一种分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法

1.本发明属于细胞生物领域，具体涉及一种分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法。


背景技术：

2.纳米颗粒在细胞内的累积浓度是影响其毒性效应的一个重要因素。它主要取决于吸收和排出两者的平衡。由于多数纳米颗粒在细胞内无法降解，因此排出被认为是降低其毒性的最有效途径。另外，水生生物(尤其单细胞生物)体内累积的纳米颗粒可以被其捕食者摄入，因而纳米颗粒在生物体内的清除速率也会关系到它们在食物链中的迁移。深入了解生物排出纳米颗粒的过程，对认识纳米颗粒在水环境中的毒性机理与生物地球化学行为有十分重要的意义。然而，关于这方面的研究仍然十分有限。部分原因是排出的纳米颗粒与细胞难以分离，很难对排出的纳米颗粒进行定量，使其排出动力学的研究难以开展。


技术实现要素：

3.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种有效分离细胞与细胞排出的纳米颗粒的方法，为准确研究细胞内纳米颗粒的排出动力学提供基础。
4.为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
5.一种分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法，使用鲁哥氏溶液来分离细胞与细胞排出的纳米颗粒，所述鲁哥氏溶液中碘的总浓度不低于100g/l。
6.优选地，所述的鲁哥氏溶液由i2和ki溶于超纯水中配制而得，i2的浓度不低于40g/l，ki浓度不低于60g/l。
7.所述的细胞包括但不限于浮游植物(如绿藻、蓝藻等)，原生动物(如四膜虫、草履虫等)等细胞。
8.所述的纳米颗粒包括但不限于纳米金、纳米银、纳米氧化铁、纳米氧化钛、纳米氧化硅、纳米塑料、纳米氧化铜、纳米氧化锌等。
9.进一步地，所述分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法，具体包括如下步骤：
10.(1)配制含i2和ki的鲁哥氏溶液，避光保存；
11.(2)将步骤(1)鲁哥氏溶液加入到待分离的样品中，混合均匀；
12.(3)将步骤(2)均匀样品静置一段时间，使细胞沉淀，吸去上清溶液；
13.(4)用不含纳米颗粒的培养基重新悬浮步骤(3)中的沉淀细胞，离心，弃上清溶液；
14.(5)重复步骤(4)至少两次，分离出沉淀细胞。
15.优选地，步骤(2)中，所述鲁哥氏溶液与样品溶液的体积比为1:100～1:5，优选1:20。
16.优选地，步骤(3)中，所述静置的时间为5～30min，在保证细胞沉降效率的基础上尽可能缩短。
17.优选地，步骤(4)中，所述的不含纳米颗粒的培养基包括但不限于生理盐水或磷酸
缓冲液。
18.优选地，步骤(4)中，离心时控制转速和时间，不破坏细胞的完整性，转速控制在1000～4500rpm，离心时间为5～10min。
19.优选地，步骤(5)中，在保证洗涤效率的基础上尽可能减少悬浮洗涤的次数。
20.有益效果：
21.本发明利用常见廉价、易得的鲁哥氏溶液为固定剂，通过优化固定剂浓度、加入比例和沉降时间等参数，增强了其对细胞与纳米颗粒的分离效果，提高了其应用的普适性。本工艺操作简单，原料易得，成本低。
附图说明
22.下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
23.图1添加1:20体积比的鲁哥氏溶液后，不同时间细胞的完整性变化。
24.图2添加不同体积比的鲁哥氏溶液后，不同方法比较细胞与排出纳米颗粒的分离效果。
25.图3添加1:20体积比的鲁哥氏溶液静置自然沉降法收集四膜虫细胞，与直接离心收集细胞比较纳米颗粒排出动力学差异。
26.图4用添加1:20体积比的鲁哥氏溶液静置自然沉降法收集细胞测定暴露不同浓度纳米颗粒后四膜虫排出纳米颗粒随时间的变化。
具体实施方式
27.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
28.以下实施例中，鲁哥氏溶液由i2和ki溶于超纯水中配制而得，i2的浓度为40g/l，ki浓度为60g/l。
29.实施例1：添加1:20体积比的鲁哥氏溶液后，不同时间细胞的完整性变化。
30.按1:20的体积比添加鲁哥氏溶液至培养嗜热四膜虫的dryl’s培养基中，静置不同时间(0,5,15,30min)，计数细胞个数(图1)。可发现添加1:20体积鲁哥氏溶液的细胞个数在5～30min没有明显的变化，说明细胞保持完整。
31.实施例2：添加不同体积比的鲁哥氏溶液后，不同方法比较细胞与排出纳米颗粒的分离效果。
32.将暴露了2h纳米氧化铁的嗜热四膜虫转移到不含纳米颗粒的dryl’s培养基中，进行试验24h。用添加1:5和1:20体积鲁哥氏溶液后静置自然沉降、离心(3000rpm，5min)洗涤后收集的四膜虫细胞与直接离心(3000rpm，5min)收集的细胞比较，观察细胞与排出纳米颗粒的分离效果(图2，灰色和白色分别表示四膜虫和氧化铁的信号)。可发现通过添加1:20体积鲁哥氏溶液后自然沉降收集的细胞与排出纳米颗粒分离效果最佳。
33.实施例3：添加1:20体积比的鲁哥氏溶液静置自然沉降法收集四膜虫细胞，与直接离心收集细胞比较纳米颗粒排出动力学差异。
34.将嗜热四膜虫暴露于纳米氧化钛(1.32mg-ti/l)2h后转移到不含纳米颗粒的dryl’s培养基中，进行试验24h。用直接离心(3000rpm，5min)和添加1:20体积鲁哥氏溶液后
静置自然沉降、离心(3000rpm，5min)洗涤后收集的四膜虫细胞比较，测定纳米颗粒排出动力学(图3，黑色和红色分别表示用直接离心和鲁哥氏固定后自然沉降收集四膜虫，测定细胞内氧化钛含量)。可发现通过添加1:20体积鲁哥氏溶液后沉降收集细胞的方法能更好地检测四膜虫对纳米颗粒的排出。
35.实施例4：用添加1:20鲁哥氏溶液静置自然沉降法收集细胞测定暴露不同浓度纳米颗粒后四膜虫排出纳米颗粒随时间的变化。
36.将嗜热四膜虫暴露于不同浓度纳米氧化钛(0.4,1.32,4,13.2mg-ti/l)2h后转移到不含纳米颗粒的dryl’s培养基中，进行试验3h。添加1:20体积鲁哥氏溶液、静置自然沉降、离心(3000rpm，5min)洗涤后收集细胞测定纳米颗粒排出动力学(图4)。
37.本发明提供了一种分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。


技术特征：
1.一种分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法，其特征在于，使用鲁哥氏溶液来分离细胞与细胞排出的纳米颗粒，所述鲁哥氏溶液中碘的总浓度不低于100g/l。2.根据权利要求1所述的分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法，其特征在于，所述的鲁哥氏溶液由i2和ki溶于超纯水中配制而得，i2的浓度不低于40g/l，ki浓度不低于60g/l。3.根据权利要求1所述的分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)配制含i2和ki的鲁哥氏溶液，避光保存；(2)将步骤(1)鲁哥氏溶液加入到待分离的样品中，混合均匀；(3)将步骤(2)均匀样品静置一段时间，使细胞沉淀，吸去上清溶液；(4)用不含纳米颗粒的培养基重新悬浮步骤(3)中的沉淀细胞，离心，弃上清溶液；(5)重复步骤(4)至少两次，分离出沉淀细胞。4.根据权利要求3所述的分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述鲁哥氏溶液与样品溶液的体积比为1:100～1:5。5.根据权利要求3所述的分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述静置的时间为5～30min。6.根据权利要求3所述的分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的不含纳米颗粒的培养基为生理盐水或磷酸缓冲液。7.根据权利要求3所述的分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤(4)中，离心时控制转速和时间，不破坏细胞的完整性，转速控制在1000～4500rpm，离心时间为5～10min。

技术总结
本发明公开了一种分离细胞与细胞排出纳米颗粒的方法，其特征在于，使用鲁哥氏溶液来分离细胞与细胞排出的纳米颗粒，所述鲁哥氏溶液中碘的总浓度不低于100g/L。具体为配制含I2和KI的鲁哥氏溶液，避光保存；将鲁哥氏溶液加入到待分离的样品中，混合均匀；将均匀样品静置一段时间，使细胞沉淀，吸去上清溶液；用不含纳米颗粒的培养基重新悬浮沉淀细胞，离心，弃上清溶液；重复悬浮至少两次，分离出沉淀细胞。分离出沉淀细胞。分离出沉淀细胞。


技术研发人员：缪爱军 黄彬 张佳欣 郭文博 赵雅彤 王川 杨柳燕
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：2021.12.23
技术公布日：2022/4/8