2-氨基-4-氧代-喹唑啉二硫代甲酸酯衍生物及其药物组合物和用途的制作方法

2
‑
氨基
‑4‑
氧代
‑
喹唑啉二硫代甲酸酯衍生物及其药物组合物和用途
技术领域
1.本文涉及药物化学领域，更具体地说涉及2
‑
氨基
‑4‑
氧代
‑
喹唑啉二硫代甲酸酯衍生物，及其药物组合物和用途。


背景技术：

2.喹唑啉是一种重要的杂环化合物母体，其衍生物可针对叶酸依赖性酶、蛋白激酶、乳腺癌耐药蛋白、微管蛋白等不同的靶点发挥抗肿瘤作用(bansal,r.；malhotra,a.therapeutic progression of quinazolines as targeted chemotherapeutic agents.european journal of medicinal chemistry 2021,211,113016)。在喹唑啉的c5、c6位进行修饰，所得化合物可作为经典、非经典抗叶酸剂和抗肿瘤试剂，例如连有谷氨酸残基的经典胸苷酸合酶(thymidylate synthase,ts)抑制剂雷替曲塞(raltitrexed)等，目前已经广泛应用于癌症的临床治疗。而2
‑
氨基
‑4‑
氧代喹唑啉衍生物ag337则是一种用疏水性基团代替谷氨酸残基的非经典胸苷酸合酶抑制剂，它能够避免由经典抗叶酸代谢途径所带来的潜在耐药性(rafi,i.；taylor,g.a.；calvete,j.a.；boddy,a.v.；balmanno,k.；bailey,n.；lind,m.；calvert,a.h.；webber,s.；jackson,r.c.；johnston,a.；clendeninn,n.；newell,d.r.clinical pharmacokinetic and pharmacodynamic studies with the nonclassical antifolate thymidylate synthase inhibitor 3,4
‑
dihydro
‑2‑
amino
‑6‑
methyl
‑4‑
oxo
‑5‑
(4
‑
pyridplthio)
‑
quinazolone dihydrochloride(ag337)given by 24
‑
hour continuous intravenous infusion.clin cancer res 1995,1,1275
‑
1284)。另一方面，氨基二硫代甲酸酯衍生物具有良好的抗肿瘤活性。提取自大白菜中的天然产物brassinin是一种吲哚二硫代甲酸酯衍生物(takasugi,m.；katsui,n.；shirata,a.isolation of 3novel sulfur
‑
containing phytoalexins from the chinese
‑
cabbage brassica
‑
campestris l ssp pekinensis(cruciferae).j chem soc chem comm 1986,1077
‑
1078)，能够通过诱导ii相药物代谢酶发挥肿瘤预防作用(gerhauser,c.；you,m.；liu,j.f.；moriarty,r.m.；hawthorne,m.；mehta,r.g.；moon,r.c.；pezzuto,j.m.cancer chemopreventive potential of sulforamate,a novel analogue of sulforaphane that induces phase 2drug
‑
metabolizing enzymes.cancer res 1997,57,272
‑
278；mehta,r.g.；liu,j.f.；constantinou,a.；thomas,c.f.；hawthorne,m.；you,m.；gerhauser,c.；pezzuto,j.m.；moon,r.c.；moriarty,r.m.cancer chemopreventive activity of brassinin,a phytoalexin from cabbage.carcinogenesis 1995,16,399
‑
404)。brassinin还能够抑制吲哚胺
‑
2,3
‑
二氧化酶，阻断肿瘤免疫逃逸机制(kim,s.m.；oh,e.y.；lee,j.h.；nam,d.；lee,s.g.；lee,j.；kim,s.h.；shim,b.s.；ahn,k.s.brassinin combined with capsaicin enhances apoptotic and anti
‑
metastatic effects in pc
‑
3human prostate cancer cells.phytotherapy research:ptr 2015,29,1828
‑
36)。因此，二硫代甲酸酯衍生物在抗肿瘤方面的应用引起了研究者们极大的关注。
[0003][0004]
本发明人曾将氨基二硫代甲酸酯作为侧链引入到4(3h)
‑
喹唑啉酮的c6位，合成了4(3h)
‑
喹唑啉酮作为酯基组分的氨基二硫代甲酸酯衍生物(结构式2)，对人白血病k562细胞的增殖具有显著的抑制作用(曹胜利,4
‑
喹唑啉酮衍生物及其在抗肿瘤药物中的应用,中国专利号：zl200510053618.5)。
[0005][0006]
结构式2. 4(3h)
‑
喹唑啉酮作为酯基组分的氨基二硫代甲酸酯衍生物。


技术实现要素：

[0007]
本发明人在2
‑
氨基
‑4‑
氧代
‑
喹唑啉二硫代甲酸酯衍生物的研究中令人惊奇地发现了一种广谱且对耐药瘤株有效的化合物。
[0008]
本技术提供了一种2
‑
氨基
‑4‑
氧代
‑
喹唑啉二硫代甲酸酯衍生物，所述衍生物的化学结构如式a所示：
[0009][0010]
化学名为：(吡啶
‑4‑
基甲基)氨基二硫代甲酸
‑
(2
‑
氨基
‑4‑
氧代
‑
喹唑啉
‑6‑
基)甲酯。
[0011]
另一方面，本技术提供了包含上述2
‑
氨基
‑4‑
氧代
‑
喹唑啉二硫代甲酸酯衍生物的药物组合物。
[0012]
第三方面，本技术提供了上述2
‑
氨基
‑4‑
氧代
‑
喹唑啉二硫代甲酸酯衍生物或其药物组合物作为抗肿瘤药物的用途。
[0013]
在一些实施方案中，本技术提供了一种2
‑
氨基
‑4‑
氧代
‑
喹唑啉二硫代甲酸酯衍生物，所述衍生物的化学结构如式a所示：
[0014][0015]
化学名为：(吡啶
‑4‑
基甲基)氨基二硫代甲酸
‑
(2
‑
氨基
‑4‑
氧代
‑
喹唑啉
‑6‑
基)甲酯；
nmr system 600/150mhz超导核磁共振谱仪测定，tms为内标。柱色谱使用200
‑
300目柱色谱硅胶填充。
[0026]
人肺癌细胞株a549、人结肠癌细胞株hct
‑
116、ht
‑
29、人乳腺癌细胞株mcf
‑
7、人宫颈癌细胞株hela及紫杉醇耐药的人肺癌细胞株a549/taxol均由dna损伤应答北京市重点实验室提供。dmem培养基、胎牛血清及0.25％胰酶(trypsin
‑
edta)均购自hyclone公司。双抗(青霉素
‑
链霉素)购自gemini公司。体外抗肿瘤活性实验所使用的celltiter mts细胞增殖试剂盒购自promega公司。
[0027]
实施例1
[0028]2‑
氨基
‑6‑
甲基
‑4‑
氧代喹唑啉(1)的制备
[0029]
将2
‑
氨基
‑5‑
甲基苯甲酸(3.0g,21.9mmol)、50％单氰胺水溶液(9.0g,107mmol)混于水中(10ml)，先回流反应30min，然后降至95℃反应8h。反应液冷却至室温，加入浓盐酸(5ml)和水(5ml)，室温搅拌20min。滤除析出的固体，滤液用25％的氨水调节ph值至7
‑
8，继续室温搅拌1h。滤集析出的固体，用水洗涤数次，室温干燥得到类白色固体3.45g，收率99％，mp>300℃。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6)δ:2.30(s,3h,ch3),6.36(br s,2h,nh2),7.09(d,j＝8.4hz,1h,喹唑啉环8
‑
h),7.37(dd,j＝8.4,1.8hz,1h,喹唑啉环7
‑
h),7.66(s,1h,喹唑啉环5
‑
h)10.93(br s,1h,nh).hrms(esi)m/z:c9h
10
n3o计算值([m h]

):176.0824；实测值:176.0818.
[0030]2‑
(三甲基乙酰氨基)
‑6‑
甲基
‑4‑
氧代喹唑啉(2)的制备
[0031]
将三乙胺(1.52g,15mmol)和特戊酰氯(1.81g,15mmol)依次加入到中间体1(1.75g,10mmol)和1,4
‑
二氧六环(20ml)的混合物中，回流反应30min。趁热过滤，滤饼用热的1,4
‑
二氧六环洗涤两次。合并滤液和洗液，旋转蒸发除去溶剂。残余物用乙醇处理，滤集不溶的固体，依次用乙醇和乙醚洗涤。粗产物用硅胶柱色谱法提纯(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝98/2,v/v)，得到白色固体1.94g，收率75％，mp 214
‑
216℃。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6)δ:1.25(s,9h,(ch3)3c),2.41(s,3h,ch3),7.41(d,j＝8.4hz,1h,喹唑啉环8
‑
h),7.58(d,j＝8.4hz,1h,喹唑啉环7
‑
h),7.85(s,1h,喹唑啉环5
‑
h),10.97(s,1h,nh),12.10(s,1h,nh).hrms(esi)m/z:c
14
h
18
n3o2计算值([m h]

):260.1399；实测值:260.1390.
[0032]2‑
(三甲基乙酰氨基)
‑6‑
溴甲基
‑4‑
氧代喹唑啉(3)的制备
[0033]
将中间体2(1.04mg,4.0mmol)、n
‑
溴代丁二酰亚胺(nbs,0.78g,4.4mmol)和过氧化苯甲酰(20mg,0.083mmol)溶于事先经硅胶柱色谱法纯化的四氯化碳中(30ml)，光照下回流反应1h。之后每4h添加5mg过氧化苯甲酰，继续回流反应至总时间为18h。反应液冷却至室温，滤集析出固体并依次用温水、乙醇和乙醚洗涤。粗产物用四氢呋喃重结晶，得到白色固体1.12g，收率83％，mp 201
‑
202℃。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6)δ:1.25(s,9h,(ch3)3c),4.86(s,2h,ch2br),7.50(d,j＝8.4hz,1h,喹唑啉环8
‑
h),7.81(dd,j＝8.4,1.8hz,1h,喹唑啉环7
‑
h),8.13(d,j＝1.8hz,1h,喹唑啉环5
‑
h),11.08(br s,1h,nh).hrms(esi)m/z:c
14
h
17
brn3o2计算值([m h]

):338.0504,340.0484；实测值:338.0494,340.0469.
[0034]2‑
氨基
‑6‑
溴甲基
‑4‑
氧代喹唑啉(4)的制备
[0035]
将中间体3(0.68g,2mmol)混于四氢呋喃(15ml)中，缓慢加入饱和氯化氢甲醇溶液(5ml)直至反应混合物变澄清。加入0.5ml水，升温至回流反应4h。旋转蒸发除去溶剂，残余物用丙酮洗涤，室温干燥。粗产物用无水乙醇重结晶，得到白色固体0.41g收率71％，mp>300
℃。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6)δ:4.41(s,2h,ch2br),6.48(br s,2h,nh2),7.18(d,j＝8.4hz,1h,喹唑啉环8
‑
h),7.50(dd,j＝8.4,1.8hz,1h,喹唑啉环7
‑
h),7.82(d,j＝1.8hz,1h,喹唑啉环5
‑
h),11.08(br s,1h,nh).hrms(esi)m/z:c9h9brn3o计算值([m h]

):253.9929,255.9909；实测值:253.9922,255.9902.
[0036]
(吡啶
‑4‑
基甲基)氨基二硫代甲酸
‑
(2
‑
氨基
‑4‑
氧代
‑
喹唑啉
‑6‑
基)甲酯(化合物式a)的制备
[0037]
将吡啶
‑4‑
基甲胺(0.22g,2mmol)、二硫化碳(0.6ml,10mmol)和研细的磷酸钾(0.42g,2mmol)混于n,n
‑
二甲基甲酰胺(10ml)中，室温搅拌0.5h。加入中间体4，继续室温搅拌4h。将反应液倾入水中，滤集析出的固体。粗产物用硅胶柱色谱法(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝90/10,v/v)提纯，得到白色固体0.53g，收率71％，mp 211.1
‑
214.0℃。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6)δ:4.58(s,2h,sch2),4.88(d,j＝5.4hz,2h,ch2吡啶),6.46(br s,2h,nh2),7.16(d,j＝8.4hz,1h,喹唑啉环8
‑
h),7.23(d,j＝6.0hz,2h,吡啶2
′‑
h,4
′‑
h),7.57(dd,j＝8.4,1.8hz,1h,喹唑啉环7
‑
h),7.90(d,j＝1.8hz,1h,喹唑啉环5
‑
h),8.50(d,j＝6.0hz,2h,吡啶3
′‑
h,5
′‑
h),10.53(t,j＝5.4hz,1h,nhch2)11.14(br s,1h,nh).
13
c nmr(150mhz,dmso
‑
d6)δ:38.30,48.78,117.09,122.67(2c),123.34,126.43,131.09,135.47,146.72,148.92,149.85(2c),152.39,162.67,197.67.hrms(esi)m/z:c
16
h
16
n5os2计算值([m h]

):358.0796；实测值:358.0789.
[0038]
实施例2
[0039]
(吡啶
‑2‑
基甲基)氨基二硫代甲酸
‑
(2
‑
氨基
‑4‑
氧代
‑
喹唑啉
‑6‑
基)甲酯(化合物5l)的制备
[0040]
根据实施例1的制备方法，采用吡啶
‑2‑
基甲胺代替吡啶
‑4‑
基甲胺。收率79％，白色固体，mp 179.0
‑
182.0℃(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝80/20,v/v)。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6)δ:4.57(s,2h,ch2s),4.92(d,j＝5.4hz,2h,nhch2),6.90(br s,2h,nh2),7.16(d,j＝8.4hz,1h,喹唑啉环8
‑
h),7.23(d,j＝7.8hz,1h,吡啶3
′‑
h),7.27(dd,j＝7.2,4.8hz,1h,吡啶5
′‑
h),7.58(dd,j＝8.4,2.4hz,1h,喹唑啉环7
‑
h),7.75(td,j＝7.8,1.8hz,1h,吡啶4
′‑
h),7.89(d,j＝2.4hz,1h,喹唑啉环5
‑
h),8.51(dd,j＝4.8,0.6hz,1h,吡啶6
′‑
h),10.64(t,j＝5.4hz,nhch2),11.71(br s,1h,nh).
13
c nmr(150mhz,dmso
‑
d6)δ:38.33,51.72,117.22,121.77,122.75,123.48,126.46,130.87,135.35,137.09,149.39,149.41,152.74,156.89,162.72,197.23.hrms(esi)m/z:c
16
h
16
n5os2计算值([m h]

):358.0796；实测值:358.0790.
[0041]
生物部分
[0042]
细胞培养条件
[0043]
所有肿瘤细胞均在37℃5％co2细胞培养箱中培养。待细胞铺满培养皿底部约80
‑
90％后，吸除原培养基，沿培养皿侧边缓慢加入约5ml的1
×
pbs缓冲液润洗细胞。吸除pbs，加入1ml 0.25％胰蛋白酶，轻摇培养皿使其铺满整个皿底并与细胞充分接触，吸除胰蛋白酶。将培养皿置于培养箱中，消化2
‑
3min。加入合适体积的新培养基终止细胞消化，轻轻吹打细胞，使细胞在培养基中单个悬浮分散。吸取1ml细胞悬液传至新的培养皿中，补齐培养皿中培养基到10ml。轻摇培养皿使细胞分散均匀，放入培养箱中培养。
[0044]
细胞增殖抑制实验
[0045]
使用celltiteraqueous one solution cell proliferation assay试剂盒
(promega)。待测化合物事先配成104μm的dmso溶液，
‑
20℃保存，解冻后使用，用培养基稀释至所需浓度。实验数据均为三次独立平行实验计算所得。
[0046]
按上述细胞传代方法制得细胞悬液，5
×
103/well的密度接种于96孔培养板中，留出两个孔作为空白，其余每孔加入90μl细胞悬液。在培养箱中培养24h后，吸除旧培养基，空白及本底孔加入100μl新培养基，其余孔加入配好的待测化合物的培养基溶液，放入培养箱中继续培养72h。预先将冷冻保存的mts溶液在室温下解冻，向96孔培养板每孔加入20μl mts溶液，放入培养箱2h，使用酶标仪(molecular devices spectramax m5)检测492nm波长处各孔的吸光值(od值)。按如下公式计算细胞增殖抑制率：
[0047]
细胞增殖抑制率(％)＝[1
‑
(od
细胞 待测化合物
‑
od
空白
)/(od
细胞 cm
–
od
空白
)]
×
100％
[0048]
其中od
细胞 待测化合物
、od
细胞 cm
、od
空白
值分别代表在492nm波长下测试组、空白组以及本底组的吸光值。通过spss 20for windows软件绘制抑制率的s型曲线，计算化合物的半抑制浓度(ic
50
)。
[0049]
体外抗肿瘤活性测试
[0050]
采用mts细胞增殖实验，以5
‑
氟尿嘧啶(5
‑
fu)为阳性对照，测试了化合物式a和化合物5l对人肺癌a549、乳腺癌mcf
‑
7、宫颈癌hela、结肠癌ht
‑
29和hct
‑
116细胞增殖的半抑制浓度(ic
50
)；还测试了化合物式a对人肺癌紫杉醇耐药株a549/taxol的ic
50
，阳性对照是紫杉醇(taxol)。结果分别见表1和表2。
[0051]
表1.化合物式a和化合物5l对a549、mcf
‑
7、hela、ht29和hct
‑
116细胞的ic
50
值
[0052][0053]
从表1中可见，相比于化合物5l，本技术化合物式a具有广谱的抗肿瘤活性，对于五种肿瘤细胞的ic
50
值均在20μm以下，好于或与阳性对照5
‑
氟尿嘧啶相当；其中，对a549细胞活性最好，ic
50
值为5.23μm。
[0054]
表2.化合物式a对a549/taxol的ic
50
值
[0055][0056]
从表2中可见，化合物式a不仅对a549具有细胞毒性，并且对a549/taxol(紫杉醇)也具备更好的细胞毒活性；同时，阳性对照紫杉醇对a549/taxol(紫杉醇)的活性较普通a549而言则急剧下降，这说明化合物式a能够克服肿瘤细胞的耐药性。
[0057]
虽然本技术所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本技术而采用的实施方式，并非用以限定本技术。任何本技术所属领域内的技术人员，在不脱离本技术所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本技术的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。