一种增强姜黄素抗肿瘤疗效的pH响应型硅酸铜纳米颗粒及其制备和应用

一种增强姜黄素抗肿瘤疗效的ph响应型硅酸铜纳米颗粒及其制备和应用
技术领域
1.本发明属于纳米生物医学领域，涉及一种可增强姜黄素抗肿瘤疗效的ph响应型硅酸铜纳米颗粒的制备与应用。


背景技术：

2.姜黄素是一种抗炎分子，可以和炎症信号通路招募的许多分子发生反应，从而抑制肿瘤启动和发展。但其在生理环境中的分散性较低，限制了其抗肿瘤疗效。有研究表明，姜黄素与铜离子(cu
2
)结合后可以产生单线态氧(1o2),从而抑制肿瘤细胞的相关蛋白酶活性，增强抗肿瘤能力。由此可见，cu
2
的存在是提高姜黄素抗肿瘤效果的关键因素之一。然而，1o2的产生依赖环境中的氧气(o2)。肿瘤环境乏氧的特性是影响1o2产生的一大阻碍。如何提高肿瘤中的o2含量是实现姜黄素高效肿瘤抑制的另一关键。


技术实现要素：

3.本发明的一个目的是针对如何提高姜黄素的抗肿瘤疗效，提供了一种ph响应型硅酸铜纳米颗粒的制备方法，增加纳米颗粒上铜元素的活性位点，促进铜离子和姜黄素协同作用，提高姜黄素的抗肿瘤疗效。
4.本发明一种ph响应型硅酸铜纳米颗粒的制备方法，采用水热法制备，具体包括以下步骤：
5.步骤(1)、将表面活性剂、氟化铵溶于去离子水混合溶液中，磁力搅拌1～2小时后加入正硅酸乙酯，磁力搅拌3～5小时，离心分离得到介孔二氧化硅颗粒；
6.步骤1中所述二氧化硅微球根据stober法制备，其粒径为80-120nm。
7.步骤(2)、将步骤(1)介孔二氧化硅颗粒分散在去离子水中形成白色乳液a；并将含铜化合物和马来酸二钠溶解在去离子水中得到溶液b；
8.步骤(3)、将步骤(2)中形成的乳液a和溶液b在搅拌中混合形成乳液c后，置于反应釜中，在高温下反应一定时间。
9.作为优选，步骤1中表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三乙基溴化铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵中的至少一种，优选为十六烷基三甲基溴化铵。
10.作为优选，步骤1中表面活性剂、氟化铵、正硅酸乙酯和水的摩尔比为0.19：3.2：1.776：(800-1200)。
11.作为优选，步骤2中白色乳液a中介孔二氧化硅浓度为0.5mg/ml-2mg/ml。
12.作为优选，步骤2中含铜化合物为乙酸铜、氯化铜、硝酸铜或硫酸铜。
13.作为优选，步骤3中水热反应温度为120-160℃，反应时间为5-15h。
14.作为优选，步骤3中含铜化合物与介孔二氧化硅的质量比为1：1-2。
15.本发明的第二个目的是提供一种硅酸铜纳米颗粒，采用以上方法制备得到。所述
硅酸铜纳米颗粒为中空海胆状结构，尺寸在150-200nm；铜在整个纳米颗粒中均匀分布。
16.本发明的第三个目的是提供上述硅酸铜纳米颗粒在作为姜黄素载体上的应用。
17.作为优选，将上述硅酸铜纳米颗粒分散在乙醇溶液中形成a溶液；将姜黄素和聚乙二醇(peg)溶于乙醇中形成b溶液；将a、b溶液混合后搅拌一段时间，获得负载姜黄素的硅酸铜纳米颗粒。
18.作为优选，b溶液中姜黄素与peg的质量比为(1:4)-(4:1)。
19.作为优选，硅酸铜纳米颗粒与姜黄素的质量比为(1:4)-(1:8)。
20.作为优选，a与b溶液混合后的搅拌时间为4-12h。
21.本发明的第四个目的是提供一种抗肿瘤药物cusio3/cur，包括通过经二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交连物dspe-peg-nh2修饰的姜黄素和硅酸铜纳米颗粒。
22.本发明提供的纳米给药系统中硅酸铜纳米颗粒与药物姜黄素的比例可以根据肿瘤细胞的类型进行调试。
23.进一步的，硅酸铜纳米颗粒与姜黄素的用量比例满足使其通过注射的方式顺畅地进入机体，并到达特定的肿瘤部位且肿瘤处富集最大即可。
24.本发明提供的硅酸铜纳米颗粒，其具有海胆状的形貌特征，使得比表面积更大，药物负载率也更大。硅酸铜纳米颗粒存在大量的铜元素活性位点，在释放出铜离子和姜黄素后，可以更好的进行协同反应，增加治疗效果。
25.本发明的第五个目的是提供一种给药系统，将上述抗肿瘤药物cusio3/cur分散在任何适于临床应用的生理盐水或缓冲盐中，以注射剂的方式施用至机体。
26.作为优选，所述的生理盐水为质量分数为0.9％的氯化钠溶液。
27.作为优选，所述的缓冲盐为ph＝7-9的pbs缓冲液。
28.在过氧化氢高表达的肿瘤区域，所述硅酸铜纳米颗粒降解得到铜离子，与姜黄素协同产生自由基(ros)，产生一定的抗肿瘤作用。由于姜黄素和铜离子是在肿瘤原位释放的，以硅酸铜纳米颗粒作为姜黄素载体可实现肿瘤选择性治疗。所述肿瘤包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或脑癌等。
29.本发明具有以下的优点：
30.1)本发明采用的硅酸铜纳米颗粒作为无机纳米颗粒药物载体，由于其中空海胆状形貌特征，可以做到较好的药物负载量，并在长时间保持稳定。
31.2)本发明cusio3/cur纳米给药系统可以递送姜黄素药物至肿瘤部位，提高化疗药物疗效，提供了一种针对肿瘤细胞进行肿瘤选择性治疗的新思路。
32.3)本发明硅酸铜纳米颗粒可通过epr效应在肿瘤聚集，提高肿瘤内cu
2
含量，cu
2
与姜黄素可以在肿瘤区域协同产生自由基(ros)。
33.4)以本发明提供的纳米材料作为姜黄素载体能够有区域选择性地在肿瘤弱酸性微环境中释放并生成cu-cur络合物，从而克服药物对正常组织产生的潜在生物毒性。
34.5)本发明提供的硅酸铜纳米材料，铜元素活性位点多，在肿瘤区域更加容易进行铜离子和姜黄素之间的作用，从而增大治疗效果。
35.6)本发明采用的硅酸铜纳米颗粒，在负载姜黄素后，获得良好的肿瘤细胞杀伤效果，同时生物体没有出现体重降低。
附图说明
36.图1是硅酸铜纳米颗粒的tem图；
37.图2是硅酸铜纳米颗粒中si，o和cu元素的eds元素分布；
38.图3是不同酸性条件下硅酸铜纳米颗粒的铜离子释放曲线；
39.图4显示了经不同方法处理后，4t1细胞的细胞存活率；
40.图5显示了经不同方法处理后，l929细胞的细胞存活率；
41.图6显示了经不同处理后小鼠肿瘤体积变化曲线，误差线是5只老鼠的肿瘤体积比的标准差；
42.图7显示了经不同处理后小鼠体重变化曲线，误差线是5只老鼠的体重标准差。
具体实施方式
43.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。需指出的是，以下若是有未特别详细说明的过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
44.如前所述，鉴于现有技术的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，提出了本发明的技术方案，其主要依据至少包括：(1)硅酸铜纳米颗粒具有海胆状的形貌特征，使得比表面积更大，存在大量的铜元素活性位点，药物负载率也更大。(2)硅酸铜纳米颗粒具有一定的过氧化氢酶活性，在生理条件下，硅酸铜纳米颗粒能在一定的时间内，催化h2o2，生成一定量的o2，在一定程度上改善肿瘤部位的乏氧，在释放出铜离子和姜黄素后，可以更好的进行协同反应，增加治疗效果。(3)硅酸铜纳米颗粒在生理条件下可以降解，在正常组织的中性ph条件下降解缓慢，在具备低ph的肿瘤部位，可以加速降解生成铜离子，因此，所述硅酸铜纳米颗粒生物安全性较好。(4)cusio3/cur纳米颗粒具有高选择性肿瘤毒性，可通过epr效应递送姜黄素药物到肿瘤部位，提高化疗药物的肿瘤富集，减少了传统给药途径引起的全身毒副作用，在肿瘤治疗中的起到一定促进作用。(5)硅酸铜纳米颗粒用作姜黄素载体在肿瘤部位释放姜黄素和铜离子后，可以协同作用提高瘤细胞内的自由基(ros)水平并抑制相关蛋白酶体活性，从而特异性诱导肿瘤细胞凋亡。所述蛋白酶包括但不限于超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、丝氨酸蛋白酶等。
45.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
46.一种ph响应型硅酸铜纳米颗粒的制备方法，采用水热法制备硅酸铜纳米颗粒。具体制备方法为：
47.步骤(1)、将表面活性剂、氟化铵溶于去离子水混合溶液中，磁力搅拌1～2小时后加入正硅酸乙酯，磁力搅拌3～5小时，离心分离得到介孔二氧化硅颗粒；
48.步骤1中所述二氧化硅微球根据stober法制备，其粒径为80-120nm。
49.步骤(2)、将步骤(1)介孔二氧化硅颗粒分散在去离子水中形成白色乳液a；并将含铜化合物和马来酸二钠溶解在去离子水中得到溶液b；
50.步骤(3)、将步骤(2)中形成的乳液a和溶液b在搅拌中混合形成乳液c后，置于反应釜中，在高温下反应一定时间。
51.作为优选，步骤1中表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三乙基溴化铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵中的至少一种，优选为十六烷基三甲基溴化铵。
52.作为优选，步骤1中表面活性剂、氟化铵、正硅酸乙酯和水的摩尔比为0.19：3.2：1.776：(800-1200)。
53.作为优选，步骤2中白色乳液a中介孔二氧化硅浓度为0.5mg/ml-2mg/ml。
54.作为优选，步骤2中含铜化合物为乙酸铜、氯化铜、硝酸铜或硫酸铜。
55.作为优选，步骤3中水热反应温度为120-160℃，反应时间为5-15h。
56.作为优选，步骤3中含铜化合物与介孔二氧化硅的质量比为1：1-2。
57.提供一种硅酸铜纳米颗粒，采用以上方法制备得到。所述硅酸铜纳米颗粒为中空海胆状结构，尺寸在150-200nm；铜在整个纳米颗粒中均匀分布。
58.提供硅酸铜纳米颗粒在作为姜黄素载体上的应用，负载姜黄素的步骤为：将上述硅酸铜纳米颗粒分散在乙醇溶液中形成a溶液；将姜黄素和聚乙二醇(peg)溶于乙醇中形成b溶液；将a、b溶液混合后搅拌一段时间，获得负载姜黄素的硅酸铜纳米颗粒。
59.作为优选，b溶液中姜黄素与peg的质量比为1:4-4：1.
60.作为优选，硅酸铜纳米颗粒与姜黄素的质量比为1:4-1：8。
61.作为优选，a与b溶液混合后的搅拌时间为4-12h。
62.提供硅酸铜纳米颗粒在作为姜黄素载体上的应用。
63.提供一种抗肿瘤药物，包括通过经二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交连物dspe-peg-nh2修饰的姜黄素和硅酸铜纳米颗粒。
64.提供一种给药系统，将上述抗肿瘤药物分散在任何适于临床应用的生理盐水或缓冲盐中，以注射剂的方式施用至机体。
65.作为优选，所述的生理盐水为质量分数为0.9％的氯化钠溶液。
66.作为优选，所述的缓冲盐为ph＝7-9的pbs缓冲液。
67.以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
68.实施例1
69.1、介孔二氧化硅的制备
70.十六烷基三甲基溴化铵(0.18g)和氟化铵(0.3g)首先溶解在45ml去离子水中，80℃磁力搅拌1小时后，将正硅酸乙酯(1ml)和乙醇(4ml)的混合溶液缓慢滴加到上述溶液，80℃磁力搅拌4小时后，通过离心(9000rpm，5分钟)收集合成的纳米球，并用乙醇洗涤三次，产物冷冻干燥48小时后，可得介孔二氧化硅纳米球，尺寸大约为80-120nm。
71.2、中空硅酸铜纳米颗粒的制备
72.将步骤1介孔二氧化硅(10mg)加入10ml去离子水中，超声分散形成白色乳液；将乙酸铜(10mg)和马来酸二钠(100mg)溶解于10ml去离子水中，将两份溶液混合均匀，超声搅拌30分钟。将混合乳液转移至内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，在140℃下保温12h，冷却
至室温，通过离心(9000rpm，5分钟)后，用去离子水洗涤3次即为产物cusio3。图1为cusio3的tem图，结果显示，该硅酸铜纳米颗粒粒径分布均匀，呈中空海胆状结构，大约在150-200nm；图2为硅酸铜中cu，si和o的eds元素分布，表明铜在整个纳米颗粒中均匀分布,且存在大量的铜活性位点。
73.实施例2、负载姜黄素的中空硅酸铜纳米颗粒的制备
74.将8毫克制备好的硅酸铜纳米颗粒加入乙醇中(5ml)，超声10分钟以形成均匀的分散。然后，将2毫克姜黄素和1毫克的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交连物dspe-peg-nh2加入乙醇中(5ml)，将上述两份溶液混合均匀，并室温下磁力搅拌6小时。通过离心(9000rpm，5分钟)后，用乙醇和水洗涤三次所得即为cusio3/cur纳米颗粒。
75.实施例3、实施例1制备的中空硅酸铜纳米颗粒在不同ph下的铜离子释放：
76.将1ml铜离子浓度为2mg
·
ml-1
的硅酸铜溶液密封在透析袋(mcwo：1000da)中，并浸入装有20ml不同ph(ph＝7.4，6.5和5.4)缓冲介质的离心管。以200转/分的速度摇动离心管，并在给定的间隔内，取出1ml的缓冲液，并返回1ml新鲜缓冲液，通过icp-aes分析取出的1ml的缓冲液中铜离子浓度。图3为不同酸性条件下硅酸铜颗粒的铜离子释放曲线，可知硅酸铜颗粒表现出ph依赖性的铜离子释放能力，在ph5.4的酸性缓冲液条件下，24h内可从硅酸铜颗粒中释放出93％的cu
2
，而在ph7.4的中性缓冲溶液中只有52％的cu
2
释放出来。在酸性缓冲液下，硅酸铜纳米颗粒释放cu
2
的速度比中性缓冲液更快，在肿瘤部位可以更好的进行聚集。
77.实施例4、
78.cur、实施例1制备得到cusio3、实施例2制备得到cusio3/cur对小鼠乳腺癌细胞(4t1)以及小鼠成纤维细胞(l929)的细胞毒性：将上述两种细胞以5
×
103个/孔的密度种于96孔板内，在5％co2下的37℃的培养箱下孵育过夜使细胞贴壁。之后，加入梯度浓度的cur、cusio3、cusio3/cur。经过24小时的进一步孵育，使用mtt法测定细胞存活率，图4为4t1细胞的细胞活性研究，图5为l929细胞的细胞活性研究。由图可知，cusio3/cur可抑制4t1细胞的增殖，并且呈剂量依赖关系，且在cur、cusio3、cusio3/cur中，载药后效果最佳。同等剂量下，cur、cusio3、cusio3/cur对正常细胞的伤害不大，说明cusio3/cur的ph响应性促进了铜离子在肿瘤中的释放，且铜离子和姜黄素络合后对肿瘤细胞造成一定伤害的同时，对正常细胞的造成较小伤害。
79.实施例4、实施例2制备得到cusio3/cur的体内抑瘤情况
80.6周雌性balb/c小鼠，平均重量为20克20只，在右后腿皮下注射1～106个4t1细胞，每只接种0.1ml的细胞悬液(分散在pbs中)，当肿瘤体积达到80-120mm3左右时，20只小鼠被随机分成4组：(1)小鼠仅瘤内注射生理盐水作为对照组；(2)小鼠瘤内注射生理盐水与cur，姜黄素注射量为6.5mg
·
kg-1
。；(3)小鼠瘤内注射生理盐水与实施例1制备得到cusio3，硅酸铜纳米颗粒注射量为25mg
·
kg-1
；(4)小鼠瘤内注射生理盐水与实施例2制备得到cusio3/cur，其中cusio3/cur中姜黄素注射量为6.5mg
·
kg-1
。。所有cur组、cusio3组或cusio3/cur组具有等效的cur剂量，并且具有等效的颗粒剂量。所有组在10天内每两天注射一次，并在注射后1天监测肿瘤体积和小鼠体重。如图6所示cusio3/cur组的肿瘤体积明显缩小，说明cusio3/cur不仅在细胞层面，动物的组织层面上对肿瘤治疗都能取得一定效果。图7显示了经不同处理后小鼠体重变化曲线，误差线是5只老鼠的体重标准差。
81.上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。