id no：21，seq id no：32，seq id no：43，seq id no：53，seq id no：61，seq id no：72，seq id no：83，seq id no：94，seq id no：103，seq id no：114，seq id no：125，seq id no：133，seq id no：142；其片段，和其同源序列；
13.(b)抗原结合区域，其包含分别具有选自以下者的氨基酸序列的可变轻链(vl)和可变重链(vh)：seq id nos：6和8；seq id nos：17和19；seq id nos：28和30；seq id nos：39和41；seq id nos：49和51；seq id nos：57和59；seq id nos：68和70；seq id nos：79和81；seq id nos：90和92；seq id nos：99和101；seq id nos：110和112；seq id nos：121和123；seq id nos：129和131；seq id nos：138和140；其片段，和其同源序列；或者
14.(c)抗原结合区域，其包含：
15.(i)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列qsissy(seq id no：1)、aas和qqsystplt(seq id no：2)的轻链互补决定区(lccdr)lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftsssyw(seq id no：4)、ikqdgsek(seq id no.5)和arggwsydm(seq id no：6)的重链互补决定区(hccdr)hccdr1、hccdr2和hccdr3；其片段或其同源序列；
16.(ii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列ssnigagya(seq id no：12)、tnn和qsydsslsgvi(seq id no：13)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gytltels(seq id no：14)、fdpedget(seq id no.15)和arayygfdq(seq id no：16)的hccdr1、hccdr2和hccdr3；其片段或其同源序列；
17.(iii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列ssnignna(seq id no：23)、ynd和aawddsvngyv(seq id no：24)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gytftrfg(seq id no：25)、isvnngnt(seq id no.26)和arymygrrds(seq id no：27)的hccdr1、hccdr2和hccdr3；其片段或其同源序列；
18.(iv)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigsks(seq id no：34)、yds和qvwdnhsdvv(seq id no：35)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列rnkfssya(seq id no：36)、isgsggtt(seq id no.37)和arwyssyydv(seq id no：38)；其片段或其同源序列；
19.(v)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigsks(seq id no：34)、yds和qvwdsssdyv(seq id no：45)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfssya(seq id no：46)、isgsggst(seq id no.47)和arnyismfds(seq id no：48)；其片段或其同源序列；
20.(vi)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigsks(seq id no：34)、yds和qvwdsssdhv(seq id no：55)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfssya(seq id no：46)、isgsggst(seq id no.47)和argyssyyda(seq id no：56)；其片段或其同源序列；
21.(vii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列rsnigent(seq id no：63)、snn和aawddrlngyv(seq id no：64)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gytftnyg(seq id no：65)，igaqkgdt(seq id no.66)和arsqgvpfds(seq id no：67)；其片段或其同源序列；
22.(viii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列rsnigsnt(seq id no：74)、nnn和
atwddslneyv(seq id no：75)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gytftryg(seq id no：76)、isgyngnt(seq id no.77)和arhgygyhgd(seq id no：78)；其片段或其同源序列；
23.(ix)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列ssnigagyv(seq id no：85)、hnn和qsydsslsgwv(seq id no：86)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfkdyy(seq id no：87)、istsgnsv(seq id no.88)和arspghsdyds(seq id no：89)；其片段或其同源序列；
24.(x)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigdks(seq id no：96)、yds和qvwasgtdhpyvi(seq id no：97)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfssya(seq id no：46)、isgsggst(seq id no.47)和armygsytdm(seq id no：98)；其片段或其同源序列；
25.(xi)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列ssnigyny(seq id no：105)、rnn和tswddslsgyv(seq id no：106)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gnaftnfy(seq id no：107)、inpsgtdlt(seq id no.108)和arqyaygysgfdm(seq id no：109)；其片段或其同源序列；
26.(xii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列qsvsnw(seq id no：116)、aas和qqsystpit(seq id no：117)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gytftsyy(seq id no：118)、inpntggs(seq id no.119)和argdvtyde(seq id no：120)；其片段或其同源序列；
27.(xiii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigsks(seq id no：34)、ydd和qvwdindhyv(seq id no：127)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfssya(seq id no：46)、isgsggst(seq id no.47)和arsqasfmdi(seq id no：128)；其片段或其同源序列；
28.(xiv)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigsks(seq id no：34)、dds和qvwdsssdqgv(seq id no：135)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfssya(seq id no：46)、igtgggt(seq id no.136)和argtgydgdq(seq id no：137)；其片段或其同源序列；
29.在一些实例中，该重组抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含所述seq id nos的至少一者的片段，其为至少一个所述seq id no的全长的至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实例中，该重组抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含与所述seq id nos至少一个同源的序列，其与至少一个所述的seq id no具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。
30.在一个相关方面，本文涉及重组抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中重组抗原结合蛋白为抗体、嵌合抗原受体(car)、融合蛋白或其结合物。在一个实例中，重组抗原结合蛋白或其抗原结合片段与治疗剂(诸如药物、毒素或细胞毒性部分、放射性同位素、蛋白质或肽)结合。
31.本文的一种抗体是全长抗体、完整抗体、其片段和同源序列，包含但不限于fab片段、f(ab')2片段或单链可变片段(scfv)。
32.在该重组抗原结合蛋白中，其抗原结合区域特异性地结合至人体pd-1的表位并封阻pd-1与其配体结合。
33.在一个相关方面，本文涉及编码本文的抗原结合蛋白的核酸以及包含这些核酸或抗原结合蛋白的载体和细胞。
34.在另一个方面，本文涉及一种提高受试者中t细胞应答的方法，其包含施用治疗有效量的抗原结合蛋白或其抗原结合片段。施用治疗有效量的该抗原结合蛋白或其抗原结合片段会抑制、减少、调控或消除由pd-1介导的信号转导。
35.在另一个方面，本文涉及一种治疗患有pd-1阳性疾病的受试者的方法，其包括将治疗有效量的抗原结合蛋白或其抗原结合片段施用于受试者。在一个实例中，施用包含该抗原结合蛋白或其抗原结合片段的医药组成物。
36.在本发明的另一个方面，本文涉及载体，其包含编码重组抗pd-1抗原结合蛋白的核酸和编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白与所述嵌合抗原受体不相同。
37.在另一个方面，本文涉及包含本文所述载体的细胞。在一个相关方面，本文涉及细胞，其包含编码重组抗pd-1抗原结合蛋白的核酸和编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白与所述嵌合抗原受体不相同。在另一个相关方面，本文涉及细胞，其包含重组抗pd-1抗原结合蛋白和嵌合抗原受体，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白与所述嵌合抗原受体不相同。
38.在本文所述的载体或细胞的一些实例中，嵌合抗原受体不与pd-1特异性结合。
39.在本发明的另一个方面中，本文提供一种提高受试者中t细胞应答的方法，其包含施于受试者治疗有效量的本文所述的重组抗pd-1抗原结合蛋白、载体、细胞或医药组成物，其中该重组抗pd-1抗原结合蛋白为pd-1拮抗剂。
40.在本发明的又一个方面中，本文提供一种提高受试者中t细胞应答的方法，其包含施于受试者治疗有效量的本文所述的重组抗pd-1抗原结合蛋白、载体、细胞或医药组成物，其中该重组抗pd-1抗原结合蛋白为pd-1激动剂。
41.在本发明的另一个方面，本文提供一种治疗患有pd-1阳性疾病的受试者的方法，所述方法包括：施于受试者治疗有效量的本文所述的重组抗pd-1抗原结合蛋白、载体、细胞或医药组成物。
42.在一个相关方面，本文提供一种治疗患有pd1-阳性疾病的受试者的方法，所述方法包括：用编码重组抗pd-1抗原结合蛋白的核酸和编码嵌合抗原受体的核酸转导受试者至少一个t细胞，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白与所述嵌合抗原受体不相同。
43.在本文所述方法的一些实例中，嵌合抗原受体不与pd-1特异性结合。在一些实例中，所述pd-1阳性疾病为癌症。在一些实例中，所述pd 1-阳性疾病是自身免疫疾病。
附图说明
44.图1显示scfv-fc克隆对pd-1单体的相对亲和力。scfv-fc克隆结合pd-1的能力通过检测与pd-1单体的结合水平来测定。scfv-fc克隆的结合亲和力被评级，其中克隆31结合最弱，克隆26和27结合最好(31《23《40《18《16＝27《26)。
45.图2a和b显示pd-1与其配体pd-l1相互作用的瓦解。a.用来测量scfv-fc瓦解pd-1/
pd-l1相互作用的能力的竞争性结合分析的示意图。(1)将生物素化的pd-1-fc与经连续稀释的et901 scfv-fc(阴性对照)或抗pd1 scfv-fcs混合；(2)然后将其添加至经pd-l1-fc涂覆的盘中。步骤(3)pd-1-fc与所涂覆的pd-l1间的结合通过与hrp标记的链霉亲和素显像。b.为了比较竞争性结合分析结果，将scfv的浓度为1.7-5.25ug/ml的点圈出。克隆40和23具有最弱的瓦解该相互作用的能力而克隆26具有最强的能力(26》27＝16》18》31》23＝40)
46.图3为所用构建物的示意图。将可分泌的scfv设计成包含小鼠kappa前导序列以允许自细胞输出scfv。使用丝氨酸甘氨酸连接子(g4s)以连接可变重链和可变轻链。包含his/ha标签以允许检测scfv。sfg-1928z/scfv逆转录病毒构建物的示意图描述了5'和3'长末端重复单位(ltr)、剪接供体(sd)、剪接受体(sa)、包装元件(ψ)、cd8前导序列(cd8)、单链可变片段(scfv)的可变重(vh)和可变轻(vl)链、跨膜功能域(tm)、人类cd28信号功能域(hcd28)、人类zeta链信号功能域(hζ链)与抗pd-1scfv的位置。
47.图4经修饰以表达单1928z car或1928z car和pd-1scfv的人类周边血液t细胞的扩增。经转导的t细胞在50iu/ml重组人类il-2中培养并监控扩增。经修饰以表达car并分泌抗pd-1scfv克隆23或27的t细胞有至少与单独表达car的t细胞相等的扩增。经修饰以表达1928z car并分泌抗pd-1scfv克隆16、18、26、31或40的细胞在体外并未扩增。所显示的数据为两个独立实验的代表。
48.图5来自分泌抗pd-1scfv的肿瘤靶向t细胞的inf-γ分泌(pg/ml)。表达car的t细胞或表达car且分泌抗pd-1scfv的t细胞与cd19 raji肿瘤细胞共培养。上清液用luminex技术分析以检测自t细胞分泌细胞因子的水平。相对于经修饰以单独表达car的细胞，经修饰以表达1928z car并分泌抗pd-1scfv克隆23和27的t细胞增加了ifn-γ的分泌。与经修饰以单独表达car的细胞相比，经修饰以表达1928z car并分泌抗pd-1scfv克隆16、18、2、31或40的t细胞降低了ifn-γ的分泌。
49.图6显示以1928z car和eureka抗pd-1scfv转导人类t细胞的结果。(上面的图)在转导后，人类t细胞由流式细胞仪评估使用对1928z car(19e3)有特异性的抗体检测car的表达。对于所有测试和重现的构建体，转导效率大于55％。(下面的图)包含eureka抗pd-1scfv克隆26、27和40的构建体具有显著较低的转导效率，*p《0.05。来自4个独立实验的转导效率，所显示的数据为平均数 /-sem。
50.图7显示了在经修饰以表达1928z car与eureka抗pd-1scfv的t细胞中抗pd-1scfv存在的功效。在制备免疫印迹裂解物前，将经转导以表达car和eureka抗pd-1scfvs的人类t细胞以高尔基抑制剂培养4个小时。免疫印迹裂解物分析用来通过使用抗ha抗体探测膜来检测抗pd-1scfv。用抗gapdh抗体作为内参照来探测膜。
51.图8显示经修饰以表达1928z car与抗pd-1scfv的人类t细胞在pd-l1/l2存在/不存在下的扩增。将经修饰以表达car并分泌抗pd-1scfv克隆23、26、27和40的人类t细胞置于表达人类pd-1l1/l2或不表达其的人工抗原呈递细胞(aapcs，小鼠3t3成纤维细胞)上。在与aapcs培养24个小时后，将cd3/cd28活化珠粒添加至细胞以刺激增殖(1:2珠粒：t细胞比率)。于3日后，使用台盼蓝拒染法计算t细胞。相对于在不表达抑制性配体的aapcs上，经修饰以表达1928zcar和抗pd-1scfv克隆26和23的t细胞在表达pd-l1/l2的aapcs上增殖减少。相反地，经修饰以表达1928zcar和抗pd-1scfv克隆27的t细胞在表达pd-l1/l2的aapcs上的扩增增加。所显示的数据为一个实验的代表。
52.图9显示本文的一些抗原结合蛋白的可变轻链与可变重链的互补性决定区域(cdr)的氨基酸序列。
53.图10显示从抗pd-1特异性scfv产生的单克隆抗体与在人类t细胞上的pd-1结合。产生来自pd-1特异性scfv的人类单克隆抗体并将其与经修饰以过度表达人类pd-1(1μg/ml)的人类t细胞培养。流式细胞仪使用与fitc结合的山羊抗人类ig抗体来检测结合的抗体。克隆23、26和27单克隆抗体分别以51％、78％和67％与pd-1人类t细胞结合。对照组抗体(克隆901)不与t细胞上的人类pd-1结合。所显示的数据为一个实验的代表。
54.图11显示经修饰以表达第一代cad的t细胞在表达pd-l1/l2的aapcs上培养当抗pd-1克隆27单克隆抗体存在时扩增。将经修饰以表达第一代cd19特异性car(19z1)的人类t细胞与抗pd-1单克隆抗体培养24个小时，然后置于表达pd-l1/l2或不表达其的aapcs上。在以aapcs刺激24个小时后，接着以cd3/cd28珠粒刺激细胞。于3日后，计算细胞。与无单克隆抗体(有点的条)、对照组抗体、901(有方格的条)与克隆23(有水平线的条)与和26(有垂直线的条)单克隆抗体培养的19z1 t细胞在表达pd-1配体(相对应的无框线条)的aapcs上相较于在无抑制性配体的aapcs上扩增较小。然而，与抗pd-1克隆27单克隆抗体(有斜线的条)培养的19z1 t细胞在pd-l1/l2 aapcs上具有较大程度的扩增。所显示的数据为一个实验的代表。
55.图12a-12d显示经进一步修饰以分泌pd-1封阻性scfv(e27)的car t细胞的产生。a.双顺反子逆转录病毒构建体的产生，其编码cd19特异性car(称为1928z)或卵巢肿瘤抗原特异性car(称为4h1128z)和pd-1封阻性scfv(e27)。e27前面有一信号肽(小鼠igk)以允许该scfv的分泌。并包含一ha/his标签以检测由t细胞分泌产生的scfv。b.人类周边血液t细胞以编码car、1928z或car和e27 pd-1封阻性scfv(1928z-e27)的逆转录病毒构建体转导。于转导后，使用特异性地结合靶向cd19的car的抗体(称为19e3)通过流式细胞仪以检测car的表达。c.使用抗ha抗体通过来自经转导人类t细胞的上清液的免疫印迹分析检测pd-1封阻性scfv。我们也研究了来自经修饰以表达car和对照组scfv(b6，其通过使用抗c-myc标签抗体检测)的t细胞的scfv分泌。d.进行对两个cd19
肿瘤目标的标记
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cr释放分析以确保scfv的分泌并未阻碍car重定向t细胞裂解能力的能力。表达单car的car t细胞(1928z或4h1128z对照组car)、表达car和e27 scfv的car t细胞(1928z-e27或4h1128z-e27)、或表达car和对照组scfv的car t细胞(1928z-b6h12.2或4h1128z-b6h12.2)是经
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cr标记的肿瘤细胞(raji或nalm6)培养4个小时。表达cd19特异性car的t细胞能够以相等的水平裂解肿瘤目标，且卵巢靶向的car t细胞不能够裂解raji或nalm6。因此，我们作出以下结论：scfv的分泌并未阻碍car重定向t细胞裂解能力的能力。
56.图13a-13d显示经修饰以表达car并分泌pd-1封阻性scfv的t细胞在体外抗拒来自pd-l1-pd-1相互作用的抑制。a.表达car的t细胞(1928z)、或表达car和pd-1封阻性scfv的t细胞(1928z-e27)培养在3t3细胞空细胞或经修饰以表达人类pd-l1的3t3细胞上。在3t3喂养细胞上24个小时后，将细胞用以1：3的珠粒：t细胞比率添加至培养物的cd3/cd28珠粒刺激。t细胞的扩增是以台盼蓝计算测定且将新鲜的珠粒添加至培养物两次(以箭头指出)。然而，在3t3空喂养细胞上扩增的1928z t细胞并未在3t3-pd-l1喂养细胞上扩增。相反地，1928z-e27 t细胞在3t3空细胞和3t3-pd-l1喂养细胞上皆扩增，表明对pd-l1-pd-1介导的抑制的抗性。b.如图13a中显示的在3t3空细胞或3t3-pd-l1细胞上培养的t细胞是通过由流
式细胞仪检测在抑制性受体(pd-1、2b4和lag3)上的表达。相较于1928z-e27细胞(未显示)，1928z细胞表达更高水平的pd-1。当以pd-1
细胞限制时，2b4和lag3的分析说明1928z细胞相较于1928z-e27细胞具有较高比例的pd-1
、2b4
和lag3
细胞。c.经转导t细胞与raji-pdl1或nalm6-pdl1肿瘤细胞以不同效应与目标(e：t)比率(1：1、1：3、1：5)培养72个小时。在以抗cd3和抗cd19抗体染色和计算珠粒后，使用流式细胞仪检测随时间的肿瘤目标裂解和t细胞的扩增。当与pdl1
肿瘤细胞培养时，相较于1928z t细胞(下面的曲线)，1928z-e27细胞(上面的曲线)继续扩增至较高水平。d.经转导的t细胞以nalm6-pdl1肿瘤细胞刺激，如图3c中显示，以nalm6-pdl1肿瘤细胞以1：5te：t比率再刺激。共培养48个小时后，使用流式细胞仪检测肿瘤目标的裂解。再刺激后，相较于1928z细胞，1928z-e27保留裂解pd-l1肿瘤目标的能力。
57.图14显示经修饰以表达car并分泌pd-1封阻性scfv的t细胞在体内的抗肿瘤效力。a.第0日通过静脉灌注将raji-pd-l1肿瘤细胞接种于scid-米色小鼠。于第1日，小鼠静脉灌注106个car t细胞且临床地监视存活。小鼠在发生后肢麻痹时被安乐死。
58.图15a-15d是关于pd-1封阻性scfv(e27)的挑选。a pd-1封阻性mab候选物e27、e26和e23是以各种浓度用于竞争性结合分析以检测相较于对照组mab(靶向在人类中不存在的半抗原)对pd-1和pd-l1间结合的阻碍。e23、e26和e27 mab皆阻止了pd-1和pd-l1间的结合。b在a中使用的由e23、e26和e27 mab设计的pd-1封阻性scfv的设计示意图，其中信号肽连接至可变重链序列和丝氨酸甘氨酸连接子和可变轻链序列。包含此his/ha标签用于检测scfv。c来自经转导以用1928z car表达可分泌scfv的293glv9包装性细胞的sn上的免疫印迹，以抗ha抗体染色。e27 scfv以最高的水平被检测到且因此在出版物的其余部分使用。d来自pbmcs 4h1128z和pbmcs 4h1128z的sn上的免疫印迹，以抗ha mab染色。
59.图16a-16e显示t细胞可被共修饰以表达car并分泌pd-1封阻性scfv(e27)。a代表流式细胞仪图，其展示在以单1928z car(1928z)或1928z car与e27 pd-1封阻性scfv(1928z-e27)转导后，在以特异性地结合1928z car的19e3 mab染色后的相等的car表达。b来自以抗ha mab染色的1928z和1928z-e27 t细胞的sn上的免疫印迹，其仅仅在1928z-e27细胞中显示～30kda蛋白质，说明e27 scfv是从1928z-e27转导的t细胞而非从单car转导的t细胞处分泌。c代表流式细胞仪，其显示转导后在1928z-e27 t细胞上的pd-1表达水平显著低于在1928z t细胞上的。d相较于在1928z t细胞上，在1928z-e27 t细胞上的pd-1的表达在统计上显著较低，所显示的数据是来自4个独立实验的平均 /-sem。e 4个小时
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cr释放分析，其显示raji肿瘤细胞的裂解未受e27 scfv分泌影响。1928z和1928z-e27 t细胞相等地裂解raji肿瘤细胞。相较于4h1128z t细胞，对照组4h1128z-e27 t细胞未增加raji细胞的裂解。显示的数据是两个独立实验的代表。
60.图17a-17g显示在cd19
pd-l1
肿瘤细胞的背景中，car和e27的表达会保护t细胞的增殖能力和裂解能力。a raji肿瘤细胞是经逆转录病毒修饰以表达人类pd-l1(raji-pdl1)和是用对pd-l1有特异性的mab染色。亲代raji肿瘤(raji)未表达pd-l1且raji-pdl1肿瘤细胞表达高水平的pd-l1。b代表流式细胞仪图，其显示在72小时共培养后以流式细胞仪测定的，相较于1928z t细胞，1928z-e27 t细胞裂解更多的raji-pdl1肿瘤细胞。c相较于1928z t细胞，1928z-e27 t细胞统计上显著裂解更多的raji-pdl1肿瘤细胞，所显示的数据是来自4个独立的实验的平均 /-sem。d如由流式细胞仪和计算珠粒所测定的，在与raji-pdl1肿瘤
细胞共培养后，1928z-e27 t细胞扩增至更大的数目，所显示的数据是来自4个独立的实验的t细胞的平均总数 /-sem。e代表流式细胞仪图，其显示在与raji-pdl1肿瘤细胞共培养7日后，相较于1928z-e27 t细胞，在1928z t细胞上的pd-1表达增加。f关于pd-1染色的阳性细胞百分比和平均荧光强度(mfi)，相较于1928z-e27 t细胞，1928z t细胞显著表达更多的pd-1。数据以来自4个独立的实验的平均数 /-sem显示。g代表流式细胞仪图，其显示在与raji-pdl1共培养7日后，相较于1928z-e27细胞，2b4 pd-1 1928z t细胞的百分比增加。在2b4 pd-1 族群上1928z-e27 t细胞也表达较少的btla和tim3。所显示的数据是3个独立实验的代表。
61.图18a-18c显示在pd-l1的背景中e27保护经cd3/cd28刺激的t细胞的增殖能力。a nih3t3细胞经逆转录病毒修饰以表达人类pd-l1(3t3-pdl1)且用对pd-l1有特异性的mab染色。亲代nih3t3(3t3-空)未表达pd-l1且3t3-pdl1肿瘤细胞表达高水平的pd-l1。b 1928z和1928z-e27 t细胞是以3t3-空细胞或3t3-pdl1细胞培养并以cd3/cd28珠粒刺激。计算细胞并于第3、6、9和12日再涂盘在新的3t3细胞上。当以3t3-pdl1细胞培养时，相较于以3t3-空细胞培养，1928z t细胞的扩增减少。当在3t3-空细胞或3t3-pdl1细胞上培养时，1928z-e27细胞具有相等的扩增。所显示的数据来自4个独立的实验的平均扩增倍数 /-sem。c代表流式细胞仪图，其显示相较于在3t3-空细胞上培养的1928z t细胞，在以3t3-pdl1培养的1928z t细胞上的2b4、pd-1、btla和tim3的表达增加。当以3t3-空和3t3-pdl1培养时，1928z-e27细胞具有相等的2b4、pd-1、btla-4和tim3的表达。所显示的数据是3个独立实验的代表。
62.图19显示分泌e27 scfv的car t细胞在体内具有增加的抗肿瘤功能。scid-米色小鼠用raji-pdl1肿瘤细胞静脉灌注接种，且于次日用car t细胞静脉灌注。相较于以1928z t细胞治疗的小鼠，以1928z-e27 t细胞治疗的小鼠具有提高的存活。相较于未经治疗的小鼠和以靶向不相关抗原的car t细胞(4h1128z和4h1128z-e27细胞)治疗的小鼠，以1928z t细胞治疗的小鼠存活较长。所显示的数据来自2个独立的实验。
63.图20显示使用抗pd-1抗体et130-23、et130-26和et130-27的pd1/pdl1封阻性elisa的结果。et901(阴性对照组)未显示结合，而et130-23、et130-26和et130-27在介于0.031和10μg/ml间的浓度范围内显示了对pd1/pdl1结合的封阻功效。
64.图21显示使用抗pd-1抗体et130-23、et130-26和et130-27的pd1/pdl2封阻性elisa的结果。et901(阴性对照组)未显示结合，而et130-23、et130-26和et130-27在介于0.031和10μg/ml间的浓度范围显示了对pd1/pdl1结合的封阻功效。
具体实施方式
65.本文引用的所有公开物、专利案和其他参考文献通过引用整体并入本文。
66.在实践本文中，许多分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学中的许多常规技术被使用，这在本领域技术范围内。此等技术在例如以下者中更详细地描述：molecular cloning：alaboratory manual第3版，j.f.sambrook和d.w.russell，编辑，cold spring harbor laboratory press 2001；recombinant antibodies for immunotherapy，melvyn little，编辑，cambridge university press 2009；"oligonucleotide synthesis"(m.j.gait，编辑，1984)；"animal cell culture"(r.i.freshney，编辑，
1987)；"methods in enzymology"(academic press，inc.)；"current protocols in molecular biology"(f.m.ausubel等人，编辑，1987，定期更新)；"pcr：the polymerase chain reaction"，(mullis等人，编辑，1994)；"a practical guide to molecular cloning"(perbal bernard v.，1988)；"phage display：alaboratory manual"(barbas等人，2001)。这些参考文献的内容以及包含本领域技术人员所广泛知晓和依赖的标准协议的其他参考文献的内容(包括制造商的说明书)在此通过引用并入作为本文的一部分。
67.在以下的描述中，关于术语的使用，会依循某些惯例。一般地，用于本文中的术语旨在以和该术语为所属技术领域的技术人员所知的意义一致的方式理解。
[0068]“抗原结合蛋白”是一种蛋白质或多肽，其包含抗原结合区域或抗原结合部分，对和其结合的另一分子具有强的亲和力。抗原结合蛋白涵盖抗体、嵌合抗原受体和融合蛋白。
[0069]
如所述技术领域中所知的，“抗体”是关于免疫系统的抗原结合蛋白。本文中所提及的术语“抗体”包含完整、全长抗体及其中保留“抗原结合部分”或“抗原结合区域”的任何片段、或其单链。天然存在的“抗体”是糖蛋白，其包含通过由二硫键彼此联结的至少两个重(h)链和两个轻(l)链。各重链由重链可变区域(本文中缩写成vh)和重链恒定(ch)区域构成。该重链恒定区域由三个功能域(ch1、ch2和ch3)构成。各轻链由轻链可变区域(本文中缩写成vl)和轻链恒定cl区域构成。该轻链恒定区域由一个功能域(cl)构成。该vh和vl区域可被进一步再分成高变区域(称为互补性决定区域，cdr)以及散布于其间较保守的区域(称为构架区域，fr)。各vh和vl从氨基端至羧基端由以下顺序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区域包含结合功能域，其和抗原相互作用。抗体的恒定区域可介导免疫球蛋白和宿主组织或因子(包含形形色色的免疫系统细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组份(c1 q))的结合。
[0070]
本文中术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合区域”是指赋予抗原特异性的抗体的区域或部分；抗原结合蛋白(例如抗体)的片段，因此包含保留特异性结合抗原能力(例如，hla-胜肽复合体)的一个或多个抗体片段。已经显示抗体的抗原结合功能可通过由全长抗体的片段进行。术语抗体的“抗体片段”所涵盖的抗原结合片段的实例包含fab片段，其为由vl、vh、cl和ch1功能域所组成的单价片段；f(ab)2片段，其为包含通过由位于枢纽区域的二硫桥连接的两个fab片段的双价片段；fd片段，其由vh和ch1功能域所组成；fv片段，其由抗体单臂的vl和vh功能域所组成；fab片段(ward等人，1989nature 341：544-546)，其由vh功能域所组成；和经分离的互补性决定区域(cdr)。
[0071]
此外，虽然fv片段的两个功能域(vl和vh)是由不同的基因编码，其可使用重组方法通过合成的连接体连接起来，使得他们被制作成其中vl和vh区域配对以形成单价分子的单一蛋白质链。这些被称为单链fv(scfv)；参见例如bird等人，1988science 242：423-426；和huston等人，1988proc.natl.acad.sci.85：5879-5883。这些单链抗体也涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以完整抗体的相同方式筛选片段的实用性。
[0072]
重组抗体”或“重组抗原结合蛋白”是具有基于包含在重组产生的抗原结合蛋白例如抗体中的结合特征而鉴定和选择的抗原结合部分者。
[0073]
术语“其同源序列”指的是氨基酸和核苷酸序列，其和表1-14中显示的序列具有60和99.9％的一致性。在一些实例中，同源序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的一致性。在一个实例中，同源序列具有95-99.9％的一致性；在另一个实例中，该同源序列具有98-99.9％的一致性。
[0074]
在一个实例中，和人类pd-1特异性地结合的单链可变片段(scfv)被挑选和测试。scfv从专有的完全人源抗体scfv噬菌体文库(优瑞科生物技术公司，加利福尼亚爱莫利维尔)的噬菌体展示文库中分离scfv。该文库由来自超过100个白种人和亚洲人健康供者、和来自患有自体免疫疾病(例如全身性红斑性狼疮、硬皮症等等)的供者的人类抗体库构成。
[0075]
用于抗体噬菌体淘选的抗原是重组融合蛋白，融合至人类igg1fc的pd-1细胞外功能域(pd-1ecd-fc功能域)。编码pd-1ecd和higg1 fc的dna序列是由金唯智(新泽西州南平原镇)合成。然后将dna序列亚克隆到优瑞科专有的哺乳类动物表达载体中，然后将其转染至hek293细胞中以用于融合蛋白表达。pd-1ecd-fc融合蛋白是在细胞死亡后从hek293细胞培养基通过标准fplc方法纯化。
[0076]
使用人类scfv抗体噬菌体展示文库以挑选mab克隆。简而言之，经生物素化的抗原(pd-1ecd-fc融合蛋白)可首先和人类scfv噬菌体文库混合，然后抗原-scfv抗体复合物可通过磁性架由和链霉亲和素结合的dynabead m-280拉下。然后可洗脱经结合的克隆并将其用于感染大肠杆菌xl1-blue。于该细菌中表达的scfv噬菌体克隆可被纯化(yasmina na等人，probing the binding mechanism and affinity of tanezurmab，arecoimbinant humanized anti-ngf monoclonal antibody，using a repertoire of biosensors.protein science 2008；17(8)：1326-1335；roberts wk等人，vaccination with cd20 peptides induces a biologically active，specific immune in mice.blood 2002：99(10)：3748-3755)。可进行淘选3-4轮以富集和pd-1特异性地结合的scfv噬菌体克隆。阳性克隆可通过由标准elisa方法依靠经生物素化单链pd-1测定。阳性克隆可被进一步测试其和在活细胞表面上的pd-1的结合，通过由流式细胞仪，使用pd-1
细胞系，例如3t3细胞系。
[0077]
本文内容涵盖的一些克隆在本文中被称为克隆14、16、18、19、23、26、27、31、36、37、40、42、46和47。可变轻(vl)和可变重(vh)链氨基酸序列和编码此等实例的核苷酸序列如以下表1-14所示。在一些实例中，该vl和vh序列是以丝氨酸甘氨酸连接子连接以形成scfv。在一些实例中，可包含ha/his标签以允许检测该scfv。
[0078]
在一些实例中，本文包含抗体，其具有和一或多个重链的恒定功能域融合的scfv序列以形成具有人类免疫球蛋白的fc区域的抗体以产生双价蛋白质，增加该抗体的整体结合和稳定性。此外，该fc部分允许其他分子(包含但不限于荧光染料、细胞毒素、放射性同位素等等)和抗体的直接结合以(例如)用于抗原定量研究、固定该抗体以用于亲和力测量、用于靶向递送治疗剂、使用免疫效应细胞测试fc介导的细胞毒性和许多其他应用。
[0079]
在一些实例中，该抗pd-1抗原结合蛋白可包含一或多个构架区域氨基酸取代，其设计为改善蛋白质稳定性、抗体结合、表达水平或引入治疗剂结合位点。此等scfv然后用于根据所属技术领域的技术人员已知的方法制造重组人类单株igs。
[0080]
在一些实例中，该抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(car)。嵌合抗原受体治疗(car-t治疗)是一种新型的靶向免疫治疗。其融合单克隆抗体的精致的靶向特异性和细胞毒性t细胞所提供的有效细胞毒性和长期持续性。此技术使t细胞能够取得独立于内源性tcr的长期
新颖抗原特异性。临床试验显示car-t疗法在以下者中具有临床显著的抗肿瘤活性：神经母细胞瘤(louis c.u.等人，blood 118(23)：6050-6056)、b-all(maude s.l.等人，n.engl.j.med.371(16)：1507-1517，2014)、cll(brentjens r.j.等人，blood 118(18)：4817-4828，2011)、和b细胞淋巴瘤(kochenderfer j.n.等人，blood.116(20)：4099-4102，2010)。于一个研究中，报道了30名接受cd19-car t治疗的b-all的患者中90％的完全缓解率(maude s.l.等人，如上)。
[0081]
在一些实例中，该嵌合抗原受体包含细胞外功能域，其包含抗体部分、跨膜功能域、和细胞内信号功能域。在一些实例中，该细胞内信号功能域包含cd3ζ细胞内信号序列和共刺激性信号序列。在一些实例中，该共刺激性信号序列是cd28细胞内信号序列。
[0082]
本文的其他方面包含(但不限于)使用抗原结合蛋白质和编码其的核酸以治疗pd1相关疾病、以用于诊断应用和预后应用以及用作为在细胞和组织中检测pd1的研究工具。包含公开的抗原结合蛋白和核酸的医药组成物被本文所涵盖。包含本文的用于通过矢量免疫疗法的基于抗体的治疗的核酸的载体也被本文考虑。载体包含能够表达和分泌抗体的表达载体，以及针对抗原结合蛋白例如嵌合抗原受体(car)的细胞表面表达的载体。
[0083]
包含该核酸的细胞(例如已经用本文的载体转染的细胞)也为本文所涵盖。
[0084]
对于用于诊断应用和研究应用，也提供套组，其包含本文的pd1抗体或核酸、分析试剂、缓冲液和类似者。
[0085]
表1：pd1-16
[0086][0087]
表2：pd1-18
[0088][0089]
表3：pd1-23
[0090][0091]
表4：pd1-26
[0092][0093]
表5：pd-1-27
[0094][0095]
表6：pd-1-31
[0096][0097]
表7：pd-1-40
[0098][0099]
表8：pd-1-36
[0100][0101]
表9：pd-1-37
[0102][0103]
表10：pd-1-19
[0104][0105]
表11：pd-1-14
[0106][0107]
表12：pd-1-47
[0108][0109]
表13：pd-1-46
[0110][0111]
表14：pd-1-42
[0112][0113]
在一个其中该抗原结合蛋白是全长抗体的实例中，本文的抗体的重链与轻链可为全长(例如抗体可包含至少一个，且较佳是两个完整的重链，与至少一个，且较佳是两个完整的轻链)或可包含抗原结合性部分(afab、f(ab
′
)2、fv或单链fv片段(“scfv
″
))。在其他实例中，该抗体重链恒定区域选自例如igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igd与ige。在一些实例中，该免疫球蛋白同型选自igg1、igg2、igg3与igg4，更具体而言，为igg1(例如人类igg1)。抗体类型的选择会取決于该抗体经设计以引起的免疫效应功能。
[0114]
在构建重组免疫球蛋白中，用于形形色色的免疫球蛋白同型的恒定区域的合适的氨基酸序列与用于制造大量抗体的方法是所属技术领域技术人员已知的。
[0115]
编码本文中鉴定的抗原结合蛋白的核酸可用于工程化重组免疫效应细胞。例如，用于生产经遗传修饰的t细胞的方法与载体是技术领域中已知的(参见brentjens等人，safety and persistence of adoptively transferred autologous cd19-targeted t cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory b-cell leukemias，blood 118(18)：4817-4828，2011年11月)。
[0116]
本文的其他实例包含含有编码本文的抗原结合蛋白或其抗原结合片段的核酸的
l1-fc涂覆的盘。与涂覆在盘上的pd-l1结合的pd-1-fc通过与hrp结合的链霉亲和素显像(图2b)。当比较相似浓度的scfv-fc(圈起)时，瓦解pd-1-pdl1相互作用的能力被评级，其中克隆40与23具有最弱的瓦解相互作用能力，克隆26具有最强的瓦解相互作用能力(26》27＝16》18》31》23＝40，图2b)。
[0130]
实施例3
[0131]
然后研究这些克隆调节特异性t细胞功能的能力。我们先前已产生肿瘤靶向的t细胞，其中t细胞是以逆转录病毒转导以表达肿瘤特异性嵌合抗原受体(car)。我们先前已证明了car的表达已使t细胞功能重定向成靶向给定抗原(brentjens、santos等人，2007)。在我们的实验室中，我们使用对cd19有特异性的car(称为1928z)靶向b细胞恶性肿瘤(brentjens、santos等人，2007)。我们先前已证实经car修饰的t细胞已于体外与体内且于临床研究中展示了显著的抗肿瘤活性(brentjens、latouche等人，2003；brentjens、davila等人，2013；davila、riviere等人，2014)。为测定该7个scfv克隆是否为促效性(刺激pd-1)、拮抗性(封阻pd-1)或对pd-1无显著功效，我们通过包含接近抗pd-1scfv基因的小鼠kappa前导序列而生产了可分泌的scfv(图3)。我们然后生成了双顺反子逆转录病毒载体以诱发1928z car的表达与从转导人类周边血液t细胞处分泌抗pd-1scfv。
[0132]
实施例4
[0133]
鉴于pd-1刺激抑制t细胞增殖与功能的能力，我们随后试图表征pd-1scfv对t细胞增殖的影响。为达成此，自健康供者的周边血液分离人类t细胞并通过逆转录病毒转导修饰以表达car并分泌pd-1-特异性scfv，其使用的方法先前已被描述(brentjens、santos等人，2007)。于转导后，监视经修饰的t细胞在体外扩增(图4)。表达1928z car并分泌pd-1特异性scfv克隆23与27的t细胞以及经修饰以仅仅表达1928z car的t细胞扩增。经修饰以表达car并分泌pd-1-特异性scfv克隆16、18、26、31或40的细胞并未增殖，暗示这些pd-1-特异性scfv克隆是促效性，可能刺激pd-1造成t细胞增殖减少。
[0134]
实施例5
[0135]
除了扩增研究外，我们共培养了t细胞(表达car或car并分泌pd-1-特异性scfv)与cd19
伯克氏淋巴瘤细胞系raji并测定了从t细胞分泌的细胞因子的水平。如图5所示，相较于经修饰以单独表达car的细胞，经修饰以表达1928z car并分泌pd-1-特异性scfv克隆23或27的t细胞分泌更多ifn-γ，暗示这些scfv克隆对pd-1信号是拮抗性。相较于以单car修饰的细胞，经修饰以表达1928z car并分泌pd-1-特异性scfv克隆16、18、2、31或40的细胞分泌较少的ifn-γ，暗示这些scfv对pd-1是促效性且抑制了t细胞功能。
[0136]
实施例6
[0137]
经修饰以表达1928car与pd-1封阻性scfv的人类t细胞通过流式细胞仪分析。在核实car的表达(图6)后，scfv的存在使用从用高尔基抑制剂处理的人类t细胞制作的裂解产物的免疫印迹测定(使用在scfv设计中纳入对ha标签有特异性的抗体)以允许在细胞裂解产物中检测。相较于其他克隆，经修饰以表达1928z car与克隆23的人类t细胞具有显著较少的scfv蛋白质(图7)。这些细胞然后被置于表达或不表达pd-1配体pd-l1/l2的3t3小鼠成纤维细胞(人工抗原递呈细胞，aapcs)上。在以aapcs培养24个小时后，将cd3/d28珠粒添加至培养物以活化人类t细胞。培养人类t细胞3日后，计算aapcs与珠粒人类t细胞以测定pd-1配体的存在是否抑制了珠粒驱动的人类t细胞的扩增，或抗pd-1scfv是否阻止了pd-1配体
介导的t细胞扩增的抑制。相较于在不表达抑制性配体的aapcs上，经修饰以表达1928z car与抗pd-1scfv克隆26与23的t细胞在表达pd-l1/l2的aapcs上的增殖减少(图8)。相反地，经修饰以表达1928z car与抗pd-1scfv克隆27的t细胞在表达pd-l1/l2的aapcs上的扩增增加。
[0138]
实施例7
[0139]
使用技术领域已知的重组技术，自pd-1特异性scfvs产生的重组人类单克隆抗体，即完全人类ig分子由与在相对应scfv中找到的相同的可变重链与轻链制造(参见上表1-14与图9)。这些单克隆抗体与pd-1间的结合使用流式细胞仪测试(参见图10)。
[0140]
修饰人类t细胞以过度表达人类pd-1，然后以1μg/ml抗体培养。克隆27mab与pd-1t细胞结合最大，接着是克隆26，然后是克隆23(图9)。对照组单克隆抗体901不与pd-1t细胞结合。然后将以这些抗体培养的t细胞置于具有珠粒的人工抗原递呈细胞(aapcs)上以测定pd-1配体对t细胞的扩增的影响与单克隆抗体预防此相互作用的能力。以抗pd-1克隆27单克隆抗体培养的19z1 t细胞在pd-l1/l2 aapcs上扩增至较大的程度。
[0141]
实施例8
[0142]
当存在抗pd-1克隆27单克隆抗体时，培养在表达pd-l1/l2的aapcs上的经修饰以表达第一代car的t细胞扩增。经修饰以表达第一代cd19特异性car(19z1)的人类t细胞与抗pd-1单克隆抗体培养24个小时然后放置在表达或不表达pd-l1/l2的aapcs上。在以aapc刺激24个小时后，接着以cd3/cd28珠粒刺激细胞。于三日后，计算细胞。相较于在无抑制性配体的aapcs上(图11有框的条)，以无单克隆抗体、对照组抗体(901)与克隆23与26单克隆抗体培养的19z1 t细胞在表达pd-1配体的aapcs上(图11无框的条)的扩增较小。然而，以抗pd-1克隆27单克隆抗体培养的19z1t细胞在pd-l1/l2 aapcs上扩增至较大的程度。所显示的数据是一个实验的代表。
[0143]
实施例9
[0144]
经进一步修饰以分泌pd-1封阻性scfv(e27)的car t细胞的产生。产生双顺反子逆转录病毒构建体，其编码cd19特异性car(称为1928z)或卵巢肿瘤抗原特异性car(称为4h1 128z)与pd-1封阻性scfv(e27)(图12a)。e27前面有一信号肽(小鼠igk)以允许该scfv的分泌。也包含一ha/his标签以检测自t细胞分泌的scfv。人类周边血液t细胞是以编码car、1928z或car与e27 pd-1封阻性scfv(1928z-e27)的逆转录病毒构建体转导。转导后，使用流式细胞仪检测car的表达，使用特异性地结合靶向cd19的car的抗体(称为19e3)(图12b)。利用对经转导人类t细胞的上清液的免疫印迹分析以用抗ha抗体检测pd-1封阻性scfv(图12c)。我们也研究来自经修饰以表达car与对照组scfv(b6，其使用抗c-myc标签抗体检测)的t细胞的scfv分泌。进行对两个cd19
肿瘤目标的标准
51
cr释放分析以确保scfv的分泌并未阻碍car使t细胞裂解能力重定向的能力。表达单car的car t细胞(1928z或4h1128z对照组car)、表达car与e27 scfv的car t细胞(1928z-e27或4h1128z-e27)、或表达car与对照组scfv的car t细胞(1928z-b6h12.2或4h1 128z-b6h12.2)是以经
51
cr标记的肿瘤细胞(raji或nalm6)培养4个小时。表达cd19特异性car的t细胞能够以相等的水平裂解肿瘤目标，且靶向卵巢的car t细胞不能够裂解raji或nalm6(图12d)。因此，我们作出以下结论：scfv的分泌并未阻碍car重定向t细胞裂解能力的能力。
[0145]
实施例10
[0146]
经修饰以表达car并分泌pd-1封阻性scfv的t细胞在体外抗拒来自pd-l1-pd-1相互作用的抑制。表达单car的t细胞(1928z)、或表达car与pd-1封阻性scfv的t细胞(1928z-e27)培养在3t3细胞空细胞或经修饰以表达人类pd-l1的3t3细胞上。在3t3喂样细胞上24个小时后，将细胞用以1：3的珠粒：t细胞比率添加至培养物的cd3/cd28珠粒刺激。t细胞的扩增是以台盼蓝计算测定且将新鲜的珠粒添加至培养物两次(以箭头指出)。然而，在3t3空喂样细胞上扩增的1928z t细胞并未在3t3-pd-l1喂样细胞上扩增。相反地，1928z-e27 t细胞在3t3空细胞与3t3-pd-l1喂样细胞上皆扩增，表明对pd-l1-pd-1介导的抑制的抗性(图13a)。如图13a中显示的在3t3空细胞或3t3-pd-l1细胞上培养的t细胞通过流式细胞仪分析以检测在抑制性受体(pd-1、2b4与lag3)上的表达。相较于1928z-e27细胞，1928z细胞表达更高水平的pd-1(未显示)。当以pd-1
细胞限制时，2b4与lag3的分析展现1928z细胞相较于1928z-e27细胞具有较高比例的pd-1
、2b4
与lag3
细胞(图13b)。经转导的t细胞以raji-pdl1或nalm6-pdl1肿瘤细胞以不同效应对目标(e：t)比率(1：1、1：3、1：5)培养72个小时。在以抗cd3与抗cd19抗体染色与计算珠粒后，使用流式细胞仪以监视随时间的肿瘤目标的裂解与t细胞的扩增。当以pdl1
肿瘤细胞培养时，相较于1928z t细胞，1928z-e27细胞继续扩增至较高的水平(图13c)。经转导的t细胞以nalm6-pdl1肿瘤细胞刺激，于图3c所示，用nalm6-pdl1肿瘤细胞以1：5t e：t比率再刺激。共培养48个小时后，使用流式细胞仪测定肿瘤目标的裂解。再刺激后，相较于1928z细胞，1928z-e27保留裂解pd-l1肿瘤目标的能力(图13d)。
[0147]
实施例11
[0148]
经修饰以表达car并分泌pd-1封阻性scfv的t细胞在体内的抗肿瘤效力如图14所示。第0日通过静脉灌注将raji-pd-l1肿瘤细胞接种于scid-米色小鼠。于第1日，小鼠静脉灌注106个car t细胞且临床地监视存活。小鼠在发生后肢麻痹时被安乐死。
[0149]
实施例12
[0150]
pd-1封阻性mab候选物e27、e26和e23是以各种浓度用于竞争性结合分析以检测相较于对照组mab(靶向在人类中不存在的半抗原)对pd-1和pd-l1间结合的阻碍。e23、e26和e27 mab皆阻止了pd-1和pd-l1间的结合(图15a)。来自经转导以用1928z car表达可分泌scfv的293glv9包装性细胞的sn上的免疫印迹，以抗ha抗体染色。e27 scfv以最高的水平被检测到且因此在出版物的其余部分使用(图15c)。
[0151]
实施例13
[0152]
t细胞可被共修饰以表达car并分泌pd-1封阻性scfv(e27)。图16a代表流式细胞仪图，其展示在以单1928z car(1928z)或1928zcar与e27 pd-1封阻性scfv(1928z-e27)转导后，在以特异性地结合1928z car的19e3 mab染色后的相等的car表达。图16b显示来自以抗ha mab染色的1928z与1928z-e27 t细胞的sn上的免疫印迹，其仅仅在1928z-e27细胞显示～30kda蛋白质，说明e27 scfv是从1928z-e27转导的t细胞而非以单car转导的t细胞处分泌。图16c代表流式细胞仪，其显示转导后在1928z-e27 t细胞上的pd-1表达水平显著低于在1928z t细胞上的。相较于在1928z t细胞上，在1928z-e27 t细胞上的pd-1的表达在统计上显著较低，所显示的数据来自4个独立实验的平均 /-sem(图16d)。4小时
51
cr释放分析，其显示raji肿瘤细胞的裂解未受e27 scfv分泌影响。1928z与1928z-e27 t细胞相等地裂解raji肿瘤细胞。相较于4h1128z t细胞，对照组4h1 128z-e27 t细胞未增加raji细胞的裂解
(图16e)。显示的数据是两个独立实验的代表。
[0153]
实施例14
[0154]
在cd19
pd-l1
肿瘤细胞的背景中，car与e27的表达会保护t细胞的增殖能力与裂解能力。raji肿瘤细胞是经逆转录病毒修饰以表达人类pd-l1(raji-pdl1)和是用对pd-l1有特异性的mab染色。亲代raji肿瘤(raji)未表达pd-l1且raji-pdl1肿瘤细胞表达高水平的pd-l1(图17a)。图17b代表流式细胞仪图，其显示如72小时共培养后以流式细胞仪测定的，相较于1928z t细胞，1928z-e27 t细胞裂解更多的raji-pdl1肿瘤细胞。相较于1928z t细胞，1928z-e27t细胞统计上显著裂解更多的raji-pdl1肿瘤细胞，所显示的数据是来自4个独立的实验的平均 /-sem(图17c)。如由流式细胞仪与计算珠粒所测定的，在与raji-pdl1肿瘤细胞共培养后，1928z-e27 t细胞扩增至更大的数目，所显示的数据来自4个独立的实验的t细胞的平均总数 /-sem(图17d)。图17e代表流式细胞仪图，其显示在与raji-pdl1肿瘤细胞共培养7日后，相较于1928z-e27 t细胞，在1928z t细胞上的pd-1表达增加。关于pd-1染色的阳性细胞百分比与平均荧光强度(mfi)，相较于1928z-e27 t细胞，1928z t细胞显著表达更多的pd-1。数据以来自4个独立的实验的平均 /-sem显示(图17f)。图17g代表流式细胞仪图，其显示在与raji-pdl1共培养7日后，相较于1928z-e27细胞，2b4 pd-1 1928z t细胞的百分比增加。在2b4 pd-1 族群上1928z-e27 t细胞也表达较少的btla与tim3。所显示的数据是3个独立实验的代表。
[0155]
实施例15
[0156]
在pd-l1的背景中e27保护经cd3/cd28刺激的t细胞的增殖能力。nih3t3细胞经逆转录病毒修饰以表达人类pd-l1(3t3-pdl1)且是用对pd-l1有特异性的mab染色。亲代nih3t3(3t3-空)未表达pd-l1且3t3-pdl1肿瘤细胞表达高水平的pd-l1(图18a)。1928z与1928z-e27 t细胞是以3t3-空细胞或3t3-pdl1细胞培养并以cd3/cd28珠粒刺激。计算细胞并于第3、6、9与12日再涂盘在新的3t3细胞上。当以3t3-pdl1细胞培养时，相较于以3t3-空细胞培养，1928z t细胞的扩增减少。当在3t3-空细胞或3t3-pdl1细胞上培养时，1928z-e27细胞具有相等的扩增(图18b)。所显示的数据是来自4个独立的实验的平均扩增倍数 /-sem。图18c代表流式细胞仪图，其显示相较于在3t3-空细胞上培养的1928z t细胞，在以3t3-pdl1培养的1928z t细胞上2b4、pd-1、btla与tim3的表达增加。当以3t3-空与3t3-pdl1培养时，1928z-e27细胞具有相等的2b4、pd-1、rtla-4与tim3的表达。所显示的数据是3个独立实验的代表。
[0157]
实施例16
[0158]
分泌e27 scfv的car t细胞具有增加的活体内抗肿瘤功能。scid-米色小鼠用raji-pdl1肿瘤细胞静脉灌注接种，且于次日用car t细胞静脉灌注。如图19所示，相较于以1928z t细胞治疗的小鼠，以1928z-e27 t细胞治疗的小鼠具有提高的存活。相较于未经治疗的小鼠和以靶向不相关抗原的car t细胞(4h1128z与4h1128z-e27细胞)治疗的小鼠，以1928z t细胞治疗的小鼠存活较长。所显示的数据来自2个独立的实验。
[0159]
实施例17
[0160]
抗pd-1抗体et130-23、et130-26与et130-27通过elisa测试以检查与pd1/pdl1结合的封阻功效。如图20所示，et901(阴性对照组)未显示结合，而et130-23、et130-26与et130-27在介于0.031与10μg/ml间的浓度范围显示了对pd1/pdl1结合的封阻功效。
[0161]
类似地，et130-23、et130-26与et130-27通过elisa测试以检查对pd1/pdl2结合的封阻功效。如图21所示，et901(阴性对照组)未显示结合，而et130-23、et130-26与et130-27在相同的浓度范围显示对pd1/pdl2结合的封阻功效。et130-26显示对pd1/pdl2最高的的封阻功效，而et130-23显示最低的功效。封阻模式与pd1/pdl1结合平行。
[0162]
实施例18
[0163]
研究抗pd-1scfv或单克隆抗体的应用因scfv或单克隆抗体抑制免疫应答与破坏自体免疫疾病的能力。此也可使用gvhd的小鼠模型研究。将人类t细胞灌注至经照射处理的nod.scid.il-2rγ-/-中导致人类细胞的移植与严重的gvhd，其中人类t细胞攻击小鼠组织。将分泌抗pd-1scfv的t细胞(或以注射单克隆抗体来增强的t细胞)灌注至受试者中并评估gvhd的发展。当抗pd-1scfv/mab是促效性时，gvhd反应由于人类t细胞的抑制而被抑制。
[0164]
例示性实施例
[0165]
1、一种重组抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含以下之一：
[0166]
(a)抗原结合区域，其具有选自由以下所组成的群组的氨基酸序列：seq id no：10，seq id no：21，seq id no：32，seq id no：43，seq id no：53，seq id no：61，seq id no：72，seq id no：83，seq id no：94，seq id no：103，seq id no：114，seq id no：125，seq id no：133，seq id no：142；其片段，和其同源序列；
[0167]
(b)抗原结合区域，其包含分别具有选自以下者的氨基酸序列的可变轻链(vl)和可变重链(vh)：seq id nos：6和8；seq id nos：17和19；seq id nos：28和30；seq id nos：39和41；seq id nos：49和51；seq id nos：57和59；seq id nos：68和70；seq id nos：79和81；seq id nos：90和92；seq id nos：99和101；seq id nos：110和112；seq id nos：121和123；seq id nos：129和131；seq id nos：138和140；其片段，和其同源序列；
[0168]
(c)抗原结合区域，其包含：(i)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列qsissy(seq id no：1)、aas和qqsystplt(seq id no：2)的轻链互补决定区(lccdr)lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftsssyw(seq id no：4)、ikqdgsek(seq id no.5)和arggwsydm(seq id no：6)的重链互补决定区(hccdr)hccdr1、hccdr2和hccdr3；其片段或其同源序列；
[0169]
(ii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列ssnigagya(seq id no：12)、tnn和qsydsslsgvi(seq id no：13)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gytltels(seq id no：14)、fdpedget(seq id no.15)和arayygfdq(seq id no：16)的hccdr1、hccdr2和hccdr3；其片段或其同源序列；
[0170]
(iii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列ssnignna(seq id no：23)、ynd和aawddsvngyv(seq id no：24)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gytftrfg(seq id no：25)、isvnngnt(seq id no.26)和arymygrrds(seq id no：27)的hccdr1、hccdr2和hccdr3；其片段或其同源序列；
[0171]
(iv)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigsks(seq id no：34)、yds和qvwdnhsdvv(seq id no：35)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列rnkfssya(seq id no：36)、isgsggtt(seq id no.37)和arwyssyydv(seq id no：38)；其片段或其同源序列；
[0172]
(v)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigsks(seq id no：34)、yds和
qvwdsssdyv(seq id no：45)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfssya(seq id no：46)、isgsggst(seq id no.47)和arnyismfds(seq id no：48)；其片段或其同源序列；
[0173]
(vi)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigsks(seq id no：34)、yds和qvwdsssdhv(seq id no：55)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfssya(seq id no：46)、isgsggst(seq id no.47)和argyssyyda(seq id no：56)；其片段或其同源序列；
[0174]
(vii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列rsnigent(seq id no：63)、snn和aawddrlngyv(seq id no：64)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gytftnyg(seq id no：65)，igaqkgdt(seq id no.66)和arsqgvpfds(seq id no：67)；其片段或其同源序列；
[0175]
(viii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列rsnigsnt(seq id no：74)、nnn和atwddslneyv(seq id no：75)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gytftryg(seq id no：76)、isgyngnt(seq id no.77)和arhgygyhgd(seq id no：78)；其片段或其同源序列；
[0176]
(ix)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列ssnigagyv(seq id no：85)、hnn和qsydsslsgwv(seq id no：86)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfkdyy(seq id no：87)、istsgnsv(seq id no.88)和arspghsdyds(seq id no：89)；其片段或其同源序列；
[0177]
(x)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigdks(seq id no：96)、yds和qvwasgtdhpyvi(seq id no：97)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfssya(seq id no：46)、isgsggst(seq id no.47)和armygsytdm(seq id no：98)；其片段或其同源序列；
[0178]
(xi)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列ssnigyny(seq id no：105)、rnn和tswddslsgyv(seq id no：106)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gnaftnfy(seq id no：107)、inpsgtdlt(seq id no.108)和arqyaygysgfdm(seq id no：109)；其片段或其同源序列；
[0179]
(xii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列qsvsnw(seq id no：116)、aas和qqsystpit(seq id no：117)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gytftsyy(seq id no：118)、inpntggs(seq id no.119)和argdvtyde(seq id no：120)；其片段或其同源序列；
[0180]
(xiii)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigsks(seq id no：34)、ydd和qvwdindhyv(seq id no：127)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfssya(seq id no：46)、isgsggst(seq id no.47)和arsqasfmdi(seq id no：128)；其片段或其同源序列；
[0181]
(xiv)轻链(lc)，其包含分别具有氨基酸序列nigsks(seq id no：34)、dds和qvwdsssdqgv(seq id no：135)的lccdr1、lccdr2和lccdr3，以及重链(hc)，其包含分别具有氨基酸序列gftfssya(seq id no：46)、igtgggt(seq id no.136)和argtgydgdq(seq id no：137)；其片段或其同源序列。
[0182]
2、根据实施例1所述的重组抗原结合蛋白，其中所述蛋白是抗体。
[0183]
3、根据实施例2所述的重组抗原结合蛋白，其中所述抗体是人类抗体。
[0184]
4、根据实施例2所述的重组抗原结合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段是完整ig、fab、f(ab')2、fv、或scfv。
[0185]
5、根据实施例1所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是pd-1激动剂。
[0186]
6、根据实施例1所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是pd-1拮抗剂。
[0187]
7、根据实施例1所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(car)。
[0188]
8、一种核酸，其编码根据实施例1-7任一所述的抗原结合蛋白。
[0189]
9、一种载体，其包含根据实施例8所述的核酸。
[0190]
10、一种细胞，其包含根据实施例1-7中任一所述的抗原结合蛋白、根据实施例8所述的核酸或根据实施例9所述的载体。
[0191]
11、一种根据实施例1-7中任一所述的抗原结合蛋白，其结合至治疗剂。
[0192]
12、根据实施例11所述的抗原结合蛋白，其中所述治疗剂是药物、毒素、放射性同位素、蛋白质或肽。
[0193]
13、一种医药组成物，其包含根据实施例1-7中任一所述的抗原结合蛋白、根据实施例8所述的核酸、根据实施例9所述的载体、根据实施例10所述的细胞或根据实施例11或12所述的抗原结合蛋白。
[0194]
14、根据实施例13所述的医药组成物，其进一步包含医药上可接受的载剂。
[0195]
15、一种在受试者中提高t细胞应答的方法，其包含将治疗有效量的根据实施例1-7中任一所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段、根据实施例8所述的核酸、根据实施例9所述的载体、根据实施例10所述的细胞、根据实施例11或12所述的抗原结合蛋白或根据实施例13或14所述的医药组成物施用于所述受试者。
[0196]
16、根据实施例15所述的方法，其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段抑制、减少、调控或消除由pd-1介导的信号转导。
[0197]
17、一种用于治疗患有pd1阳性疾病的受试者的方法，其包含将治疗有效量的根据实施例1-7中任一所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段、根据实施例8所述的核酸、根据实施例9所述的载体、根据实施例10所述的细胞、根据实施例11或12所述的抗原结合蛋白或根据实施例13或14所述的医药组成物施用于所述受试者。
[0198]
18、根据实施例17所述的方法，其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段是具有与其连接的细胞毒性部分的结合物。
[0199]
19、根据实施例17或18所述的方法，其中所述pd-1阳性疾病是癌症。
[0200]
20、一种根据实施例1-7中任一所述的重组抗pd1抗原结合蛋白或其抗原结合片段、根据实施例8所述的核酸、根据实施例9所述的载体、根据实施例10所述的细胞、根据实施例11或12所述的抗原结合蛋白或根据实施例13或14所述的医药组成物的用途，其用于通过抑制pd1结合至pd1配体来治疗pd1阳性疾病。
[0201]
21、根据实施例20所述的用途，其中所述pd1阳性疾病是癌症。
[0202]
22、一种根据实施例1-7中任一所述的重组抗pd1抗原结合蛋白或其抗原结合片段、根据实施例8所述的核酸、根据实施例9所述的载体、根据实施例10所述的细胞、根据实
施例11或12所述的抗原结合蛋白或根据实施例13或14所述的医药组成物的用途，其用于通过抑制pd-1信号途径进行免疫调控。
[0203]
23、一种载体，其包含编码重组抗pd-1抗原结合蛋白的核酸与编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白与所述嵌合抗原受体不同。
[0204]
24、一种细胞，其包含根据实施例23所述的载体。
[0205]
25、一种细胞，其包含编码重组抗pd-1抗原结合蛋白的核酸与编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白与所述嵌合抗原受体不同。
[0206]
26、一种细胞，其包含重组抗pd-1抗原结合蛋白与嵌合抗原受体，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白与所述嵌合抗原受体不同。
[0207]
27、根据实施例23-26任一所述的载体或细胞，其中所述嵌合抗原受体不与pd-1特异性地结合。
[0208]
28、根据实施例23-27任一所述的载体或细胞，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白是抗体。
[0209]
29、根据实施例23-28任一所述的载体或细胞，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白是人类抗体。
[0210]
30、根据实施例23-29任一所述的载体或细胞，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白是完整ig、fab、f(ab’)2、fv或scfv。
[0211]
31、根据实施例23-30任一所述的载体或细胞，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白是pd-1激动剂。
[0212]
32、根据实施例23-30任一所述的载体或细胞，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白是pd-1拮抗剂。
[0213]
33、根据实施例23-32任一所述的载体或细胞，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白是可分泌的蛋白。
[0214]
34、根据实施例23-33任一所述的载体或细胞，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白包含根据实施例1所述的抗原结合区域。
[0215]
35、根据实施例23-34任一所述的载体或细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性地结合至cd-19。
[0216]
36、根据实施例23-35任一所述的载体或细胞，其中所述嵌合抗原受体可被插入人类t细胞膜中。
[0217]
37、根据实施例24-36任一所述的细胞，其中所述细胞是t细胞。
[0218]
38、一种医药组成物，其包含根据实施例23-37任一所述的载体或细胞。
[0219]
39、根据实施例38所述的医药组成物，其进一步包含医药上可接受的载剂。
[0220]
40、一种在受试者中提高t细胞应答的方法，其包含将治疗有效量的根据实施例23-37任一所述的载体或细胞、或根据实施例38或39所述的医药组成物施用于所述受试者，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白是pd-1拮抗剂。
[0221]
41、根据实施例40所述的方法，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白抑制、减少、调控或消除由pd-1介导的信号转导。
[0222]
42、一种在受试者中减少t细胞应答的方法，其包含将治疗有效量的根据实施例23-37任一所述的载体或细胞、或根据实施例38或39所述的医药组成物施用至所述受试者，
其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白是pd-1激动剂。
[0223]
43、一种用于治疗患有pd1阳性疾病的受试者的方法，其包含将治疗有效量的根据实施例23-37任一所述的载体或细胞、或根据实施例38或39所述的医药组成物施用于所述受试者。
[0224]
44、一种用于治疗患有pd1阳性疾病的受试者的方法，其包含用编码重组抗pd-1抗原结合蛋白的核酸与编码嵌合抗原受体的核酸转导该受试者的至少一个t细胞，其中所述重组抗pd-1抗原结合蛋白与所述嵌合抗原受体不同。
[0225]
45、根据实施例44所述的方法，其中所述嵌合抗原受体不与pd-1特异性地结合。
[0226]
46、根据实施例42-45任一所述的方法，其中所述pd1阳性疾病是癌症。
[0227]
47、一种根据实施例23-37任一所述的载体或细胞、或根据实施例38或39所述的医药组成物的用途，其用于通过抑制pd1结合至pd1配体来治疗pd1阳性疾病。
[0228]
48、根据实施例47所述的用途，其中所述pd1阳性疾病是癌症。
[0229]
49、一种根据实施例23-37任一所述的载体或细胞、或根据实施例38或39所述的医药组成物的用途，其用于通过抑制pd-1信号途径进行免疫调控。
[0230]
50、一种根据实施例5所述的抗原结合蛋白、根据实施例23-27任一所述的医药组成物的用途，其中重组抗pd-1抗原结合蛋白为pd-1激动剂，用于治疗自身免疫疾病。
[0231]
51、根据实施例23-37任一所述的载体或细胞，其中抗pd-1抗原结合蛋白和嵌合抗原受体中的至少一种与治疗剂结合。
[0232]
52、根据实施例51所述的载体或细胞，其中所述治疗剂为药物、毒素、放射性同位素、蛋白质或肽。
[0233]
53、根据实施例17、42-45任一所述的方法，其中所述抗原结合蛋白或重组抗pd-1抗原结合蛋白为pd-1激动剂，其中pd-1阳性疾病为自身免疫疾病。
[0234]
参考文献
[0235]
brentjens,r.j.,m.l.davila,等人(2013)."cd19-targeted t cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia."sci transl med5(177):177ra138.
[0236]
brentjens,r.j.,j.b.latouche,等人(2003)."eradication of systemic b-cell tumors by genetically targeted human t lymphocytes co-stimulated by cd80 and interleukin-15."nat med 9(3):279-286.
[0237]
brentjens,r.j.,e.santos,等人(2007)."genetically targeted tcells eradicate systemic acute lymphoblastic leukemia xenografts."clin cancer res 13(18pt 1):5426-5435.
[0238]
davila,m.l,i.riviere,等人(2014)."efficacy and toxicity management of 1 9-28z car t cell therapy in b cell acute lymphoblastic leukemia."sci transl med 6(224):224ra225.
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。