一种番石榴果实RNA的高效提取方法

一种番石榴果实rna的高效提取方法
技术领域
1.本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种番石榴果实rna的高效提取方法。


背景技术：

2.目前，针对番石榴果实rna的提取方法中，普通方法难以提取的富含多糖、多酚的果实的总rna；普通方法提取样品量基本都在0.1g内，不适合大体积果实，0.1g样品代表性差，实验重复性差；普通方法提取果实总rna的浓度较低，提取的rna浓度一般低于100ng/ul，后续反转录加入模板体系较大，影响反转录效果；普通方法提取果实总rna的量较少(≤5ug)，不适合大量做荧光定量筛选候选基因，得多次提取，成本高，重复性差。因此，亟需一种新的番石榴果实rna的高效提取方法。
3.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
4.(1)普通方法难以提取的富含多糖、多酚的果实的总rna，提取样品量基本都在0.1g内，不适合大体积果实，0.1g样品代表性差，实验重复性。
5.(2)普通方法提取果实总rna的浓度较低，提取的rna浓度一般低于100ng/ul，后续反转录加入模板体系较大，影响反转录效果。
6.(3)普通方法提取果实总rna的量较少(可≤5ug)，不适合大量做荧光定量筛选候选基因，得多次提取，成本高，重复性差。
7.解决以上问题及缺陷的难度为：较难，试剂盒一般使用过柱法，吸附rna的量有限，另外提取体系较小；多糖多酚对一般提取液影响较大，rna得率受影响较大。就算通过多管提取重复过柱洗脱rna，提取量提高不明显且成本增高。
8.解决以上问题及缺陷的意义为：解决样品代表性差，做后续定量重复性差等问题，获得大量高质量的rna。


技术实现要素：

9.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种番石榴果实rna的高效提取方法。
10.本发明是这样实现的，一种番石榴果实rna的高效提取方法，所述番石榴果实rna的高效提取方法包括以下步骤：
11.步骤一，配制buffer a：将药品逐一加入溶解，定容，高温高压灭菌；能一定程度抑制rnase酶的活性。
12.步骤二，配制总rna提取液：使用buffer a配制；去除多糖多酚对提取rna的影响。
13.步骤三，组织裂解：于液氮中，将果实组织研磨成粉末状后转入无菌高速圆底离心管，加入rna提取液，另加蛋白酶k，剧烈混匀后轻微振荡提取；
14.缓慢提取，能有效的降解蛋白，降低提取体系的粘稠度，更好的释放rna。
15.步骤四，蛋白沉淀：加入2m kcl溶液，冰浴1h，中间混匀几次，高速离心；rna在水相，能与蛋白分离。
16.步骤五，rna沉淀：上清液转移到新的尖底离心管，加入1/3体积的8m licl，在4℃下过夜沉淀rna；离心后去除上清液，用2m licl溶液洗涤沉淀2次，直至沉淀为无色；licl能最大化的沉淀rna，不能沉淀蛋白和dna，同时有效去除游离核苷酸。
17.步骤六，rna纯化：加入10mm tris-hcl缓冲液溶解沉淀，并加入2m koac混合后在冰浴中保持30min，去除rna中的多聚糖和残留蛋白质；第一次离心，将上清液转移至干净离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，放置，第二次离心，沉淀rna；弃上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，离心并去除上层乙醇，真空干燥，用灭菌超纯水溶解rna，在-80℃冰箱中保存备用。获得浓度高，量大，高质量rna。
18.进一步，步骤一中，所述buffera置于4℃条件下可保存半年。可大量配制，多次使用。
19.进一步，步骤二中，所述总rna提取液现配现用，无需灭菌处理。现配现用，按需配制，能保证提取效果。
20.进一步，步骤三中，依据实验室离心机及实验材料，选择三个重量档次的样品：0.1g至0.5g、0.5g至2.0g、2.0g至10.0g。实验室平台不一样，可按需选择。
21.进一步，步骤三中，所述无菌高速圆底离心管的容积分别为2ml、10ml、50ml；所述rna提取液为80℃预热的rna提取液，分别为1.5ml、5ml、20ml；所述蛋白酶k分别为0.2mg、0.6mg、2.2mg。热提取液加到冷冻的粉状样品，更好的破坏组织细胞结构
22.进一步，步骤三中，所述轻微振荡提取的方法为：于42℃条件下保温并轻微振荡提取2h。缓慢提取，能有效的降解蛋白，降低提取体系的粘稠度，更好的释放rna。
23.进一步，步骤四中，所述kcl溶液分别为0.18ml、0.6ml、2.4ml；于4℃下放置1h，每20min上下颠倒混匀一次，充分沉淀蛋白，以20000g的转速离心30min；其中，所述转速可降低至12000g。rna在水相，能与蛋白分离。
24.进一步，步骤五中，所述上清液分别为1.5ml、6ml、21ml，所述尖底离心管的容积分别为2ml、10ml、50ml，所述licl溶液分别为1ml、2ml、4ml；所述rna沉淀时间为12～15h；10000g离心30min后去除上清液，沉淀即为rna的粗提物。licl能最大化的沉淀rna，不能沉淀蛋白和dna，同时有效去除游离核苷酸。
25.进一步，步骤六中，所述tris-hcl分别为0.2ml、0.5ml、2ml，ph 7.5；所述koac分别为20ul、50ul、200ul，所述离心管的容积分别为1.5ml、2ml、10ml，所述70％乙醇分别为1.0ml、1.0ml、4.0ml，所述灭菌超纯水分别为50ul、100ul、200ul。有效去除rna样品中的多糖，进一步纯化rna
26.进一步，步骤六中，所述第一次离心条件为：10000g离心15min；在-80℃的条件下放置0.5h后进行第二次离心，所述第二次离心条件为：10000g离心30min。低温有利于rna沉淀。
27.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的番石榴果实rna的高效提取方法，可以根据实验室离心机的型号、果实的大小(样品量)来选择不同的体系来完成，效果稳定。
28.本发明能无视果实中富含的多糖、多酚以及色素，提取高质量的总rna。
29.本发明提取样品量可根据实验材料，变化提取体系，样品量范围广泛(0.1～10g)，特别适合大体积果实，选择大样品量(10g)提取，代表性好，后续实验重复性好。
30.本发明的方法提取果实总rna的浓度可达5000ng/ul，后续反转录加入模板体系可控，不影响反转录效果；本发明提取果实总rna的量较大(可≥500ug)，适合大量做荧光定量筛选候选基因，无需多次提取，成本低。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1是本发明实施例提供的番石榴果实rna的高效提取方法流程图。
33.图2是本发明实施例提供的测量rna浓度和电泳检测提取情况示意图。
具体实施方式
34.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
35.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种番石榴果实rna的高效提取方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
36.如图1所示，本发明实施例提供的番石榴果实rna的高效提取方法包括以下步骤：
37.s101，配制buffer a：将药品逐一加入溶解，定容，高温高压灭菌；
38.s102，配制总rna提取液：使用buffera配制；
39.s103，组织裂解：于液氮中，将果实组织研磨成粉末状后转入无菌高速圆底离心管，加入rna提取液，另加蛋白酶k，剧烈混匀后轻微振荡提取；
40.s104，蛋白沉淀：加入2m kcl溶液，冰浴1h，中间混匀几次，高速离心；
41.s105，rna沉淀：上清液转移到新的尖底离心管，加入licl，过夜沉淀rna；离心后去除上清液，用licl溶液洗涤沉淀，直至沉淀为无色；
42.s106，rna纯化：加入tris-hcl缓冲液溶解沉淀，并加入koac混合后在冰浴中保持30min；第一次离心，将上清液转移至干净离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，第二次离心，沉淀rna；弃上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，离心并去除上层乙醇，真空干燥，用灭菌超纯水溶解rna，保存备用。
43.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
44.(1)配制buffer a，见表1，药品逐一加入溶解，最后定容，之后高温高压灭菌，4℃可保存半年。
45.表1
[0046][0047]
(2)接着配制总rna提取液(使用buffer a配制)：见表2，现配现用，不用灭菌处理；
[0048]
表2
[0049][0050]
(3)组织裂解：于液氮中，将xg(依据实验室离心机及实验材料，可选择三个重量档次的样品：0.1g至0.5g、0.5g至2.0g、2.0g至10.0g)果实组织研磨成粉末状后转入无菌高速圆底离心管(2ml、10ml、50ml)中，加入(1.5ml、5ml、20ml)经80℃预热的rna提取液，并加入(0.2mg、0.6mg、2.2mg)的蛋白酶k，于42℃下保温并轻微振荡提取2h。
[0051]
(4)蛋白沉淀：加入(0.18ml、0.6ml、2.4ml)kcl溶液(2m)于4℃下放置1h，每20min上下颠倒混匀一次，充分沉淀蛋白，以20000g(可降低至12000g)的转速离心30min。
[0052]
(5)rna沉淀：(1.5ml、6ml、21ml)上清液转移到新的尖底离心管(2ml、10ml、50ml)，加入1/3体积的8m licl，在4℃下过夜(12～15h)沉淀rna。10000g离心30min后去除上清液(沉淀即为rna的粗提液)，用2m licl溶液(1ml、2ml、4ml)洗涤沉淀2次，直至沉淀为无色。
[0053]
(6)rna纯化：加入(0.2ml、0.5ml、2ml)tris-hcl(10mm，ph 7.5)缓冲液溶解沉淀，并加入(20ul、50ul、200ul)koac(2m)混合后在冰浴中保持30min，以去除rna中的多聚糖和残留蛋白质。10000g离心15min，将上清液转移至干净(1.5ml、2ml、10ml)离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，在-80℃下放置0.5h后，10000g离心30min，沉淀rna。弃上清液，用(1.0ml、1.0ml、4.0ml)70％乙醇洗涤沉淀，离心并尽量去除上层乙醇，真空干燥，用(50ul、100ul、200ul)灭菌超纯水溶解rna，在-80℃冰箱中保存备用。
[0054]
该方法可以根据实验室离心机的型号、果实的大小(样品量)来选择不同的体系来完成，效果稳定。
[0055]
本发明能无视果实中富含的多糖、多酚以及色素，提取高质量的总rna。
[0056]
本发明提取样品量可根据实验材料，变化提取体系，样品量范围广泛(0.1～10g)，特别适合大体积果实，选择大样品量(10g)提取，代表性好，后续实验重复性好。
[0057]
本发明提取果实总rna的浓度可达5000ng/ul，后续反转录加入模板体系可控，不影响反转录效果。
[0058]
本发明提取果实总rna的量较大(可≥500ug)，适合大量做荧光定量筛选候选基
因，无需多次提取，成本低。
[0059]
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
[0060]
本实验同时提取4个样品番石榴果实总rna
[0061]
1.配制200ml buffer a：将药品逐一加入溶解，定容，高温高压灭菌后放4度冰箱保存；
[0062]
2.配制总rna提取液：每个样品需5ml，共配制30ml，使用buffer a配制；
[0063]
3.组织裂解：于液氮中，使用研钵或研磨机将果实组织研磨成粉末状后转入10ml无菌高速圆底离心管，加入预热5ml rna提取液和0.55mg蛋白酶k，剧烈混匀后，42℃，150rpm振荡提取2h；
[0064]
4.蛋白沉淀：加入480ul 2mkcl溶液，冰浴放置1h，每20min混匀一次，4℃，12000g至20000g离心30min；
[0065]
5.rna沉淀：上清液转移到新的10ml圆底离心管，加入1/3体积8mlicl，过夜沉淀rna(约14h)；4℃，10000g离心30min后去除上清液，用2ml 2m licl溶液洗涤沉淀，直至沉淀为无色；
[0066]
6.rna纯化：加入0.4ml 10mmtris-hcl缓冲液溶解沉淀，并加入10ul 2m koac混合后在冰浴中保持30min；第一次离心，将上清液转移至干净离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，第二次离心，沉淀rna；弃上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，离心并去除上层乙醇，真空干燥，用150ul灭菌超纯水溶解rna，测量rna浓度和电泳检测提取情况，如图2所示，-80℃冰箱保存备用。
[0067]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。