一种基于双功能多肽修饰过继性长效T细胞模型构建方法及应用与流程

一种基于双功能多肽修饰过继性长效t细胞模型构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种基于双功能多肽修饰过继性长效t细胞模型构建方法及应用。


背景技术：

2.过继性t细胞转移(act)疗法是通过激活、修复、改构、甚至重建患者抗肿瘤t细胞反应进行肿瘤治疗的方法，天然具有精准治疗的特征。近年来，act疗法在肿瘤治疗中的应用取得令人瞩目的进展，例如，嵌合抗原受体t细胞(car-t)疗法在血液系统肿瘤治疗中取得巨大进展。
3.另一种基因编辑过继性t细胞治疗技术是tcr-t技术，这种方法是通过基因编辑的方法引入具有对肿瘤抗原特异性识别能力的tcr，从而增强t细胞对癌细胞的免疫效应。不同t细胞所携带的tcr受体具有多样性，为实施针对不同肿瘤变异信息的精准医学治疗提供了足够的广度。而且，免疫细胞来源于患者自体，作为一种“活的药物”，具有自主性与自我适应能力，能有效缩短开发时间。tcr-t也有望成为肿瘤精准医疗的一个重要突破口。
4.然而，尽管act在一些非实体瘤的治疗中取得了进展，但对大部分实体瘤的治疗仍面临诸多问题，难以发挥疗效，其中最主要的就包括t细胞回输体内后持续发挥免疫作用的时间短就是其中的影响其疗效的主要挑战之一。


技术实现要素：

5.(一)解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于双功能多肽修饰过继性长效t细胞模型构建方法及应用解决了t细胞体内持续作用时间短的问题。
7.(二)技术方案
8.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种基于双功能多肽修饰过继性长效t细胞模型构建方法及应用，包括如下步骤：1.构建dspe-peg-dp7修饰的t细胞；2.考察dspe-peg-dp7双功能多肽增强t细胞浸润能力和长效作用；3.建立体外产生ny-eso-1特异性ctl的模型；4.建立对ny-eso-1表位特异性的过继性t细胞治疗人卵巢癌小鼠模型。
9.优选的，所述双功能多肽具有免疫刺激作用和穿膜双重效应的dp7以脂质插件dspe-peg-dp7的形式修饰t细胞，经修饰的t细胞模型具有增强的浸润能力和更长的免疫持续时间。
10.优选的，所述考察dspe-peg-dp7双功能多肽增强t细胞浸润能力和免疫效应作用具体体现为：用dspe-peg-dp7对cd8 t细胞进行修饰，通过体内体外实验对其浸润能力、免疫效应进行考察，包括体外实验：通过(1)浸润能力考察，包括跨血管内皮迁移试验，细胞粘附试验，肿瘤浸润实验；(2)免疫应答实验，包括t细胞增殖试验，cd134/cd137表达，cd107α脱颗粒试验，elisa检测tnf-α、il-2表达，elispot检测ifn-γ的表达试验；(3)t细胞长效考
察，包括干性相关基因tcf7,bcl-2等的qpcr检测，cd62l,ccr7，cxcr5的流式检测,细胞氨基酸代谢，糖代谢，以及能量代谢的检测。体内试验：在建立的表达ny-eso-1的hla-a02阳性乳腺癌小鼠模型中，尾静脉注射回输ny-eso-1特异性ctl细胞，考察肿瘤生长率和负荷率；肿瘤中t细胞的分布特征，取外周血流式检测其中回输细胞的比例。
11.优选的，所述跨血管内皮迁移试验为：从c57bl/6小鼠脾脏分离淋巴细胞，或健康人志愿者外周血分离pbmc,纯化得到cd8 t细胞，用dspe-peg-dp7对分离得到的细胞进行处理，同时将huvec接种在预先matrigel胶涂布的transwell小室的聚碳酸酯膜上，培养形成血管内皮单层，在上室加入处理后的t细胞，下室加入含趋化因子的培养基，24h后计数迁移到下室的细胞。
12.所述细胞粘附试验为：matrigel胶包被96孔板，0.5％bsa封闭2h降低非特异性结合，待进行粘附试验的t细胞用bcecf-am或calcein-am染色后，悬浮于pbs或hhmc缓冲液中，以5
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104/50ul的浓度加入每孔中，37℃作用30min，快速冲洗一次去除未粘附的细胞，以荧光定量粘附的细胞量；
13.所述肿瘤浸润实验为：建立小鼠乳腺癌模型，比较分析经dspe-peg-dp7体外处理的ny-eso-1特异性cd8 t细胞回输后在肿瘤的分布情况。
14.优选的，所述体外产生ny-eso-1特异性ctl的模型建立具体体现为：从人外周血分离得到pbmc，其中的贴壁细胞用于诱导dc细胞，悬浮细胞经磁珠纯化分理处cd8 t细胞，用诱导成熟并负载ny-eso-1多肽的dc细胞与cd8 t细胞按1:5混合，dc的再刺激频率为每周一次，每再刺激后5天后检测t细胞用t2细胞作为抗原负载细胞检测其抗原特异性免疫反应，最终获得ny-eso-1抗原特异性的ctl细胞。
15.优选的，所述对ny-eso-1表位特异性的过继性t细胞治疗人卵巢癌小鼠模型建立涉及一种稳定表达hla-a02(基因id:3105)的ny-eso-1阳性卵巢癌细胞系。所述的细胞系由重组表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-puro-hla-a02编码hla-a02转化。
16.所述新型基因修饰增强型ny-eso-1特异型tcr-t应用于实体瘤治疗，优选的，是对卵巢癌的治疗。
17.(三)有益效果
18.本发明提供一种基于双功能多肽修饰过继性长效t细胞模型构建方法及应用。具备以下有益效果：
19.1、本发明提供一种基于双功能多肽修饰过继性长效t细胞模型构建方法及应用，涉及生物技术领域。所述双功能多肽具有免疫刺激作用和穿膜效应的dp7以脂质插件dspe-peg-dp7的形式修饰t细胞，经修饰的t细胞模型具有增强的浸润能力和更长的免疫持续时间。
20.2、本发明还提供了基于双功能多肽修饰过继性长效t细胞在癌症研究和治疗中的用途，优选的，在用于ny-eso-1阳性肿瘤，尤其是卵巢癌的治疗中的应用。。
附图说明
21.图1为本发明项目总体技术路线示意图；
22.图2为本发明诱导的ny-eso-1特异性ctl产生ifn-γ的流式检测结果；
23.图3为本发明dspe-peg-dp7修饰t细胞的表征结果；
24.图4为本发明对ny-eso-1表位特异性的过继性t细胞治疗人卵巢癌小鼠模型skov3细胞hla-a02表达流式检测结果；
25.图5为本发明特异性ctl肿瘤细胞杀伤试验结果。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1：
28.如图1所示，本发明实施例提供一种基于双功能多肽修饰过继性长效t细胞模型构建方法，包括如下步骤：1.构建dspe-peg-dp7修饰的t细胞；2.考察dspe-peg-dp7双功能多肽增强t细胞浸润能力和长效作用；3.建立体外产生ny-eso-1特异性ctl的模型；4.建立对ny-eso-1表位特异性的过继性t细胞治疗人卵巢癌小鼠模型。考察dspe-peg-dp7双功能多肽增强t细胞浸润能力和长效免疫效应作用具体体现为：用dspe-peg-dp7对cd8 t细胞进行修饰，通过体内体外实验对其浸润能力、免疫效应进行考察，包括体外实验：(1)dspe-peg-dp7增强t细胞免疫应答的研究，通过(1)浸润能力考察，包括跨血管内皮迁移试验，细胞粘附试验，；(2)免疫应答实验，包括t细胞增殖试验，cd134/cd137表达，cd107α脱颗粒试验，elisa检测tnf-α、il-2表达，elispot检测ifn-γ的表达试验；(3)t细胞长效考察，包括干性相关基因tcf7,bcl-2等的qpcr检测，cd62l,ccr7，cxcr5的流式检测,细胞氨基酸代谢，糖代谢，以及能量代谢的检测。
29.体内试验：在建立的表达ny-eso-1的hla-a02阳性乳腺癌小鼠模型中，尾静脉注射回输ny-eso-1特异性ctl细胞，考察肿瘤生长率和负荷率；肿瘤中t细胞的分布特征，取外周血流式检测其中回输细胞的比例。
30.实施例2:
31.dc的体外诱导：
32.取细胞样品，1500rpm离心10分钟，取上清，56℃水浴35分钟后2500rpm
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10min离心，得到灭活血浆。细胞沉淀加入生理盐水至体积120ml。取4支50mlbd管分别加入15ml淋巴细胞分离液，然后吸取细胞混悬液，沿管壁轻轻加入bd管中，每管30ml。
33.细胞2000rpm
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20min离心(升速3，降速1)。细胞用50ml培养液洗三遍(1500rpm
×
15min,1500rpm
×
5min,1000rpm
×
5min)后，40ml培养液重悬细胞，计数，放入细胞培养箱培养2h。2h后，吸去上清，并用生理盐水轻轻洗去未贴壁的细胞，收集悬浮细胞用于淋巴细胞培养。重新加入dc细胞培养液(aim-vmediumcst 1％自体灭活血清 1000u/mlrhugm-csf 500u/mlrhuil-4)，37℃,5％co2继续培养。
34.每隔一天给细胞换液，上清中的细胞1000rpm
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5min离心后重新接种回去继续培养。第五天，加入ny-eso-1多肽40ug/ml刺激。
35.第六天，刺激dc成熟，刺激因子组合如下：rhutnf-ɑ
1000u/ml，ifn-γ2000u/ml，rhuil-1β10ng/ml，pge2250ng/ml，r8481ug/ml，poly(i：c)20ng/ml。
36.第七天，用手轻拍培养瓶，用吸管吹打方瓶底部，使得成熟dc脱离，然后把细胞液
装入50mlbd管中，1000rpm
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5min离心。离心后的细胞用50ml培养液重悬后，过100um细胞筛网。取样计数。
37.实施例3:
38.ny-eso-1特异性ctl的诱导：经cd8 t磁珠分选获得cd8 t细胞并分批冻存备用。将复苏的cd8 t细胞调整为1x106/ml与2x105负载ny-eso-1多肽的dc混合培养于aimv培养基(10％血清 4ug/mlβ2微球蛋白)中。第2天添加il-2(5iu/ml)和il-7(5ng/ml)。第5天半换液并补充il-2和il-7。每7天加入新的负载ny-eso-1多肽的dc进行再刺激，dc与t细胞比例保持为1:5。
39.每次再刺激5天后对t细胞的特异性进行检测，用负载ny-eso-1多肽的t2作为刺激细胞检测ctl的特异性反应，流式检测ifn-γ。如图2所示，在经过4轮再刺激后，以不负载多肽的t2细胞共孵育组为阴性对照，相比阴性对照，表明已经产生具有ny-eso-1特异性反映的ctl。
40.实施例4：
41.dspe-peg-dp7修饰t细胞
42.ctl细胞经ny-eso-1抗原再刺激的同时添加dspe-peg-dp7，共培养10天，期间每3天换一次液。
43.为对dspe-peg-dp7修饰t细胞的过程进行评价，利用荧光染料fitc标记的dspe-peg-dp7对t细胞进行修饰。如图3所示，经过将dspe-peg-dp7和活的t细胞经过的共孵育，即可插入细胞膜以及进入细胞质，完成初步修饰，并且随共孵育时间修饰程度逐步提升直至稳定。
44.实施例5:
45.重组表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-puro-tcr(ny-eso-1)-hla-a02的构建：
46.在所述tcr(ny-eso-1)-hla-a02插入片段的两端加入xbai和bamhi限制性酶切位点序列。将该核酸片段与慢病毒骨架载体pcdh-cmv-mcs-ef1-puro用限制性内切酶xbai和bamhi进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用t4连接酶过夜连接。转换大肠杆菌感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定，得到重组表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-puro-tcr(ny-eso-1)-hla-a02。
47.实施例6:
48.对ny-eso-1表位特异性的过继性t细胞治疗人卵巢癌小鼠模型
49.将构建的重组慢病毒载体用于转染skov3细胞，具体地，将上述重组质粒经无内毒素法提取后和包装质粒pmd2g，pspax2按一定比例混合(5:1:1),293t细胞作为包装细胞进行病毒的包装。包装48h，72h后收集培养上清，用0.45μm孔径滤膜过滤后，加入1/3体积的lenti-x浓缩试剂进行浓缩后，以moi＝20用于skov3细胞的感染。
50.传代2代以上的细胞经检测仍然稳定表达hla-a02，图4显示了流式检测转染并传代后的skov3细胞hla-a02的表达显著高于阴性对照，证明稳定表达hla-a02的skov3构建成功。
51.将该稳转skov3细胞株(1x106/鼠)接种到6-8周ncg小鼠的右背侧皮下，7天后形成超过50mm3的移植瘤，尾静脉回输过继性t细胞(1x107/鼠)进行治疗。
52.实施例7:特异性ctl的检测(细胞杀伤实验):
53.将上述稳转skov3细胞(hla-a02 nyeso1 )与野生型skov3细胞(hla-a02-nyeso1 )作为靶细胞进行对比，上述ctl作为效应细胞，按照效靶比为10:1，5:1，3:1，1:1接种到96孔中，不加ctl只有skov3细胞(hla-a02 nyeso1 )和野生型skov3细胞的孔作为对照组。每孔液体为100ul,将ctl和skov3细胞于37℃共孵育4-6h,将ctl和培养基一起弃去，重新加入100ul新的培养基，同时每孔加入10ul的cck8检测溶液，在37℃培养箱中孵育1h，酶标仪检测450nm的吸光度值，计算各组细胞活性(细胞活性％＝(实验组od450-空白od450)/(对照组od450-空白od450)
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100％)。
54.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。