患心脏病的风险，fda批准了一项健康声明，指出包括核桃在内的饮食可以降低患心脏病的风险。此外，核桃仁中还含有大量的硫胺素、核黄素、烟酸、维生素b6、叶酸，以及人体需要的微量元素。
4.核桃蛋白是一种具有多种营养成分的均衡蛋白，核桃仁中蛋白质含量在20-25％之间，核桃粕中含有54％左右的蛋白质。其营养价值与动物蛋白非常相似，人体消化率可达87％。含有18种氨基酸，8种人体必需氨基酸含量合理，接近于世界卫生组织(who)和联合国粮农组织(fao)制定的国际标准对于成年人所必需的氨基酸的摄入量要求。但核桃蛋白中主要成分为谷蛋白(占70％左右)，导致其溶解性较差，其在食品工业中的应用受到限制。近些年来研究者尝试各种物理化学的改性方法来提高核桃蛋白的功能性质。目前，核桃蛋白的研究主要集中在蛋白质组成、提取、制备方法、功能特性和生物活性肽等方面。


技术实现要素：

5.本发明提供一种提高核桃粕蛋白利用率的方法，本发明以核桃粕为原料，通过酶解、超滤制备＞30kda的核桃肽，并对核桃肽进行糖基化修饰，使溶解性、乳化性、乳化稳定性、吸水性、吸油性、表面疏水性、dpph自由基清除力和抗脂质氧化能力均得以提高，提高了核桃蛋白在食品工业中的利用率。
6.为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种提高核桃粕蛋白利用率的方法，以核桃粕为原料提取核桃蛋白，酶解制得核桃蛋白多肽，再经过水热法制备糖基化核桃肽，用以提高核桃蛋白利用率；具体包括以下步骤：
7.步骤(1)由核桃粕中提取核桃蛋白，将核桃蛋白溶解，调节ph，加入木瓜蛋白酶进行酶解反应，超滤分离获得mw＞30kda的核桃蛋白多肽；
8.步骤(2)将获得mw＞30kda的核桃蛋白多肽与麦芽糊精进行糖基化反应；麦芽糊精
对多肽进行糖基化改性，乳化稳定性和乳化性明显改善；
9.步骤(3)冰浴结束反应，使用截留膜在蒸馏水中透析，除去未反应的糖，冻干制得糖基化核桃肽。
10.作为优选，所述mw＞30kda的核桃蛋白多肽与麦芽糊精的质量比为1：1-3，mw＞30kda的核桃蛋白多肽底物浓度为5-20mg/ml。
11.作为优选，步骤(2)反应时间为6-10h，反应温度为60-100℃。控制合适的底物比例、底物浓度、反应时间和反应温度，能够提高接枝度，降低褐变度。
12.作为进一步优选，mw＞30kda的核桃肽与麦芽糊精糖基化产物的最佳反应参数分别为：反应时间为8h、反应温度为80℃、肽与糖的比例为1∶2、底物浓度为15mg/ml。
13.作为进一步优选，步骤(1)详细操作如下：按照质量体积比1∶18-20的比例混合脱脂核桃粕粉与去离子水，0.8-1.5m naoh调ph到10-11，在50-55℃水浴下搅拌1-2h，离心取上清液，用0.8-1.5m hcl调ph为4.0-5.0，静置1-2h，离心，洗涤沉淀，调节ph至中性，经冷冻干燥得到核桃蛋白提取物；
14.将核桃蛋白加入提前预热的去离子水于50-60℃溶解，并调节ph至6.5-7.0，加入木瓜蛋白酶迅速混匀，在50-55℃边水浴边搅拌40-50min进行酶解，沸水浴15-20min灭酶，冰浴，离心，保留上清液；室温条件下将酶解液进行超滤，控制酶解液大约在20-30ml时加水补充至1l，得到mw＞30kda的核桃肽进行冷冻干燥后备用。
15.作为进一步优选，步骤(2)和步骤(3)详细操作如下：将核桃肽分别与麦芽糊精按1∶1～1：2.5混合，搅拌溶解，以0.8-1.5m naoh调节混合溶液的ph至8.0-9.0，室温条件下搅拌20-40min，在3-6℃冰箱下水合10-14h；然后将混合溶液置于恒温水浴锅70-85℃中进行反应6-10h，冰浴结束反应；使用截留膜在蒸馏水3-5℃透析20-25h，除去未反应的糖，冻干制得糖基化核桃肽。
16.本发明的工作原理如下：为了解决核桃蛋白难以溶解限制其在食品加工使用的难题，而核桃蛋白糖基化改性接枝度低，导致产率较低。故本发明以核桃粕为主要原料，利用木瓜蛋白酶对核桃蛋白进行有限程度的水解，然后通过超滤系统得到的水解产物按分子量分级，得到不同分子量的肽段，最后发现mw＞30kda分别与不同分子量的糖进行糖基化改性，制备得到的核桃肽溶解性、乳化性质，抗氧化性能优于其他分子量的多肽。以期应用于核桃肽产品的开发及作为功能性食品的辅料具有重要意义，同时对功能性的影响进一步研究。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本试验采用湿热法制备核桃肽-不同种类的糖发生糖基化反应，以乳化性质和抗脂质氧化能力为指标，分别对不同分子量的核桃肽-不同种类的糖的糖基化反应进行筛选，研究发现分子量大于30kda的核桃肽与麦芽糊精的乳化能力和抗脂质氧化能力明显改善。
18.在功能特性方面，肽-糖基化产物在ph值4.0-10.0范围内溶解性高于酶解物和糖基化改性产物的溶解性在ph值呈中性及弱碱性条件下溶解性极高，在理化特性方面，改善了乳化性、乳化稳定性、吸水/油性及表面疏水性，在抗氧性方面除了fe
2
鳌合能力没有改善，其余的dpph自由基清除力和抗脂质氧化能力都有不同程度的提高。利用激光共聚焦显微镜图显示：糖基化改性后的核桃肽对核桃油的包裹能力显著高于未糖基化之前的核桃肽。通过试验得到一条核桃肽糖基化改性的工艺参数，对核桃肽糖基化修饰在食品研究中
的应用具有重要意义。
附图说明
19.图1为各分子量多肽的电泳图；
20.图2为不同糖的种类对核桃肽糖基化产物乳化能力的影响；
21.图3为不同糖种类对＞30kda肽糖基化产物抗脂质氧化能力的影响；
22.图4为糖基化反应时间(a)、反应温度(b)对接枝反应的影响；
23.图5为糖基化反应底物浓度(a)、肽-糖比例(b)对接枝反应的影响；
24.图6为糖基化产物的sds-page分析a:考马斯亮蓝染色、b:pas糖蛋白染色；
25.图7＞30kda核桃肽和＞30kda核桃肽-麦芽糊精糖基化产物的傅里叶变换红外光谱图；
26.图8＞30kda核桃肽和＞30kda核桃肽－麦芽糊精糖基化产物的圆二色谱图；
27.图9为不同ph值条件下核桃肽及其糖基化产物的溶解性；
28.图10为酶解液(a)、核桃肽(mw＞30kda)-麦芽糊精糖基化产物(b)制备的乳状液的激光共聚焦显微镜图；(a):nile blue对糖和蛋白染色(b)nile red对油的染色染色，(c)nile blue和nile red信号的叠加图。
具体实施方式
29.下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
30.实施例1
31.主要材料试剂
32.核桃粕云南摩尔农庄生物科技开发有限公司；葡萄糖、蔗糖昆明市经开发区丰源食品厂；乳糖郑州洁尚生物科技有限公司；麦芽糊精山东西王糖业有限公司；葡聚糖上海阿拉丁生化科技股份有限公司；bca蛋白试剂盒碧云天生物技术有限公司；邻苯二甲醛试剂(opa)、dpph自由基、卵磷脂上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫代巴比妥酸(tba)、三氯乙酸(tca)上海索莱宝生物科技有限公司。
33.主要仪器设备
34.数显恒温水浴锅国华电器有限公司；高速冷冻离心机湖南湘立科学仪器有限公司；高速分散器宁波新芝生物科技股份有限公司；激光共聚焦扫描显微镜日本奥林巴斯公司；电泳设备。
35.数据处理
36.每组实验均重复3次，采用excel 2003进行实验数据整理，采用graphpad prism 5.0软件作图。使用spss 19.0软件进行单因素试验数据方差分析以及差异显著性分析，p＜0.05表示差异显著。
37.本实施例制备方法如下：
38.(1)核桃脱脂粕粉：将核桃粕45℃-50℃进行烘干，粉碎过60目筛，采用核桃粕：正己烷以1:5(w/v)料液比搅拌浸提2h，然后进行抽滤，收集残渣进行二次提取(可继续进行第三次浸提直到滤液为无色透明)，过滤收集脱脂核桃粕粉，置于通风橱挥干残留溶剂。将脱
脂核桃粕用粉碎机二次粉碎后过150目筛，即为核桃脱脂粕粉，置于4℃下冷藏备用。
39.(2)核桃脱脂粕粉：将核桃粕45℃-50℃进行烘干，粉碎过60目筛，采用核桃粕：正己烷以1:5(w/v)料液比搅拌浸提2h，然后进行抽滤，收集残渣进行二次提取(可继续进行第三次浸提直到滤液为无色透明)，过滤收集脱脂核桃粕粉，置于通风橱挥干残留溶剂。将脱脂核桃粕用粉碎机二次粉碎后过150目筛，即为核桃脱脂粕粉，置于4℃下冷藏备用。
40.(3)核桃分离蛋白：将核桃脱脂粕粉按照1:20(w/v，质量体积比)的料液比加入去蒸馏水溶解，调节溶液的ph值为11，于53℃进行磁力搅拌2h，然后在4℃下以离心(4000rpm，15-20min)，取上清液，调整上清液ph值4.5(4.5-5.0)，4℃静置1h，然后在4℃下以离心(4000rpm，20min)，收集沉淀，用蒸馏水水洗至中性，最后真空冷冻干燥得到核桃分离蛋白，置于4℃条件下冷藏备用。
41.(4)酶解：先将蒸馏水预热60℃-65℃，再将核桃分离蛋白配成3％的溶液，调节溶液ph值为6.8，加入木瓜蛋白酶(w/v＝3％)，在50℃-55℃边水浴边搅拌进行酶解40min(20-40min)，沸水浴加热15min，灭酶，冷却至室温后离心(4000rpm，20min)，保留上清液。
42.(5)超滤：上清液先经过微膜抽滤，再进行超滤，分离得到核桃肽。进口压力为10psi，出口压力为5psi。当截留体积约20-30ml时加水补充至1l，每一道膜过两遍。将超滤后的》30kda核桃肽进行真空冷冻干燥后置于-20℃备用。将酶解液按照分子量从高到低逐级超滤分级(mw＞30kda、10kda＜mw＞30kda、mw＜10kda)，各分子量多肽电泳图图1所示。控制酶解液大约在20-30ml时加水补充至1l，每一道膜过三遍。将超滤分级后的不同分子量核桃肽进行冷冻干燥后置于-18℃备用。
43.(6)糖基化反应：将不同分子量的核桃肽分别与麦芽糊精1:2(w/w)混合，以蒸馏水搅拌溶解，配制成质量分数为3％的溶液，调节溶液ph值至8.5，磁力搅拌器恒定磁力搅拌30min，置于4℃冰箱中过夜(12h)，充分水合。待室温后置于80℃恒温水浴中反应8h。
44.(7)透析：反应8h之后，迅速冷却至室温，在4℃条件下，使用1000da的截留膜在蒸馏水透析24h，每隔6h换一次水，除去未反应的糖。
45.(8)真空冷冻干燥：将透析好的样品放在-80℃冷冻过夜，在进行真空冷冻干燥3-4d，真空冷冻干燥冷凝温度(-48℃至-55℃)、真空度在20pa以下稳定不变的情况下，从真空冷冻干燥取出就得到糖基化产物。
46.(9)糖基化产物：将真空冷冻干燥好的样品放在-20℃，备用。
47.本实施例以核桃肽的乳化能力及抗脂质氧化能力为参考指标，研究三种不同分子量的核桃肽(mw＜10kda、10kda＜mw＞30kda、mw＞30kda)与糖(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糊精、葡聚糖(40kda))的最优组合。
48.不同糖种类对核桃肽糖基化产物功能性质的影响
49.糖类的选择、糖分子量的大小和糖的结构特性不但影响糖基化的接枝程度、对糖基化产物的功能性质也有直接的影响。本实验分别选取了葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糊精及葡聚糖(40kda)作为实验用糖。测定糖基化产物的乳化性质及抗脂质氧化能力。
50.不同糖种类对核桃肽糖基化产物的乳化性质的影响
51.在温度为80℃、体系ph值为8.5、多肽与糖比例为1∶1，底物(核桃肽)浓度为5mg/ml水浴加热条件下，将不同分子量的多肽分别与五种糖进行糖基化反应。由图2显示，与酶解液相比，不同分子量的核桃肽与糖发生糖基化反应后，乳化性质改善情况为分子量大的糖
基化产物的乳化性质增强较显著，分子量小的核桃肽乳化性质改善不理想。其中葡萄糖和麦芽糊精的糖基化产物乳化性明显改善，乳糖的糖基化产物乳化性次之。但乳化稳定性明显改善的是麦芽糊精、葡聚糖的糖基化产物。
52.综合乳化性和乳化稳定性结果得出麦芽糊精与大于30kda核桃肽糖基化产物改善最明显，其余的不是乳化性改善明显，就是乳化稳定性改善明显。糖链越长，其空间位阻越大，增加了糖链接入蛋白质肽链的难度，但糖链的延长显著提高了改性产物的乳化性，随着糖链的延长，乳化性提高的越来越高。研究发现，核桃蛋白水解产物中对乳化性质最有利的主要是大分子量部分(》30kda)，小分子量的核桃肽乳化性质较差。
53.不同糖种类对核桃肽糖基化产物抗脂质氧化能力的影响
54.以分子量大于30kda核桃肽及酶解液分别与五种糖进行糖基化反应，测定在温度为80℃、体系ph值为8.5、多肽与糖比例为1∶1，底物浓度为5mg/ml糖基化产物及核桃蛋白酶解液的抗脂质氧化能力。结果如图3所示，与酶解液相比，除了蔗糖组外，各糖基化产物的抗脂质氧化能力均得到增强，其中葡萄糖糖基化产物表现出最强的抗脂质氧化能力，麦芽糊精及葡聚糖糖基化产物的抗脂质氧化能力次之，乳糖的糖基化产物抗脂质氧化能力仅比酶解液略高，蔗糖的糖基化产物抗脂质氧化能力最差。这可能是由于葡萄糖分子量比较小、反应迅速，反应产生的类黑精比较多。
55.由于核桃蛋白与麦芽糊精的连枝度较低(最高为27.49％)，导致产品产率较低。同时核桃多肽抗氧化能力较核桃蛋白显著提高，可进一步提高包裹核桃油脂的稳定性及抗氧化能力，故因此本发明重点研究了大分子量肽(》30kda)糖基化产物的工艺条件及功能性质。
56.核桃肽糖基化接枝反应条件的筛选
57.综合上述结果可知分子量大于30kda的核桃肽与麦芽糊精的糖基化接枝产物的乳化性、乳化稳定性及抗脂质氧化能力均明显改善。因此，进一步研究了分子量大于30kda的核桃肽和麦芽糊精的糖基化反应条件，以确定最佳修饰条件。
58.分子量大于30kda的核桃肽与麦芽糊精糖基化接枝反应受很多因素影响，如肽与糖的配比、反应温度、反应时间等，而糖基化接枝反应的程度和糖基化改性产物的功能性质则是多种因素共同作用的结果。糖基化反应以美拉德反应为基础，即蛋白质的ε-氨基和多糖的还原羰基之间的反应，可以通过接枝度和褐变强度评价反应程度。
59.本发明以核桃肽糖基化的接枝度及褐变度为参考指标，筛选核桃肽与糖质量比例(1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1)、反应时间(2h、4h、6h、8h、10h)、底物(核桃肽)浓度(5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml)、反应温度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)等对接枝反应及产物功能性质的影响，确定接枝反应条件。
60.接枝度测定参照现有方法配制opa试剂。将待测样品溶液中加入opa试剂，均匀混合后反应，然后采用紫外-可见分光光度计测定340nm波长处的吸光度，以蒸馏水替代样品作为试剂空白。接枝度的计算公式：
[0061][0062]
其中：a0：糖基化反应前混合溶液中自由氨基的含量，mol/l；
[0063]at
：糖基化反应后溶液中自由氨基的含量，mol/l；
[0064]
糖基化产物的褐变度测定对现有褐变度测定的研究方法进行改进，取1.0ml样品液加入1.0ml稀释液(含10％(w/w)sds及0.05mol/l硼砂)，以稀释液作空白，在420nm下测定。
[0065]
核桃肽(＞30kda)-麦芽糊精糖基化接枝反应条件的确定
[0066]
糖基化反应时间(a)对接枝反应的影响在分子量大于30kda的核桃肽与麦芽糊精的质量比1∶1、反应温度80℃、底物浓度5mg/ml条件下研究反应时间对肽糖基化产物的接枝度和褐变度的影响。糖基化反应时间对核桃肽与麦芽糊精糖基化接枝反应的影响如图4(a)所示，随反应时间的延长，接枝度不断升高，在4-6h变化最明显，反应8h，接枝度达到最大，8h后接枝度变化不明显，再往后接枝度仍然会上升，但是幅度不大；而褐变程度随时间的增加呈逐渐增加，反应体系颜色逐渐变深，因为美拉德反应会形成棕色褐变产物，但过高的褐变度会对产品的感官色泽产生不利的影响。导致褐变度这一现象是由于前期暴露在多肽表面的游离氨基可以较快的与糖接触反应，之后内部的氨基参与反应需要蛋白质结构发生一定变化。且随加热时间延长，美拉德反应进一步发生，高级阶段产生的类黑精等含氮聚合物不溶于水、明显的褐变，导致产物感官质量及功能特性降低。结合考虑能源损耗，最终选择反应时间8h进行后续研究。
[0067]
反应温度对接枝反应的影响研究表明，温度能够提高美拉德反应速率，加快反应进程。如图4(b)可知，接枝度随反应温度的升高呈现升高趋势，并均在100℃达到最大，温度过高时导致蛋白之间也发生了不同程度的聚集，使反应体系中不溶性组分显著增多，不利于反应的进行，从而降低了接枝度；而褐变程度呈现不断增加的趋势。反应温度是影响糖基化反应的重要因素，温度较低时无法活化结合位点导致反应较为缓慢，随着反应温度的升高，核桃蛋白内部的疏水基团不断暴露出来，使蛋白质的结构得以伸展，糖基化反应更容易进行。考虑到反应温度过高时蛋白质会变性，选择80℃作为反应温度进行后续研究。
[0068]
底物浓度对接枝反应的影响在分子量大于30kda的核桃肽与麦芽糊精的质量比1∶1、反应时间8h、反应温度80℃条件下研究底物浓度对肽糖基化产物的接枝度和褐变度的影响。蛋白的反应浓度是决定反应的量，蛋白质的量会影响蛋白与糖基化学碰撞中的接触几率，直接决定了反应的程度。不同底物浓度对接枝反应的影响如图5(a)所示，随着反应体系中核桃肽浓度的增加，接枝度呈现先增加到15mg/ml之后开始下降的趋势，褐变度随浓度的上升呈现先上升后下降的趋势，结果发现接枝度与褐变度的变化趋势是一致的。这可能是由于随着底物浓度的增加，反应底物分子间的碰撞几率增加，有利于反应进行，然而当底物浓度过大，则可能导致溶液粘度上升，束缚了反应物分子，不利于反应的进行，降低了反应速率。考虑到反应程度及经济问题，选择底物浓度15mg/ml进行后续研究。
[0069]
肽-糖比例对接枝反应的影响在只有两种反应物的化学反应中，其中一种反应物用量一定时，另一种反应物用量的变化将决定反应的程度和速度。由图5(b)可知，当核桃肽与麦芽糊精比例为1∶2时，糖基化接枝程度最大，当比例为1∶1时接枝反应程度最低，褐变度呈先上升后降低的趋势。实验结果的原因可能是当糖的比例较高时反应体系中活性位点接触的机会随之增加，有利于糖基化反应的发生。
[0070]
综上所述，采用湿热法制备不同分子量的核桃肽-不同种类的糖发生糖基化反应，以乳化性质和抗脂质氧化能力为指标，分别对不同分子量的核桃肽-不同种类的糖的糖基化反应进行筛选，研究发现分子量大于30kda的核桃肽与麦芽糊精的乳化能力和抗脂质氧
化能力明显改善，在此基础上以接枝度和褐变度为指标，确定大于30kda的核桃肽与麦芽糊精糖基化产物的最佳反应参数分别为：反应时间为8h、反应温度为80℃、核桃肽与糖的比例为1∶2、底物浓度为15mg/ml。
[0071]
核桃肽(＞30kda)-麦芽糊精糖基化产物的结构表征
[0072]
sds-page从核桃肽分子量的角度证实了糖蛋白大分子聚合物的生成。参照现有方法选择浓度为4％的浓缩胶和浓度为12％的分离胶。将蛋白样品以蒸馏水稀释至蛋白浓度为15mg/ml，控制蛋白样品的上样量为12μl。电压设置为50v通过浓缩胶部分，进入分离胶后，电压设置为120v。所有蛋白样品制备两块凝胶，一块用于考马斯亮蓝g250染色，一块用于pas染色(schiff试剂染色)。
[0073]
图6是核桃肽(＞30kda)和糖复合物的凝胶电泳结果，对照组为80℃处理的核桃肽(＞30kda)。蛋白染色(a)结果显示核桃肽(＞30kda)主要有3个主要条带，分子量主要集中在55kda，40kda两个主要区域。对比核桃肽(＞30kda)，仅经加热处理的核桃肽(＞30kda)在40kda，55kda附近的特征条带的颜色变浅。麦芽糊精修饰后核桃肽(＞30kda)的55kda条带颜色变深，在分离胶上端出现新的条带，说明麦芽糊精修饰与核桃肽(＞30kda)共价结合导致核桃肽分子量增大。在糖蛋白染色图谱中(b)，麦芽糊精与核桃肽(＞30kda)糖基化修饰后，在核桃肽(＞30kda)-麦芽糊精条带的分离胶上端区域出现糖蛋白聚合物，说明核桃肽(＞30kda)的糖基化改性产物中具有含有糖链的高分子量蛋白产物，这些结果均证明麦芽糊精与核桃肽(＞30kda)通过糖基化反应生成共价复合物。
[0074]
ftir光谱分析ftir是一种研究蛋白-多糖共聚物结构的有效手段，可以测量蛋白质中的功能性基团和高极性键的振动。为了考察＞30kda核桃肽与糖分子之间是否形成共价键，对＞30kda核桃肽和＞30kda核桃肽-麦芽糊精糖基化产物进行红外光谱分析。如图7所示，＞30kda核桃肽-麦芽糊精糖基化产物相较于＞30kda核桃肽本身在1024cm-1
和1403cm-1
处有较强的吸收峰，根据表1，这两处吸收分别是c-o键和c-n键的伸缩振动，结果表明了＞30kda核桃肽与麦芽糊精之间形成了共价键。1658cm-1
和1546cm-1
分别是c＝o键的伸缩振动和-n-h键的平面弯曲振动，代表了酰胺ⅰ带和酰胺ⅱ带。糖基化产物在酰胺ⅱ带的吸收光谱有所增强，也说明了共价键的形成。此外，2929cm-1
和3378cm-1
处的吸收分别表示-c-h(sp3)键的反对称伸缩振动和-o-h键的伸缩振动。
[0075]
表1＞30kda-麦芽糊精ftir光谱的特征峰
[0076][0077]
圆二色谱分析圆二色谱是分析蛋白质二级结构构的有效手段。一般蛋白质的圆二色光谱分为两段，波长范围在185-245nm称为远紫外区，245-320nm称近紫外区,其中远紫外区是蛋白质肤链的吸收峰，反映了主链的构象。如图8所示＞30kda核桃肽和＞30kda核桃肽－麦芽糊精糖基化产物的远紫外线cd光谱存在明显的差异，表明麦芽糊精对＞30kda核桃肽糖基化修饰后其结构发生改变。本发明采用cndd程序对α-螺旋、反平行、平行、β-转角和无规则卷曲的百分含量进行了估算，与a-螺旋相比，β-折叠具有不确定性，可以平行或反平行方式形成，结果如表2所示。总体看來，与＞30kda核桃肽相比，α-螺旋与β-转角百分含量降低，反平行、平行与无规则卷曲含量明显增加，说明糖基化基反应体系对肽的二级结构有一定的影响。蛋白质与多糖的糖基化作用主要是氨基与还原羰基的缩合反应，这发生在蛋白质分子α-螺旋结构及其附近区域内。α-螺旋结构的减少主要是由于多糖与α-螺旋结构内的氨基结合而导致的。糖基化反应使肽的二级结构发生显著改变，由有序的α-螺旋结构转变为无序的β-折叠和无规则卷曲结构，这表明肽空间结构变得更加松散，肽分子结构展开，柔韧性增加。
[0078]
表2＞30kda核桃肽和＞30kda核桃肽－麦芽糊精糖基化产物的二级含量
[0079][0080]
核桃肽(＞30kda)-麦芽糊精糖基化产物功能性质研究
[0081]
溶解性根据现有方法测定酶解物及糖基化产物在不同ph值条件下的溶解性。分别将酶解物、糖基化产物样品以蒸馏水溶解，制成浓度为15mg/ml样品溶液。通过以下公式计算酶解物、糖基化产物在不同ph值条件下的溶解度。
[0082][0083]
溶解性是真实反映蛋白质发生结构变性和聚集程度的最常用的评价指标，蛋白质各方面功能性质(乳化能力、凝胶作用、起泡性能等)的发挥依赖于其溶解能力。因此实验考察了酶解物及肽-糖基化产物对蛋白质溶解能力的影响。酶解物及肽-糖基化产物在不同ph值条件下的溶解度如图9所示，ph 2-4.0和ph 6-10范围，酶解物及肽-糖基化产物的溶解性均显著增加，在ph4.5-5.0范围内溶解度最低，是由于蛋白质在等电点附近会出现蛋白质絮凝沉淀现象；实验结果表明肽-糖基化产物在ph值4.0-10.0范围内溶解性高于酶解物，且其在ph值6.0-8.0的溶解度显著提高了，在ph值8.0时趋于平稳，这是由于经过酶解后，蛋白酶解物中的多肽极性更强，可以与水分子形成氢键，从而使得水溶性增加。另外，肽-糖基化产物在等电点及弱碱性条件下溶解度显著改善，表明其在食品加工中有更广的应用范围。
[0084]
抗氧化活性
[0085]
抗脂质氧化能力测定参考现有操作方法配制lls和tba-tca-hcl，向试管中分别加入2.0ml的lls溶液、2.0ml 400μm的fecl3、2.0ml样品溶液，混匀，避光条件下37℃水浴1h，再加入2.0ml tba-tca-hcl溶液，沸水浴处理15min，迅速冷却后，以4000rpm离心10min，在532nm处测定吸光值，使用以下公式计算样品抗脂质氧化能力。
[0086][0087]
式中：as—样品的吸光值；ac—空白组的吸光值。
[0088]
dpph自由基清除能力测定用乙醇配制1.75x10-4
mol/l的dpph溶液，取2ml样品溶液加入到2ml dpph乙醇溶液中，在室温下避光反应1h，随后检测其在517nm处的吸光值。运用下述公式来计算dpph自由基清除率：
[0089][0090]
其中：ac为dpph空白的吸光值；as为反应60min反应结束点溶液的吸光值；a0为样品的吸光值。
[0091]
通过测定酶解物及肽-糖基化改性产物的抗氧化活性，fe
2
鳌合能力变化不大，都在60％左右，而dpph自由基清除力和抗脂质氧化能力都不同程度的提高。如表3所示。
[0092]
表3核桃肽(＞30kda)与麦芽糊精糖基化反应后抗氧化活性
[0093][0094][0095]
理化特性
[0096]
乳化性质测定采用现有方法测定酶解物、糖基化产物的乳化活性指标(eai)和乳化稳定性指标(esi)。根据如下公式进行计算：
[0097]
eai(m2/g)＝(2
×
t
×
a0×
n)/(c
×
φ
×
104)
[0098]
esi(min)＝a0/(a
0-a
30
)
×
30
[0099]
其中：t＝2.303，n为乳状液的稀释倍数，c为蛋白质水溶液中蛋白质的浓度(g/ml)，φ＝0.25，原始乳状液中核桃油的体积分数，a0和a
30
分别为0min、30min时乳状液在500nm的吸光值。
[0100]
表面疏水性的测定参照现有方法略作改动做荧光探针，测定核桃分离蛋白及其糖基化产物的表面疏水性。用ph值为7.0的磷酸盐缓冲液将蛋白浓度稀释到0.005-0.5mg/ml之间，取稀释好蛋白样品4ml并与40μl 8.0mm的ans溶液混合,用荧光光谱仪测定荧光强度。激发波长为360nm，发射波长为510nm。以荧光强度对蛋白质浓度作图，斜率即为蛋白质的表面疏水性指数。
[0101]
吸水性测定每个样品测定3次，吸水性(wac)以每克核桃肽样品吸收水的克数表示，按照以下公式计算：
[0102][0103]
其中：w0是干燥样品的重量(g)；w1是试管重量加上干燥样品(g)；w2是试管重量加上沉淀物(g)；
[0104]
吸油性测定每个样品测定3次，吸油性(fac)以每克核桃肽吸收油脂的克数表示，按照以下公式计算：
[0105][0106]
其中：f0是干燥样品的重量(g)；f1是试管重量加上干燥样品(g)；f2是试管重量加上沉淀物(g)。
[0107]
肽-糖糖基化产物与酶解物对比，如表4可以得出肽-糖糖基化产物不仅提高了乳化性，乳化稳定性也显著提高。可能是肽-糖糖基化产物的空间结构变得松散，使蛋白质分子内部的疏水基团适当暴露，改善了蛋白质的亲水/疏水平衡，导致界面张力降低，从而提高了蛋白质的乳化能力。同时，糖基化改性也改善了吸水性及吸油性。原因可能是随着酶解的不断进行，大分子的蛋白质被水解为肽段，以及表面疏水性的降低会使其吸油能力下降。表面疏水性与其分子结构的稳定性有关，这对于蛋白质的表面性质具有重要影响。另外，核桃肽经糖基化改性后其表面疏水性显著降低，相较于糖基化改性前降低了35.2％，这可能是由于亲水糖链的共价结合增加了多肽的亲水性，以及多糖链的遮蔽作用使荧光探针难以与蛋白质分子内部的疏水基团结合，从而导致蛋白质表面疏水性的降低。虽然蛋白质水解会导致疏水基团暴露在蛋白质分子表面，但因为蛋白质在与糖接枝反应后，引入亲水分子，蛋白空间分子结构发生变化，α-螺旋结构上升，其分子内部包藏疏水性结合位点的暴露程度减小，使得蛋白质分子表面的疏水性减小。
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表4核桃肽(mw＞30kda)与麦芽糊精糖基化反应后理化指标
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乳状液微观结构
[0111]
激光共聚焦通过激光共聚焦显微镜对酶解物、糖基化产物制备的乳状液的微观结构进行观察。乳状液制备方法与
①
所述的一致，制备的乳状液在4℃条件下保存24h。根据song等人的方法，分别将20μl 0.01％(纯水配制)尼罗蓝荧光染料和20μl 0.1％(乙醇配制)尼罗红荧光染料加入到5ml乳状液中，蜗旋振荡混匀后避光静置2h。随后吸取15μl乳状液滴加到载玻片上，盖上盖玻片，确保盖玻片和载玻片之间没有气泡，用指甲油封片。用激光扫描共聚焦显微镜观察乳状液的微观结构，nile blue用于蛋白质和糖类的染色，nile red用于油的染色，激发波长分别为488nm和633nm。
[0112]
将酶解液及其糖基化产物分别制备的乳状液在4℃条件下储存24h，采用激光共聚焦扫描显微镜对其乳状液的微观结构进行观察，如图10所示，图10中呈红色荧光的是乳状液的油相-核桃油，呈现绿色荧光的是核桃肽、糖。在核桃肽糖基化产物制备的核桃油乳状液中，蛋白质分散在油-水界面上，不论液滴大小每一个油滴都能被蛋白很好的包裹起来，可以看出分子量大于30kda核桃肽-麦芽糊精制备的核桃油乳状液的液滴直径较大，且液滴分布均匀；相较于糖基化产物，酶解液制备的乳状液，只有少量的油脂被蛋白包裹，且油滴粒径较大，分布不均匀。结果证实了核桃肽麦芽糊精糖基化改性后，能分散在油水界面，在油滴表明形成很厚的吸附层，起到稳定乳状液的作用，能有效抑制乳液液滴间的聚集和絮凝，增强乳状液的稳定性。
[0113]
综上所述，本发明采用湿热法制备不同分子量的核桃肽-不同种类的糖发生糖基化反应，以乳化性质和抗脂质氧化能力为指标，分别对不同分子量的核桃肽-不同种类的糖的糖基化反应进行筛选，研究发现分子量大于30kda的核桃肽与麦芽糊精的乳化能力和抗脂质氧化能力明显改善，在此基础上以接枝度和褐变度为指标，确定＞30kda核桃肽与麦芽糊精糖基化产物的最佳反应参数分别为：反应时间为8h、反应温度为80℃、肽与糖的比例为1∶2、肽浓度为15mg/ml，接枝度达到80％以上，sds-page从核桃肽分子量的角度证实了糖蛋白大分子聚合物的生成，ftir及圆二色谱证明了＞30kda核桃肽与麦芽糊精形成了糖基化
共价复合物。在功能特性方面，肽-糖基化产物在ph值4.0-10.0范围内溶解性高于＞30kda核桃肽和糖基化改性产物的溶解性在ph值呈中性及弱碱性条件下溶解性极高，在理化特性方面，改善了乳化性、乳化稳定性、吸水/油性及表面疏水性，在抗氧性方面除了fe
2
鳌合能力没有改善，其余的dpph自由基清除力和抗脂质氧化能力都有不同程度的提高。利用激光共聚焦显微镜图显示：糖基化改性后的核桃肽对核桃油的包裹能力显著高于未糖基化之前的核桃肽。通过试验得到一条核桃肽糖基化改性的工艺参数，对核桃肽糖基化修饰在食品研究中的应用具有重要意义。
[0114]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。