用于活化抗原特异性T细胞反应的材料和方法

用于活化抗原特异性t细胞反应的材料和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年8月23日提交的美国临时申请第62/890,933号的优先权的权益，所述美国临时申请的公开内容通过引用整体并入。
3.政府支持声明
4.本发明是在美国国立卫生研究院(national institute of health；nih)授予的r01ca208246和r41ca206688-01a1的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
5.通过引用并入电子提交的材料
6.通过引用整体并入的是与本文同时提交并标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：文件名：2019-146_seqlisting.txt；大小：75,481字节；创建时间：2020年8月21日。


背景技术：

7.有效的t细胞共刺激对于抗原特异性t细胞反应的初级诱导和后续维持至关重要。除了增加的共抑制信号外，不足的共刺激肿瘤微环境也是肿瘤杀伤cd8 t细胞活化和维持不佳的重要原因。因此，癌症免疫治疗的主要目标之一是提供可持续的共刺激信号，以增强有效杀伤肿瘤的cd8 t细胞的产生和持久性，并且最终实现持久的肿瘤控制。然而，除了在工程化tcr中含有共刺激基序的工程化car-t细胞以外，由于肿瘤微环境中cd8 t细胞上共刺激受体的典型和活化诱导家族的不可持续表达，增强持续原位cd8 t细胞共刺激的手段仍远未达到预期。背景技术
[0008][0009]
有效的t细胞共刺激对于抗原特异性t细胞反应的初级诱导和后续维持至关重要
1-3
。不足的共刺激是肿瘤杀伤抗原特异性cd8 t细胞活化和维持不佳的主要原因
2,3
。因此，癌症免疫治疗的主要目标之一是提供可持续的共刺激信号，以增强有效杀伤肿瘤的cd8 t细胞的产生和持久性，并且最终实现持久的肿瘤控制。然而，除了在工程化tcr中含有共刺激基序的工程化car-t细胞以外，由于：1)肿瘤微环境中cd8 t细胞上共刺激受体的典型和活化诱导家族的不可持续表达；2)与细胞毒性t细胞相比潜在地由淋巴细胞的非所要共刺激产生的相当大的自身免疫细胞毒性，增强持续原位cd8 t细胞共刺激的手段仍远未达到预期4。
[0010]
自然杀伤组2d(nkg2d)是一种由所有人类nk细胞表达的活化受体，也被定义为人类nkt、cd8t和t细胞
5-10
。类似于经典的共刺激分子cd28和活化诱导的tnf-r共刺激分子超家族，nkg2d共刺激扩增了cd3/tcr信号传导的幅度。与这些经过充分研究的共刺激分子不同，nkg2d表达的表达与t细胞活化或功能状态无关，并且在正常条件下下也未在cd4 t细胞或b细胞上发现
5-11
。令人信服的证据显示，nkg2d共刺激不仅可以增强cd8 t细胞效应子功能，而且对于记忆cd8 t细胞发育和拯救也很重要
11-13
。这些认识已认可nkg2d作为一种工具性共刺激分子，可以产生有效和持久的肿瘤杀伤抗原特异性cd8 t细胞。


技术实现要素：

[0011]
一方面，本文描述了自然杀伤组2d(nkg2d)复合物，其包含可溶性mhc i链相关分子(smic)和非阻断smic中和抗体。在一些实施方案中，复合物中的非阻断抗体包含seq id no:4-9中所示的cdr。在一些实施方案中，复合物中的非阻断抗体包含seq id no:11中所示的轻链可变区。在一些实施方案中，复合物中的非阻断抗体包含seq id no:10中所示的重链可变区。在一些实施方案中，复合物中的非阻断抗体包含seq id no:12-17中所示的cdr。在一些实施方案中，复合物中的非阻断抗体包含seq id no:19中所示的轻链可变区。在一些实施方案中，复合物中的非阻断抗体包含seq id no:18中所示的重链可变区。
[0012]
在一些实施方案中，复合物中的可溶性mic是smica。在一些实施方案中，smica包含seq id no:1和20-77中的一个中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，复合物中的可溶性mic是smicb。在一些实施方案中，smicb包含seq id no:2和78-100中的一个中所示的氨基酸序列。
[0013]
还设想了包含本文所述的nkg2d复合物和药学上可接受的载剂、稀释剂或佐剂的组合物。
[0014]
在另一方面，本文描述了一种活化有需要的受试者中的cd8 t细胞的方法，其包括向受试者施用包含可溶性mhc i链相关分子(smic)和非阻断smic中和抗体的复合物。
[0015]
在一些实施方案中，受试者患有病毒感染。在一些实施方案中，病毒感染由以下引起：dna病毒(例如，疱疹病毒，例如单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)；痘病毒，例如痘疮(天花)病毒(variola(small pox)virus)；肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒)；乳头瘤病毒；腺病毒)；rna病毒(例如，hiv i、ii；htlv i、ii；脊髓灰质炎病毒(poliovirus)；甲型肝炎；冠状病毒，例如突发性急性呼吸综合征(sars)；正粘病毒(orthomyxovirus)(例如，流感病毒(influenza virus))；副粘病毒(paramyxovirus)(例如，麻疹病毒(measles virus))；狂犬病病毒(rabies virus)；丙型肝炎病毒)；黄病毒(flavivirus)、流感病毒；杯状病毒(calicivirus)；或狂犬病病毒、牛瘟病毒(rinderpest virus)和沙粒病毒(arena virus)。在一些实施方案中，病毒感染由淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(lcmv)引起。
[0016]
在一些实施方案中，受试者患有癌症。示例性癌症包括但不限于基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和cns癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌(gastric cancer)、胃肠癌、胶质母细胞瘤(gbm)、肝癌瘤、肝细胞瘤、上皮内赘生物、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、包括霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin's lymphoma)和非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma)的淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌症、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统癌症、外阴癌、b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、小淋巴细胞性(sl)nhl、中级/滤泡性nhl、中级弥漫性nhl、高级免疫母细胞性nhl、高级淋巴母细胞性nhl、高级小非裂解细胞nhl、巨大肿块nhl、套细胞淋巴瘤、aids相关淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(waldenstrom's macroglobulinemia)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性淋巴细胞性白血病(all)、毛细胞
白血病、慢性粒细胞性白血病和移植后淋巴组织增生性病症(ptld)。
[0017]
在一些实施方案中，受试者患有mhc i链相关分子(mic)阴性癌症。在一些实施方案中，受试者患有病毒感染。
[0018]
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括向受试者施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是mga27、伊匹单抗(ipilimumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、imp321、iph2101、替西木单抗(tremelimumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、mpdl3280a、medi4736、msb0010718c、aunp12、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)或tsr-022。
附图说明
[0019]
图1显示smic/抗mic d4h3 mab复合物提供强共刺激以扩增cd3介导的cd8 t细胞活化。
[0020]
图2显示smic/no4 mab复合物共刺激扩增了抗原特异性tcr信号传导。将人酪氨酸酶特异性hla-a2限制性til13831在功能测定前在指定条件下与apc t2-a2细胞共培养隔夜。
[0021]
图3显示与smic/d4h3 mab复合物的共刺激扩增了抗原特异性tcr信号传导。将人酪氨酸酶特异性hla-a2限制性til13831在功能测定前在指定条件下与apc t2-a2细胞共培养隔夜(o/n)。
[0022]
图4是显示用smic/d4h3治疗抑制mic结肠肿瘤生长的图。每周两次腹膜内(i.p.)施用4mg/kg bw的所有试剂(对照igg、抗体d4h3和smic/d4h3复合物)。*，p《0.01。
[0023]
图5a和5b提供显示smic(a/b)/d4h3复合物或smic(a/b)/no4复合物与nkg2d结合的检测的图。将重组可溶性nkg2d-his标签(2μg/ml)在4℃下固定于96孔板上隔夜。将50l所示浓度的重组smica或smicb与不同量的d4h3(图5a)或no4(图5b)混合。x轴指示d4h3或no4的浓度。在孵育和洗涤后，通过hrp偶联的山羊抗小鼠igg检测到smic/d4h3或smic/no4复合物与nkg2d的结合。
[0024]
图6描绘了seq id no:20-77中所示的mica等位基因。
[0025]
图7描绘了seq id no:78-100中所示的micb等位基因。
[0026]
图8是显示向接种有淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)的小鼠施用smic/d4h3复合物明显降低小鼠的lcmv滴度的图。
具体实施方式
[0027]
本文描述一种自然杀伤组2d(nkg2d)复合物，可溶性mhc i链相关分子(smic)和非阻断smic中和抗体。本文还描述了一种融合蛋白，其包含通过多聚接头连接至非阻断smic中和抗体的重链(或轻链)的smic。如本文提供的实施例中所示：1)与可溶性nkg2d配体相比，smic/抗smic复合物提供持久的nkg2d共刺激幅度以扩增tcr/cd3信号传导；2)smic/抗smic复合物和cd28激动剂产生相加的共刺激作用；3)与下调nkg2d表达的可溶性nkg2d配体的负面作用相反，smic/抗smic共刺激稳定了cd8 t细胞上的nkg2d表达。
[0028]
主要组织相容性复合物i类链相关(mic)多肽
[0029]
本文所述的nkg2d超激动剂复合物(或融合蛋白)包含主要组织相容性复合物i类
链相关(mic)多肽。mic是表面跨膜蛋白。细胞表面上存在mic多肽可以向免疫受体nkg2d发出肿瘤免疫破坏的信号，通常是通过自然杀伤细胞(nk细胞)和细胞毒性t细胞(ctl)。然而，在许多肿瘤中，mic从肿瘤表面脱落，从而导致宿主对肿瘤细胞的免疫力降低并促进肿瘤逃避和进展。mic多肽包括但不限于人mica(例如，ncbi ref seqs np_000238(seq id no:1)和001170990)和人micb(例如，ncbi ref seq:np_005922(seq id no:2))。在一些实施方案中，mic多肽包含mica。在一些实施方案中，mic多肽可以包含micb。在一些实施方案中，mic多肽包含以下氨基酸序列：
[0030]
ephslrynltvlswdgsvqsgflaevhldgqpflrydrqkcrakpqgqwaedvlgnktwdretrdltgngkdlrmtlahikdqkeglhslqeirvceihednstrssqhfyydgelflsqnveteewtvpqssraqtlamnvrnflkedamktkthyhamhadclqelrrylessvvlrrrvppmvnvtrsealegnitvtcgassfyprnitltwrqdgvslshdtqqwgdvlpdgngtyqtwvatricqgeeqrftcymehsgnhsthpvps(seq id no:3)。
[0031]
在一些实施方案中，nkg2d复合物(或融合蛋白)包含可溶性mic(smic)多肽。如本文所用，“可溶性mic”或“smic”是指缺少跨膜结构域的mic多肽的一部分，例如已从跨膜结构域裂解的mic的胞外部分。在一些实施方案中，可溶性mic可以包含约例如seq id no:1或2的氨基酸24-260。在一些实施方案中，可溶性mic可以包含约例如seq id no:1或2的残基24-260的20个或更多个氨基酸，例如seq id no:1或2的残基24-260的20个、50个、100个、150个或更多个氨基酸。
[0032]
在一些实施方案中，nk2gd激动剂复合物(或融合蛋白)包含seq id no:20-77中的一个中所示的mica等位基因。在一些实施方案中，nk2gd激动剂复合物(或融合蛋白)包含seq id no:78-100中的一个中所示的micb等位基因。
[0033]
抗mic抗体
[0034]
在一些实施方案中，本文所述的nkg2d激动剂复合物(或融合蛋白)包含选择性结合于mic多肽的非阻断抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，mic多肽是可溶性mic多肽(smic)。
[0035]
如本文所用的术语“非阻断抗体”是指不阻断nkg2d与膜结合mic或可溶性mic相互作用的smic中和抗体，并且因此不干扰nkg2d介导的nk细胞溶细胞活性对mic 细胞的敏感性。
[0036]
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子。术语还指由两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链组成的抗体以及各种形式，包括全长抗体和其抗原结合部分；包括例如免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、cdr移植抗体、人源化抗体、单结构域抗体(dab)、双体抗体(diabody)、多特异性抗体、双特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体、其功能活性表位结合片段、双功能杂交抗体(例如，lanzavecchia等人,《欧洲免疫学杂志(eur.j.immunol)》17,105(1987))和单链(例如，huston等人,《美国科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》,85,5879-5883(1988)和bird等人,《科学(science)》242,423-426(1988)，其通过应用并入本文)。(一般参见hood等人,《免疫学(immunology)》,benjamin,n.y.,第2版(1984)，harlow和lane,《抗体(antibodies)》《实验室手册(alaboratory manual)》,冷泉港实验室(cold spring harbor laboratory)(1988)和hunkapiller和hood,《自然(nature)》,323,15-16(1986)，其通过应用并入本文)。
[0037]
每条重链由所述重链的可变区(在此缩写为hcvr或vh)和所述重链的恒定区组成。
重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3组成。每条轻链由所述轻链的可变区(在此缩写为lcvr或vl)和所述轻链的恒定区组成。轻链恒定区由cl结构域组成。vh和vl区可进一步分为称为互补决定区(cdr)的高变区和散布有称为框架区(fr)的保守区。每个vh和vl区因此由三个cdr和四个fr组成，其从n端到c端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。这种结构是本领域技术人员所熟知的。
[0038]
如本文所用，术语“cdr”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个cdr，对于每个可变区分别指定为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的准确边界已经根据不同的系统被不同地定义。kabat所描述的系统(kabat等人,《免疫学意义的蛋白质序列(sequences of proteins of immunological interest)》(国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达(bethesda,md.),(1987)和(1991))不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且提供了定义三个cdr的精确残基边界。这些cdr可以被称为kabat cdr。定义与kabat cdr重叠的cdr的其它边界由padlan(《美国实验生物学会联合会杂志(faseb j.)》9:133-139(1995))和maccallum(《分子生物学杂志(j mol biol)》262(5):732-45(1996))和chothia(《分子生物学杂志》196:901-917(1987)和《自然》342:877-883(1989))描述。仍其它cdr边界定义可能不会严格地遵循上述系统之一，但尽管如此将与kabat cdr重叠，但是鉴于特定残基或残基组或甚至整个cdr不会显著影响抗原结合的预测或实验发现，所述边界可能会被缩短或加长。本文所使用的方法可以利用根据这些系统中的任一个定义的cdr，但是优选的实施方案使用kabat定义的cdr。
[0039]
如本文所用，“选择性结合”或“特异性结合”是指本文描述的抗mic结合肽(例如，抗体或其部分)结合于靶标的能力，例如存在于细胞表面的mic分子，其kd为10-5
m(10000nm)或更小，例如10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m、10-10
m、10
11
m、10-12
m或更小(或包含这些值中的任一个作为端点的任何范围)。特异性结合可受例如多肽试剂的亲和力和亲合力以及多肽试剂的浓度影响。本领域普通技术人员可以使用任何合适的方法，例如在合适的细胞结合测定中滴定多肽试剂来确定本文所述的多肽试剂选择性结合靶标的适当条件。特异性结合于靶标的多肽不会被非相似的竞争者取代。在某些实施方案中，当抗体或其抗原结合部分优先识别蛋白质和/或大分子的复合物混合物中的靶抗原时，所述抗体或其抗原结合部分被称为特异性结合抗原。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分以10-5
m(10000nm)或更小，例如10-5
m、10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m、10-10
m、10
11
m、10-12
m的解离常数(kd)结合于smic多肽。
[0040]
术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”在本文中可互换使用，是指如本文所述的抗体的一个或多个片段，其仍显示出如上文所定义的结合亲和力。已显示完整抗体的片段能够执行抗体的抗原结合功能。抗原结合片段的实例包括但不限于(i)fab片段，即由vl、vh、cl和ch1结构域构成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，即包含两个在铰链区中通过二硫键相互连接的fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域构成的fd片段；(iv)由抗体单臂的fl和vh结构域构成的fv片段；(v)dab片段(ward等人,(1989)《自然》341:544-546)，其由vh结构域或vh、ch1、ch2、dh3或vh、ch2、ch3组成(dab或单结构域抗体(仅包含vl结构域)也已显示特异性结合靶表位)。尽管fv片段的两个结构域(即vl和vh)由单独的基因编码，但其可以使用合成接头(例如，聚g4s氨基酸序列)和重组方法进一步相互连接，从而使得有可能将其制备为单一蛋白质链，其中vl和vh区组合以形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如，bird等人(1988)《科学》242:423-426；和huston等人(1988)《美国科学院
院刊》85:5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在包含此类单链抗体。其它形式的单链抗体(如“双体抗体”)也包括在此处。双抗体是二价双特异性抗体，其中vh和vl结构域在单一多肽链上表达，但是使用对于两个结构域能够在同一链上组合而言太短的接头，从而迫使所述结构域与不同链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点(参见例如，holliger,r等人(1993)《美国科学院院刊》90:64446448；poljak,r.j等人(1994)《结构(structure)》2:1121-1123)。免疫球蛋白恒定结构域是指重链或轻链恒定结构域。人igg重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域中已知的。
[0041]
此外，如本文所述的抗体或其抗原结合部分可以是通过所述抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成的较大免疫粘附分子的部分。与此类免疫粘附分子相关的是使用链霉亲和素核心区以制备四聚体scfv分子(kipriyanov,s.m.等人(1995)《人抗体和杂交瘤(human antibodies and hybridomas)》6:93-101)和使用半胱氨酸残基、标记肽和c端聚组氨基，例如六组胺基标签(
‘
六组胺基标签’公开为seq id no:18)以产生二价和生物素化scfv分子(kipriyanov,s.m.等人(1994)《分子免疫学(mol.immunol.)》31:10471058)。
[0042]
在一些实施方案中，抗体是igg、单克隆抗体、嵌合抗体、cdr移植抗体、人源化抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗独特型抗体或双特异性抗体。在一些实施方案中，抗体的抗原结合部分是fab、fab'、f(ab')2、fv、二硫键连接的fv、scfv、单结构域抗体、双体抗体或其功能活性表位结合片段。
[0043]
术语“人抗体”是指其可变区和恒定区对应于或源自人种系的免疫球蛋白序列的抗体，如例如kabat等人所述。(参见kabat等人(1991)《免疫学相关蛋白序列(sequences of proteins of immunological interest)》,第五版,美国卫生与公众服务部(u.s.department of health and human services),nih出版编号91-3242)。然而，人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在cdr中，并且特别是在cdr3中。如本文所述的重组人抗体具有可变区并且还可以包含源自人种系的免疫球蛋白序列的恒定区(参见kabat,ea等人(1991)《免疫学相关蛋白序列》,第五版,美国卫生与公众服务部,nih出版编号91-3242)。然而，根据特定实施方案，此类重组人抗体经受体外诱变(或经受体细胞体内诱变，如果使用由于人ig序列而转基因的动物)，使得重组抗体的vh和vl区的氨基酸序列是这样的序列，所述序列虽然与人种系的vh和vl序列相关或来源于所述序列，但在体内不天然存在于人抗体种系库内。根据特定实施方案，这种重组抗体是选择性诱变或回复突变或两者的结果。优选地，诱变导致对靶标的亲和力大于亲本抗体的亲和力，和/或对非靶标结构的亲和力小于亲本抗体的亲和力。
[0044]
术语“嵌合抗体”是指含有来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。人源化抗体具有基本上来自人抗体(称为受体抗体)的可变区框架残基和基本上来自非人抗体(例如小鼠抗体)(称为供体免疫球蛋白)的互补决定区。参见，queen等人,《美国科学院院刊》86:10029-10033(1989)和wo 90/07861、美国专利第5,693,762号、第5,693,761号、第5,585,089号、第5,530,101号和winter,美国专利第5,225,539号，其通过引用整体并入本文。如果存在，恒定区也基本上或完全来自人免疫球蛋白。人可变结构域通常选自人抗体，其框
架序列展现与cdr来源的(鼠)可变区结构域高度的序列同一性。重链和轻链可变区框架残基可以与相同或不同的人抗体序列的区域基本相似。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列或可以是几种人抗体的共有序列。参见carter等人，wo 92/22653，其通过引用整体并入本文。
[0045]
在一些实施方案中，本文所述的抗体不是天然存在的生物分子。例如，在没有人为干预和操作(例如，由人进行的制造步骤)的情况下，针对人源抗原产生的鼠抗体不会在自然界中出现。嵌合抗体也不是天然存在的生物分子，例如，因为其包含从多个物种获得并组装成重组分子的序列。在某些特定实施方案中，本文所述的人抗体试剂不是天然存在的生物分子，例如，针对人抗原的完全人抗体将在自然界中经受负选择并且不是天然存在于人体中。
[0046]
本领域普通技术人员将认识到，改变编码序列中单个氨基酸或一小部分氨基酸的氨基酸序列的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸并保留特异性结合mic多肽的靶抗原(例如，存在于smic上的表位)的能力。这种保守修饰的变体是对与本公开一致的多态变体、种间同源物和等位基因的补充并且不排除这些变体。
[0047]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分特异性结合smic多肽并包含一个或多个重链和轻链互补决定区(cdr)，其选自由以下组成的组：(a)具有seq id no:4的氨基酸序列的轻链cdr1；(b)具有seq id no:5的氨基酸序列的轻链cdr2；(c)具有seq id no:6的氨基酸序列的轻链cdr3；(d)具有seq id no:7的氨基酸序列的重链cdr1；(e)具有seq id no:8的氨基酸序列的重链cdr2；(f)具有seq id no:9的氨基酸序列的重链cdr3。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含一个或多个cdr，例如1个cdr、2个cdr、3个cdr、4个cdr、5个cdr或6个cdr，其选自由以下组成的组：(a)具有seq id no:4的氨基酸序列的轻链cdr1；(b)具有seq id no:5的氨基酸序列的轻链cdr2；(c)具有seq id no:6的氨基酸序列的轻链cdr3；(d)具有seq id no:7的氨基酸序列的重链cdr1；(e)具有seq id no:8的氨基酸序列的重链cdr2；(f)具有seq id no:9的氨基酸序列的重链cdr3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链或其部分，其包含一个或多个cdr，例如1个cdr、2个cdr或3个cdr，其选自由以下组成的组：具有seq id no:7的氨基酸序列的重链cdr1；具有seq id no:8的氨基酸序列的重链cdr2；和具有seq id no:9的氨基酸序列的重链cdr3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链或其一部分，其包含一个或多个cdr，例如1个cdr、2个cdr或3个cdr，其选自由以下组成的组：具有seq id no:4的氨基酸序列的轻链cdr1；具有seq id no:5的氨基酸序列的轻链cdr2；具有seq id no:6的氨基酸序列的轻链cdr3。
[0048]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含轻链互补决定区(cdr)：(a)具有seq id no:12的氨基酸序列的轻链cdr1；(b)具有seq id no:13的氨基酸序列的轻链cdr2；(c)具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链cdr3。在一些实施方案中，抗体或抗原结合部分包含重链互补决定区(cdr)：(d)具有氨基酸序列seq id no:15的重链cdr1；(e)具有seq id no:16的氨基酸序列的重链cdr2；(f)具有seq id no:17的氨基酸序列的重链cdr3。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含一个或多个cdr，例如1个cdr、2个cdr、3个cdr、4个cdr、5个cdr或6个cdr，其选自由以下组成的组：(a)具有seq id no:12的氨基酸
序列的轻链cdr1；(b)具有seq id no:13的氨基酸序列的轻链cdr2；(c)具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链cdr3；(d)具有seq id no:15的氨基酸序列的重链cdr1；(e)具有seq id no:16的氨基酸序列的重链cdr2；(f)具有seq id no:17的氨基酸序列的重链cdr3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链或其部分，其包含一个或多个cdr，例如1个cdr、2个cdr或3个cdr，其选自由以下组成的组：具有seq id no:15的氨基酸序列的重链cdr1；具有seq id no:16的氨基酸序列的重链cdr2；和具有seq id no:17的氨基酸序列的重链cdr3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链或其一部分，其包含一个或多个cdr，例如1个cdr、2个cdr或3个cdr，其选自由以下组成的组：具有seq id no:13的氨基酸序列的轻链cdr1；具有seq id no:12的氨基酸序列的轻链cdr2；具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链cdr3。
[0049]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:11的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:10的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:11的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:10的氨基酸序列的轻链。
[0050]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:19的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:19的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:18的氨基酸序列的轻链。
[0051]
在其中如本文所述的抗体包含与seq id no:4-9或12-17的序列不同的至少一个cdr的实施方案中，所述至少一个cdr的氨基酸序列至少一个cdr氨基酸序列可以通过本领域技术人员熟知的方法选择。例如，fujii,2004,“通过随机诱变的抗体亲和力成熟(antibody affinity maturation by random mutagenesis)”,《分子生物学方法：抗体工程化(methods in molecular biology:antibody engineering)》248:345-349(其通过引用整体并入本文)，特别是在图2和章节3.3处描述了为任何所关注cdr生成文库的方法。这允许本领域普通技术人员鉴定替代的cdr，包括本文所述的特定cdr序列的保守取代变体，当其存在于本文所述的抗体或其抗原结合片段中时，将产生将结合mic多肽的抗原或其抗原结合片段，但不会阻断mic多肽与其它抗体的结合。fujii等人中描述的方法还允许本领域普通技术人员筛选轻链序列，当与已知的重链片段组合时，所述序列将产生所需的结合行为，反之亦然。
[0052]
在一些实施方案中，本文所述的抗体和/或其抗原结合部分可以是本文所述序列的变体，例如抗体多肽的保守取代变体。在一些实施方案中，变体是保守修饰的变体。例如，保守取代变体可以通过天然核苷酸序列的突变获得。如本文所指，“变体”是与天然或参考多肽基本同源的多肽，但由于一个或多个缺失、插入或取代而具有与天然或参考多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。编码变体多肽的dna序列涵盖与天然或参考dna序列相比包含一个或多个核苷酸添加、缺失或取代的序列，编码保留活性，例如相关靶多肽(例如，smic多肽)的抗原特异性结合活性的的变体蛋白质或其片段。多种基于pcr的位点特异性诱变方法也是本领域已知的并且可以由普通技术人员应用。
[0053]
取代变体的实例包括不改变cdr的序列的氨基酸的保守取代，例如在vh或v
l
结构域中。cdr不包含的序列中的保守取代可以是相对于野生型或天然存在的序列，例如人或鼠框架和/或抗体序列的恒定区的取代。
[0054]
在一些实施方案中，抗体的保守修饰变体可以包含除cdr以外的改变，例如抗体试剂的保守修饰变体可以包含具有seq id no:4-9和12-17中的一个或多个的序列的cdr。
[0055]
给定氨基酸可以由具有相似生理化学特性的残基替换，例如，用一个脂肪族残基取代另一个(例如，ile、val、leu或ala)，或用一个极性残基取代另一个(例如，在lys与arg之间；在glu与asp之间；或在gln与asn之间)。其它此类保守取代(例如具有相似疏水特性的整个区域的取代)是熟知的。可以在本文所述的任何一种测定中测试包含保守氨基酸取代的多肽以确认保留了所需活性，例如天然或参考多肽的抗原结合活性和特异性。
[0056]
氨基酸可以根据其侧链特性的相似性进行分组(a.l.lehninger,《生物化学(biochemistry)》,第二版,第73-75页,纽约沃特出版社(worth publishers,new york),(1975))：(1)非极性：ala(a)、val(v)、leu(l)、ile(i)、pro(p)、phe(f)、trp(w)、met(m)；(2)不带电的极性：gly(g)、ser(s)、thr(t)、cys(c)、tyr(y)、asn(n)、gln(q)；(3)酸性：asp(d)、glu(e)；(4)碱性：lys(k)、arg(r)、his(h)。
[0057]
或者，天然存在的残基可基于常见的侧链特性分进行分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；(6)芳香族：trp、tyr、phe。非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一个类。
[0058]
特定的保守取代包括例如：ala变为gly或ser；arg变为lys；asn变为gln或his；asp变为glu；cys变为ser；gln变为asn；glu变为asp；gly变为ala或pro；his变为asn或gln；ile变为leu或val；leu变为ile或val；lys变为arg、gln或glu；met变为leu、tyr或ile；phe变为met、leu或tyr；ser变为thr；thr变为ser；trp变为tyr；tyr变为trp；和/或phe变为val、ile或leu。
[0059]
在一些实施方案中，crh肽包含与seq id no:4-9和12-17中所示的cdr序列中的任一个或seq id no:10、11、18和19中所示的可变区氨基酸序列中的任一个至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多相同的氨基酸序列。天然和突变序列之间的同源性程度(同一性百分比)可以例如通过使用使用万维网上为此目的通常使用的免费获取计算机程序(例如，具有默认设置的blastp或blastn)比较两个序列来确定。
[0060]
天然氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任一种来实现。例如，可以在特定基因座处通过合成含有突变序列的寡核苷酸引入突变，所述突变序列两侧是能够与天然序列的片段连接的限制性位点。连接后，所得重建序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的类似物。或者，可以采用寡核苷酸定向的位点特异性诱变程序来提供具有根据所需的取代、缺失或插入而改变的特定密码子的改变的核苷酸序列。进行这种改变的技术已经非常成熟，并且包括例如walder等人(《基因(gene)》42:133,1986)；bauer等人(《基因》37:73,1985)；craik(《生物技术(biotechniques)》,1985年1月,12-19)；smith等人(《基因工程化：原理和方法(genetic engineering:principles and methods)》,普莱纽姆出版社(plenum press),1981)；和美国专利第4,518,584号和第4,
737,462号公开的那些技术，其通过引用整体并入本文。
[0061]
未参与维持多肽的正确构象的任何半胱氨酸残基也可以被取代，通常经丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止发生异常交联。相反，可以将一个或多个半胱氨酸键添加至多肽中以改善其稳定性或促进寡聚化。
[0062]
制备抗体的方法
[0063]
传统上，单克隆抗体已作为鼠杂交瘤系中的天然分子产生。除所述技术以外，本文所述的方法和组合物提供了单克隆抗体的重组dna表达。这允许在选择的宿主物种中产生人源化抗体以及一系列抗体衍生物和复合物。在细菌、酵母、转基因动物和鸡蛋中产生抗体也是基于杂交瘤的生产系统的替代方案。转基因动物的主要优势是来自可再生资源的潜在高产量。
[0064]
通过本领域已知的多种方法来制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于通过寡核苷酸介导(或定点)诱变、pcr诱变和抗体的较早制备的变体或非变体版本的盒式诱变进行制备。可以根据常规技术，包括钝端或交错端连接末端、限制性酶消化以提供适当末端、适当填充粘性末端、碱性磷酸酶处理以避免不希望的接合以及适当连接酶连接，可以将编码至少一种如本文所述的抗体、部分或多肽的核酸序列与载体dna重组。用于这类操作的技术公开在例如maniatis等人,《分子克隆实验室手册(molecular cloning,lab.manual)》(纽约冷泉港实验室出版社(cold spring harbor lab.press,n y),1982和1989)和ausubel,1987,1993中，并且可以用于构建编码抗体分子或其抗原结合区的核酸序列。
[0065]
在一些实施方案中，将引入的核苷酸序列并入能够在受体宿主中自主复制的质粒或病毒载体中。多种载体中的任一种均可用于此目的，并且是本领域技术人员或普通技术人员已知的和可获得的。参见，例如ausubel等人,1987,1993。选择特定质粒或病毒载体的重要因素包括：含有载体的受体细胞可以被识别并从那些不含载体的受体细胞中选出的容易程度；特定宿主中所需的载体拷贝数；以及是否需要能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”载体。
[0066]
本领域已知的示例性原核载体包括质粒，例如能够在大肠杆菌中复制的那些质粒。用于表达编码抗体或其抗原结合部分的cdna的其它基因表达元件包括但不限于(a)病毒转录启动子和其增强子元件，例如sv40早期启动子(okayama等人,3《分子和细胞生物学(mol.cell.biol.)》280(1983))、劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus)ltr(gorman等人,79pnas 6777(1982))和莫洛尼鼠白血病病毒ltr(grosschedl等人,41《细胞(cell)》885(1985))；(b)剪接区和聚腺苷酸化位点，例如源自sv40晚期区域的那些(okayarea等人,1983)，以及(c)聚腺苷酸化位点，例如在sv40(okayama等人,1983)免疫球蛋白cdna基因中可以表达，如liu等人,见下文和weidle等人,51《基因》21(1987)所述，使用sv40早期启动子和其增强子、小鼠免疫球蛋白h链启动子增强子、sv40晚期区域mrna剪接、兔s-珠蛋白插入序列、免疫球蛋白和兔s-珠蛋白聚腺苷酸化位点以及sv40聚腺苷酸化元件作为表达元件。
[0067]
每个融合基因都组装或插入表达载体中。然后将能够表达嵌合免疫球蛋白链基因产物的受体细胞用抗体、其抗原结合部分或嵌合h或嵌合l链编码基因单独转染，或用嵌合h和嵌合l链基因共转染。在允许并入基因表达的条件下培养转染的受体细胞，并且从培养物中回收表达的免疫球蛋白链或完整抗体或片段。
[0068]
携带如本文所述的抗体或其抗原结合部分的表达载体可以通过多种合适方式中的任一种引入合适的宿主细胞，包括例如转化、转染、偶联、原生质体融合、磷酸钙沉淀以及与例如二乙氨基乙基(deae)葡聚糖的聚阳离子一起应用的生物化学方式，以及例如电穿孔、直接显微注射和微粒轰击的机械方式。johnston等人，240《科学》1538(1988)，如本领域普通技术人员所知。
[0069]
宿主哺乳动物细胞可以在体外或体内生长。哺乳动物细胞为免疫球蛋白分子提供转译后修饰，包括前导肽去除、h链和l链的折叠和组装、抗体分子的糖基化以及功能性抗体蛋白的分泌。
[0070]
可以用作产生抗体蛋白的宿主的哺乳动物细胞，除了上文描述的淋巴样来源的细胞外，还包括成纤维细胞来源的细胞，例如vero(atcc crl 81)或cho-k1(atcc crl 61)细胞。可以用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于cos细胞，包括cos 7细胞；293细胞，包括293-6e细胞；cho细胞，包括cho-s和dg44细胞；per.c6
tm
细胞(crucell)；和nso细胞。在一些实施方案中，基于其对重链和/或轻链进行所需转译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，cho细胞产生的多肽的唾液酸化水平高于293细胞中产生的相同多肽。
[0071]
在一些实施方案中，如本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合部分可以根据任何合适的方法在已经用一种或多种编码多肽的核酸分子工程化或转染的动物体内产生。
[0072]
在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合部分在无细胞系统中产生。非限制性示例性无细胞系统描述于例如sitaraman等人,《分子生物学方法(methods mol.biol.)》498:229-44(2009)；spirin,《生物技术趋势(trends biotechnol.)》22:538-45(2004)；endo等人,《生物技术进展(biotechnol.adv.)》21:695-713(2003)中，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0073]
在一些方面，本文提供了用于产生人源化抗体的方法和系统，所述人源化抗体通过包括以下的过程制备：将用编码人源化抗体轻链的第一表达载体和编码人源化抗体重链的第二表达载体转化的宿主维持在使得每条链都被表达的条件下，以及分离通过组装如此表达的链而形成的人源化抗体。第一和第二表达载体可以是相同的载体。本文还提供了编码人源化抗体的轻链或重链的dna序列；并入所述dna序列的表达载体；和用所述表达载体转化的宿主。
[0074]
本领域普通技术人员无需过度实验即可根据本文提供的序列和信息产生人源化抗体。在一种方法中，使用四个通用步骤来人源化单克隆抗体，参见例如美国专利第5,585,089号；第6,835,823号；第6,824,989号。所述步骤为：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即在人源化过程中决定使用哪个抗体框架区；(3)实际的人性化方法/技术；(4)人源化抗体的转染和表达。
[0075]
通常，人源化抗体和人抗体变体中的cdr区基本上相同，更常见的是，与其所源自的小鼠或人抗体中的相应cdr区相同。尽管通常不合需要，但有时可以对cdr残基进行一处或多处保守氨基酸取代，而不会明显地影响所得人源化免疫球蛋白或人抗体变体的结合亲和力。有时，cdr区的取代可以增强结合亲和力。
[0076]
此外，可以使用通过剪接来自小鼠或其它物种的基因、具有适当抗原特异性的抗体分子以及来自具有适当生物活性的人抗体分子的基因针对产生“嵌合抗体”而研发的技
术(参见morrison等人,《美国科学院院刊》81:851-855(1984)；neuberger等人,《自然》312:604-608(1984)；takeda等人,《自然》314:452-454(1985)；其通过引用整体并入本文)。嵌合抗体是其中不同部分源自不同动物物种的分子，例如具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些分子，例如人源化抗体。
[0077]
嵌合抗体的可变区段通常连接至免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。人恒定区dna序列可以根据熟知的方法从多种人细胞，例如永生化b细胞(wo 87/02671；其通过引用整体并入本文)中分离。抗体可以含有轻链和重链恒定区。重链恒定区可以包括ch1区、铰链区、ch2区、ch3区，并且有时还包括ch4区。出于治疗目的，可以删除或省略ch2结构域。
[0078]
或者，针对产生单链抗体而描述的技术(参见例如美国专利第4,946,778号；bird,《科学》242:423-42(1988)；huston等人,《美国科学院院刊》85:5879-5883(1988)；和ward等人,《自然》334:544-54(1989)；其通过引用整体并入本文)可用于产生单链抗体。单链抗体通过氨基酸桥连接fv区的重链和轻链片段形成，从而产生单链多肽。也可以使用在大肠杆菌(e.coli)中组装功能性fv片段的技术(参见例如skerra等人,《科学》242:1038-1041(1988)；其通过引用整体并入本文)。
[0079]
治疗方法
[0080]
一方面，本文描述一种活化有需要的受试者中的cd8 t细胞的方法，其包括向所述受试者施用复合物(或融合蛋白)，所述复合物(或融合蛋白)包含可溶性mhc i链相关分子(smic)和非阻断smic中和抗体。
[0081]
在一些实施方案中，受试者患有病毒感染。已显示许多病毒的cd8 t细胞在保护中发挥作用。参见huber等人,front《免疫学(immunol.)》5:171,2014。在一些实施方案中，受试者患有由以下引起的病毒感染：dna病毒(例如，疱疹病毒，例如单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒；痘病毒，例如痘疮(天花)病毒；肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒)；乳头瘤病毒；腺病毒)；rna病毒(例如，hiv i、ii；htlv i、ii；脊髓灰质炎病毒；甲型肝炎；冠状病毒，例如突发性急性呼吸综合征(sars)；正粘病毒(例如，流感病毒)；副粘病毒(例如，麻疹病毒)；狂犬病病毒；丙型肝炎病毒)；黄病毒、流感病毒；杯状病毒；狂犬病病毒、牛瘟病毒、沙粒病毒等。在一些实施方案中，病毒感染由淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(lcmv)引起。在一些实施方案中，受试者患有病毒相关疾病。示例性的病毒相关疾病包括但不限于获得性免疫缺陷；肝炎；肠胃炎；出血性疾病；肠炎；心脏炎；脑炎；麻痹；细支气管炎；上呼吸道和下呼吸道疾病；呼吸道乳头瘤病；关节炎；播散性疾病；脑膜炎；和单核细胞增多症。
[0082]
在一些实施方案中，受试者患有癌症或恶性肿瘤。在一些实施方案中，cd8 t细胞的活化通过酶联免疫斑点(elispot)、流式细胞术活化分选(facs)或靶杀伤细胞毒性测定来确定。确定t细胞活化的其它方法，例如plebanski等人,《疫苗专家评论(expert.rev.vaccines)》,9:595-600,2010中描述的那些方法。
[0083]
如本文所用，“肿瘤”是指干扰身体器官和系统的正常功能的细胞的不受控制的生长。患有癌症或肿瘤的受试者是在受试者体内存在可客观测量的癌细胞的受试者。这种定义包括良性肿瘤和恶性癌症，以及潜在的休眠肿瘤或微转移。从其原始位置迁移并播种其它重要器官的癌症最终会通过受影响器官的功能退化导致受试者死亡。造血系统癌症(例如白血病)能够胜过受试者的正常造血区室，从而导致造血功能衰竭(呈贫血、血小板减少
症和中性粒细胞减少症的形式)，最终导致死亡。
[0084]
示例性癌症包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更特定实例包括但不限于基底细胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和cns癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤(gbm)；肝癌瘤；肝细胞瘤；上皮内赘生物；肾癌(kidney/renal cancer)；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤的淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；以及其它癌瘤和肉瘤；套细胞淋巴瘤；aids相关淋巴瘤；和华氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性淋巴细胞性白血病(all)；毛细胞白血病；慢性粒细胞性白血病；和移植后淋巴组织增生性病症(ptld)。
[0085]
在一些实施方案中，肿瘤或恶性肿瘤是mic阴性的。如本文所用，术语“mic阴性肿瘤”用于描述不产生mic蛋白的肿瘤细胞、肿瘤细胞簇或肿瘤块。所述术语旨在涵盖所有肿瘤细胞和/或肿瘤块，其在肿瘤细胞表面不显示mic蛋白，因此这些细胞不脱落mic蛋白。换句话说，患有mic阴性癌症的受试者除了背景噪声以外应该没有可检测的smic。mic阴性肿瘤可以通过使用标准mica或micb检测elisa测定血清水平mic(例如，smica或smicb)来鉴定，如例如ghadially等人,《英国癌症杂志(br.j.cancer)》,116:1208-1217,2017中所述，其公开内容通过引用并入本文。对于活检可用的肿瘤，也可以选择或确认mic表达为阴性的肿瘤，免疫组化显示与抗mic抗体无交叉反应。
[0086]
如本文所用，“受试者”是指人或动物。在一些实施方案中，动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猿和猕猴，例如恒河猴(rhesus)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家养和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛；猫科物种，例如家猫；以及犬科物种，例如狗、狐狸、狼；鸟类物种，例如鸡、鸸鹋、鸵鸟；以及鱼类，例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。患者或受试者包括前述的任何子集，例如，上述所有者，但不包括一个或多个组或物种，例如人、灵长类动物或啮齿动物。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”、“个体”和“受试者”在本文中可互换使用。
[0087]
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。例如，可以有利地使用除人以外的哺乳动物作为代表例如各种癌症的动物模型的受试者。另外，本文描述和方法可以用于治疗驯养动物和/或宠物。受试者可以是雌性或雄性。
[0088]
在一些实施方案中，受试者先前已被诊断患有或鉴定为患上或患有需要治疗的病况(例如，癌症)或与此类病况相关的一种或多种并发症，并且任选地，但不必已经经历针对病况或与所述病况相关的一种或多种并发症的治疗。或者，受试者先前未被诊断为患有需要治疗的病况或一种或多种与此类病况相关的并发症。例如，受试者可以是展现病况或与病况相关的一种或多种并发症的一种或多种风险因素的受试者或不展现风险因素的受试者。“需要”针对特定病况进行治疗的“受试者”可以是患有所述病况、被诊断为患有所述病
况或处于发展所述病况的风险下的受试者。
[0089]
如本文所用，当关于疾病、病症或医学病况使用时，术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“改善”是指病况的治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止症状或病况的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病况的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标记物减少，那么治疗通常是“有效的”。或者，如果病况的进展减少或停止，那么治疗是“有效的”。即，“治疗”不仅包括症状或标记物的改善，而且还包括停止或至少减缓在没有治疗的情况下预期的症状进展或恶化。有益的或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓解、缺陷程度的减轻、肿瘤或恶性肿瘤的稳定(即，不恶化)状态、肿瘤生长和/或转移的延迟或减慢，以及与没有治疗时预期的寿命相比寿命延长。
[0090]
如本文所用，术语“施用”是指通过一种方法或途径将本文所述的激动剂复合物(或融合蛋白)置于受试者体内，所述方法或途径使得药剂至少部分定位于所需部位。包含本文所述的激动剂复合物(或融合蛋白)的药物组合物可以通过任何合适的途径施用，从而在受试者中产生有效的治疗。
[0091]
药物组合物和施用途径
[0092]
还设想了包含天然杀伤组2d(nkg2d)激动剂复合物(或融合蛋白)的组合物，所述复合物包含如本文所述的可溶性mhc i链相关分子(smic)和非阻断smic中和抗体。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与可接受用于制药行业的载剂的组合。短语“药学上可接受的”在本文中用以指在合理医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0093]
包含溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备在本领域中是熟知的并且不需要基于配方进行限制。通常，此类组合物被制备为可注射的液体溶液或悬浮液，然而，也可以制备适用于在使用前在液体中的溶液或悬浮液的固体形式。制剂也可以被乳化或以脂质体组合物的形式存在。活性成分可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的并且与活性成分相容，并且呈适于在本文所描述的治疗方法中使用的量。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，组合物可含有少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂等，其增强或保持活性成分的有效性。如本文所述的治疗组合物可以包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由多肽的游离氨基形成)，所述酸加成盐由如例如盐酸或磷酸的无机酸或如乙酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成。由游离羧基形成的盐也可以衍生自如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁的无机碱以及如异丙胺、三甲胺、2-乙胺乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等的有机碱。生理学上可耐受的载剂是所属领域中熟知的。示例性液体载剂是无菌水溶液，所述无菌水溶液除了活性成分和水以外不含任何材料或者含有处于生理ph值的磷酸钠等缓冲液、生理盐水或两者，例如磷酸盐缓冲盐水。仍进一步地，水性载剂可以含有超过一种缓冲盐以及例如氯化钠和氯化钾、右旋糖、聚乙二醇和其它溶质的盐。液体组合物还可以含有除了水以外并且排除水以外的液相。此类额外液相的实例是甘油、例如棉花籽油的植物油以及水油乳剂。在治疗特定病症或病况中有效的本发明中使用的活性剂的量将取决于病症或病况的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。
[0094]
例如，含有至少一种药剂的治疗组合物可以常规地以单位剂量施用。当关于治疗组合物使用时，术语“单位剂量”是指适合作为受试者的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的活性材料，其经计算以与所需生理学可接受的稀释剂(即载剂或赋形剂)一起产生所需的治疗效果。
[0095]
需要施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断并且对每个个体都是特定的。然而，本文公开了全身施加的合适剂量范围并且取决于施用途径。合适的施用方案也是可变的，但以初始施用为代表，随后以一个或多个小时的间隔通过随后的注射或其它施用重复给药。或者，设想了足以将血液中的浓度维持在针对体内疗法指定的范围内的连续静脉内输注。
[0096]
如本文所用，短语“治疗有效量”、“有效量”或“有效剂量”是指在肿瘤或恶性肿瘤的治疗、预防或管理中提供治疗或美学益处的量，例如提供肿瘤或恶性肿瘤的至少一种症状、体征或标记物的统计学上显著降低的量。治疗有效量的测定完全在本领域技术人员的能力范围内。通常，治疗有效量可随受试者的病史、年龄、病况、性别以及受试者的医学病况的严重程度和类型以及其它药物活性剂的施用而变化。
[0097]
药剂的剂量范围取决于效力，并且涵盖足以产生所需效果的量，例如减缓肿瘤生长或减小肿瘤大小。剂量不应大到引起不可接受的不良副作用。通常，剂量将随着患者的年龄、病况和性别而变化并且可由本领域技术人员确定。在出现任何并发症的情况下，也可以由个别医生调整剂量。在一些实施方案中，剂量范围介于0.001mg/kg体重至0.5mg/kg体重。或者，可以调整剂量范围以将血清水平维持在1mg/ml与1000mg/ml之间。对于全身施用，可以向受试者施用治疗量，例如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg或更多。
[0098]
可以重复上述剂量的施用。在一些实施方案中，每天一次或每天多次给予剂量。在一些实施方案中，每天施用剂量，持续数周或数月。治疗的持续时间取决于受试者的临床进展和对治疗的反应。
[0099]
在一些实施方案中，剂量为约2mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约2mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约4mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约5mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约6mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约8mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约10mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约15mg/kg。
[0100]
在一些实施方案中，剂量可以静脉内施用。在一些实施方案中，静脉内施用可以是在约10分钟至约3小时的时间段内进行的输注。在一些实施方案中，静脉内施用可以是在约30分钟至约90分钟的时间段内进行的输注。
[0101]
在一些实施方案中，剂量可以大约每周一次施用。在一些实施方案中，剂量可以每周施用。在一些实施方案中，剂量可以每周一次施用，持续约12周至约18周。在一些实施方案中，剂量可以大约每2周一次施用。在一些实施方案中，剂量可以大约每3周一次施用。在一些实施方案中，剂量可以是约每2周一次施用的约2mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约每3周一次施用的约2mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约每2周一次静脉内施用的约2mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约每3周一次静脉内施用的约2mg/kg至约15mg/kg。
[0102]
在一些实施方案中，剂量可以是约1mg至约2000mg。在一些实施方案中，剂量可以
是约3mg。在一些实施方案中，剂量可以是约10mg。在一些实施方案中，剂量可以是约30mg。在一些实施方案中，剂量可以是约1000mg。在一些实施方案中，剂量可以是约2000mg。在一些实施方案中，剂量可以是每天通过静脉输注给予的约3mg。在一些实施方案中，剂量可以是每天通过静脉输注给予约10mg。在一些实施方案中，剂量可以是每周三次通过静脉输注给予的约30mg。
[0103]
治疗有效量是足以在肿瘤大小、肿瘤生长等方面产生统计学显著的、可测量的变化的药剂的量(功效测量在下文中描述)。此类有效量可以在临床试验以及动物研究中进行测量。
[0104]
药剂可以通过注射或随着时间的推移逐渐输注而静脉内施用。给定用于给定途径的适当配方，例如可用于本文所述的方法和组合物的药剂可以静脉内、鼻内、通过吸入、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内施用，并且如果需要，可以通过蠕动方式或通过本领域技术人员已知的其它方式递送。优选将本文使用的化合物口服、静脉内或肌肉内施用于患有癌症的患者。还特别设想了直接对肿瘤块进行局部施用。
[0105]
组合疗法
[0106]
特别设想了所描述的nkg2d激动剂复合物(或融合蛋白)与额外的治疗剂或疗法的组合。在一些实施方案中，额外的治疗剂在癌症治疗中是有效的。示例性的额外的治疗剂或疗法包括但不限于手术疗法、化学疗法(例如，施用蛋白激酶抑制剂或egfr靶向疗法)、放射疗法、冷冻疗法、热疗、光疗、放射消融疗法、激素疗法、免疫疗法、小分子疗法、受体激酶抑制剂疗法、抗血管生成疗法、细胞因子疗法或生物疗法，例如单克隆抗体、sirna、mirna、反义寡核苷酸、核酶或基因疗法。生物疗法可以是但不限于基因疗法，例如肿瘤抑制基因疗法、细胞死亡蛋白基因疗法、细胞周期调节基因疗法、细胞因子基因疗法、毒素基因疗法、免疫基因疗法、自杀基因疗法、前药基因疗法、抗细胞增殖基因疗法、酶基因疗法或抗血管生成因子基因疗法。
[0107]
组合疗法可以在其它药剂治疗之前或之后，间隔数分钟至数周。在另一种药剂和组合疗法单独应用于细胞的实施方案中，通常会确保在每次递送时间之间有相当长的一段时间没有过期，使得药剂和表达构建体仍将能够对细胞产生有利的组合作用。在这种情况下，设想可以在彼此相隔约12-24小时内，更优选在彼此相隔约6-12小时内用两种方式接触细胞。在一些情况下，可能需要显著地延长治疗时间段；然而，其中在每次给药之间经过数天(例如，2天、3天、4天、5天、6天或7天)至数周(例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周)。
[0108]
在一些实施方案中，额外的治疗剂或疗法包括化学疗法。顺铂(cisplatin)(cddp)；卡铂(carboplatin)；丙卡巴肼(procarbazine)；二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；喜树碱(camptothecin)；异环磷酰胺(ifosfamide)；美法仑(melphalan)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；白消安(busulfan)；亚硝基脲(nitrosurea)；放线菌素d(dactinomycin)；道诺霉素(daunorubicin)；阿霉素(doxorubicin)；博来霉素(bleomycin)；嘌呤霉素(plicomycin)；丝裂霉素(mitomycin)；依托泊苷(etoposide)(vp16)；它莫西芬(tamoxifen)；雷洛昔芬(raloxifene)；雌激素受体结合剂；紫杉醇(taxol)；吉西他滨(gemcitabien)；长春瑞滨(navelbine)；法尼基蛋白转移酶抑制剂；跨铂(stransplatinum)；5-氟尿嘧啶；长春新碱(vincristine)；长春碱
(vinblastine)和甲氨蝶呤(methotrexate)；替莫唑胺(temazolomide)(dtic的含水形式)；烷基化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美图多巴(meturedopa)和尿多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基密胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；克拉司他汀(callystatin)；cc-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物、kw-2189和cb1-tm1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸二氯甲基二乙胺氧化物(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracil mustard)；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司丁(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷尼莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γii和卡奇霉素ωii；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素a；双膦酸盐，例如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯佩拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authrarnycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素c(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、卡诺霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素d、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(例如丝裂霉素c)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、派来霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷
(floxuridine)；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，例如米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利乙铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达宁(lonidainine)；美登木素(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；psk多糖复合物；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid；triaziquone)；2,2',2
”‑
三氯三乙胺；单端孢霉烯类(trichothecenes)(尤其是t-2毒素、疣孢菌素(verracurin)a、杆孢菌素(roridin)a和蛇形菌素(anguidine))；氨基钾酸酯(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；咖胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)("ara-c")；环磷酰胺；紫杉类(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛吉西他滨(docetaxel gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤(mercaptopurine)；铂配位复合物，例如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂；长春碱；铂(platinum)；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如，cpt-11)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine)(dmfo)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；卡铂、丙卡巴肼、嘌呤霉素、吉西他滨、长春瑞滨、法呢基蛋白转移酶抑制剂、跨铂；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0109]
在一些实施方案中，本文所述的激动剂复合物与组蛋白脱乙酰酶抑制剂组合使用。在一些实施方案中，本文所述的激动剂复合物与吉非替尼(gefitinib)组合使用。在一些实施方案中，本文所述的激动剂复合物与格列卫(gleevec)组合使用(例如，可向患者施用约400毫克/天至约800毫克/天的格列卫)。在一些实施方案中，一种或多种化疗剂可与本文所述的激动剂复合物组合使用。
[0110]
在一些实施方案中，额外的治疗剂或疗法包括放射疗法。引起dna损伤并已被广泛使用的其它因素包括通常称为y射线、x射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。其它形式的dna损伤因素也是已知的，例如微波和uv照射。很可能所有这些因素都会对dna、dna前体、dna的复制和修复以及染色体的组装和维护产生广泛的损伤。x射线的剂量范围从长时间(3周至4周)的50伦琴至200伦琴的每日剂量到2000伦琴至6000伦琴的单次剂量不
等。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。
[0111]
在一些实施方案中，疗法的额外治疗剂包括免疫疗法。免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标记物具有特异性的抗体。单独的抗体可以用作治疗的效应物或其可以募集其它细胞来实际影响细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素a链、霍乱毒素、百日咳毒素等)结合并仅用作靶向剂。或者，效应子可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性t细胞和nk细胞以及这些细胞类型的基因工程变体，其经过修饰以表达嵌合抗原受体。
[0112]
可与本文所述的激动剂复合物组合的示例性免疫疗法包括免疫佐剂(例如，牛结核分枝杆菌(mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物)(美国专利第5,801,005号；第5,739,169号；hui和hashimoto,1998；christodoulides等人,1998)、细胞因子疗法(例如，干扰素α、β和γ；白介素(il-1、il-2)、gm-csf和tnf)(bukowski等人,1998；davidson等人,1998；hellstrand等人,1998)、基因疗法(例如，tnf、il-1、il-2、p53)(qin等人,1998；austin-ward和villaseca,1998；美国专利第5,830,880号和第5,846,945号)和单克隆抗体(例如，抗神经节苷脂gm2、抗her-2、抗p185)(pietras等人,1998；hanibuchi等人,1998；美国专利第5,824,311号)。赫赛汀(herceptin)(曲妥珠单抗(trastuzumab))是一种嵌合(鼠-人)单克隆抗体，可阻断her2-neu受体。其具有抗肿瘤活性并已被批准用于治疗恶性肿瘤(dillman,1999)。癌症与赫赛汀和化学疗法的组合疗法已被证明比个别疗法更有效。因此，设想一种或多种抗癌疗法可与本文所述的组合疗法一起使用。
[0113]
设想用于本公开内容的方法中的其它免疫疗法包括由tchekmedyian等人,2015描述的那些，其通过引用并入本文。免疫疗法可包括抑制t调节性细胞(treg)、髓源性抑制细胞(mdsc)和癌症相关成纤维细胞(caf)。在一些实施方案中，免疫疗法是肿瘤疫苗(例如，全肿瘤细胞疫苗、肽和重组肿瘤相关抗原疫苗)或过继细胞疗法(act)(例如，t细胞、自然杀伤细胞、til和lak细胞)。t细胞可以针对用嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)工程化为特定的肿瘤抗原。如本文所用，嵌合抗原受体(或car)可以指对所关注的抗原具有特异性的任何工程化受体，当在t细胞中表达时，其将car的特异性赋予t细胞。一旦使用标准分子技术产生，就可以将表达嵌合抗原受体的t细胞引入患者体内，正如例如过继细胞转移的技术。在一些方面，t细胞是个体中的活化的cd4和/或cd8 t细胞，其特征在于产生ifnγ"的cd4和/或cd8 t细胞和/或与组合施用之前相比增强的溶细胞活性。cd4和/或cd8 t细胞可能展现出增加的细胞因子释放，所述细胞因子选自ifn-γ、tnf-α和白介素。cd4和/或cd8 t细胞可以是效应记忆t细胞。在某些实施方案中，cd4和/或cd8效应记忆t细胞的特征在于具有cd44
高
cd62
低
表达。
[0114]
可与本文提供的组合物组合使用的单克隆抗体的实例包括但不限于曲妥珠单抗(抗her2/neu抗体)；帕妥珠单抗(pertuzumab)(抗her2 mab)；西妥昔单抗(cetuximab)(表皮生长因子受体egfr的嵌合单克隆抗体)；帕尼单抗(panitumumab)(抗egfr抗体)；尼妥珠单抗(nimotuzumab)(抗egfr抗体)；扎鲁木单抗(抗egfr mab)；耐昔妥珠单抗(necitumumab)(抗egfr mab)；mdx-210(人源化抗her-2双特异性抗体)；mdx-210(人源化抗
her-2双特异性抗体)；mdx-447(人源化抗egf受体双特异性抗体)；利妥昔单抗(rituximab)(嵌合鼠/人抗cd20 mab)；奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)(抗cd20 mab)；奥法木单抗(ofatumumab)(抗cd20mab)；托西莫单抗(tositumumab)-i131(抗cd20 mab)；替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗cd20 mab)；贝伐单抗(bevacizumab)(抗vegf mab)；雷莫芦单抗(ramucirumab)(抗vegfr2 mab)；兰尼单抗(ranibizumab)(抗vegf mab)；阿柏西普(aflibercept)(与igg1 fc融合的vegfr1和vegfr2的胞外结构域)；amg386(与igg1 fc融合的血管生成素-1和血管生成素-2结合肽)；达洛珠单抗(dalotuzumab)(抗igf-1r mab)；吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(抗cd33 mab)；阿仑单抗(alemtuzumab)(抗campath-1/cd52 mab)；本妥昔单抗(brentuximab vedotin)(抗cd30 mab)；卡妥索单抗(catumaxomab)(靶向上皮细胞粘附分子和cd3的双特异性mab)；那普妥莫单抗(naptumomab)(抗5t4 mab)；吉妥昔单抗(girentuximab)(抗碳酸酐酶ix)；或法妥珠单抗(抗叶酸受体)。其它实例包括例如以下的抗体：panorex.tm.(17-1a)(鼠单克隆抗体)；panorex(@(17-1a)(嵌合鼠单克隆抗体)；bec2(抗独特型mab，模拟gd表位)(具有bcg)；oncolym(lym-1单克隆抗体)；smart m195 ab、人源化13'1lym-1(oncolym)、ovarex(b43.13，抗独特型小鼠mab)；与腺癌上的egp40(17-1a)泛癌抗原结合的3622w94 mab；赛尼哌(zenapax)(smart抗tac(il-2receptor受体)；smart m195 ab，人源化ab，人源化)；novomab-g2(泛癌特异性)；tnt(组蛋白抗原的嵌合mab)；tnt(组蛋白抗原的嵌合mab)；gliomab-h(单克隆-人源化abs)；gni-250mab；emd-72000(嵌合-egf拮抗剂)；lymphocide(人源化il.l.2抗体)；和mdx-260双特异性、靶标gd-2、ana ab、smart idio ab、smart abl 364ab或immurait-cea。抗体的实例包括在美国专利第5,736,167号、第7,060,808号和第5,821,337号中公开的那些抗体。
[0115]
抗体的其它实例包括抗人抗体ox40激动剂抗体(基因泰克(genentech))；扎努木单抗(zanulimumab)(抗cd4 mab)；凯利昔单抗(keliximab)(抗cd4 mab)；伊匹单抗(mdx-101；抗ctla-4mab)；曲美木单抗(tremilimumab)(抗ctla-4mab)；达利珠单抗(daclizumab)(抗cd25/il-2r mab)；巴利昔单抗(basiliximab)(抗cd25/il-2r mab)；mdx-1106(抗pd1 mab)；gitr的抗体；gc1008(抗tgf-β抗体)；美替木单抗(metelimumab)/cat-192(抗tgf-β抗体)；乐地单抗(lerdelimumab)/cat-152(抗tgf-β抗体)；id11(抗tgf-β抗体)；地诺单抗(denosumab)(抗rankl mab)；bms-663513(人源化抗4-1bb mab)；sgn-40(人源化抗cd40 mab)；cp870,893(人源化抗cd40 mab)；英夫利西单抗(infliximab)(嵌合抗tnf mab)；阿达木单抗(adalimumab)(人抗tnf mab)；赛妥珠单抗(certolizumab)(人源化fab抗tnf)；戈利木单抗(golimumab)(抗tnf)；依那西普(etanercept)(与igg1 fc融合的tnfr的胞外结构域)；贝拉西普(belatacept)(与fc融合的ctla-4的胞外结构域)；阿巴西普(abatacept)(与fc融合的ctla-4的胞外结构域)；贝利木单抗(belimumab)(抗b淋巴细胞刺激因子)；莫罗莫那(muromonab)-cd3(抗cd3 mab)；奥昔组单抗(otelixizumab)(抗cd3 mab)；替利组单抗(teplizumab)(抗cd3 mab)；塔西单抗(tocilizumab)(抗il6r mab)；regn88(抗il6r mab)；优特克单抗(ustekinumab)(抗il-12/23mab)；贝伐珠单抗(briakinumab)(抗il-12/23mab)；那他珠单抗(natalizumab)(抗α4整合素)；维多珠单抗(vedolizumab)(抗α4β7整合素mab)；t1 h(抗cd6 mab)；依帕珠单抗(epratuzumab)(抗cd22 mab)；依法利珠单抗(efalizumab)(抗cd11a mab)；和阿他西普(atacicept)(与fc融合的跨膜活化因子和钙调
节配体相互作用因子的胞外结构域)。
[0116]
设想其它药剂可与本文提供的组合物组合使用以提高治疗的疗效。这些额外的药剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体和gap连接上调的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂或增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；il-2和其它细胞因子；f42k和其它细胞因子类似物；或mip-1、mip-1β、mcp-1、rantes和其它趋化因子。进一步设想细胞表面受体或其配体(例如fas/fas配体、dr4或dr5/trail)的上调将通过建立对过度增殖细胞的自分泌或旁分泌作用来增强本文提供的组合物的凋亡诱导能力。通过增加gap连接的数量来增加细胞间信号传导将增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其它实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本文提供的组合物组合使用以提高治疗的抗过度增殖功效。考虑细胞粘附抑制剂来改善本发明的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(fak)抑制剂和洛伐他汀(lovastatin)。还设想增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其它药剂(例如抗体c225)可以与本文提供的组合物组合使用以改善治疗功效。
[0117]
在进一步的实施方案中，其它药剂可以是一种或多种溶瘤病毒。溶瘤病毒的实例包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒、痘苗病毒、水泡性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒(newcastle's disease viruses)、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus)、流感病毒和呼肠孤病毒。在一个特定的实施方案中，另一种药剂是拉他莫基(talimogene laherparepvec)(t-vec)，其是经工程化以表达gm-csf的溶瘤性单纯疱疹病毒。拉他莫基(hsv-1[菌株js1]icp34.5-/icp47-/hgm-csf)(以前称为oncovex.sup.gm csf)是一种肿瘤内递送的溶瘤免疫疗法，其包括在实体瘤中选择性复制的免疫增强型hsv-1。(lui等人,2003；美国专利第7,223,593号和第7,537,924号；通过引用并入本文)。
[0118]
在某些实施方案中，激素疗法也可与本实施方案组合使用或与先前描述的任何其它癌症疗法组合使用。激素的使用可用于治疗某些癌症，例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌，以降低某些激素(例如睾酮或雌激素)的水平或阻断其作用。这种治疗通常与至少一种其它癌症疗法组合使用，作为治疗选择或降低转移风险。
[0119]
在一些方面，额外的抗癌剂是抑制参与蛋白激酶或生长因子信号传导途径的受体的蛋白激酶抑制剂或单克隆抗体，例如egfr、vegfr、akt、erb1、erb2、erbb、syk、bcr-abl、jak、src、gsk-3、pi3k、ras、raf、mapk、mapkk、mtor、c-kit、eph受体或braf抑制剂。蛋白激酶或生长因子信号传导途径抑制剂的非限制性实例包括阿法替尼(afatinib)、阿昔替尼(axitinib)、贝伐单抗、博舒替尼(bosutinib)、西妥昔单抗、克唑替尼(crizotinib)、达沙替尼(dasatinib)、埃罗替尼(erlotinib)、福坦替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、木利替尼(mubritinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕尼单抗、帕唑帕尼(pazopanib)、哌加他尼(pegaptanib)、兰尼单抗、鲁索替尼(ruxolitinib)、塞卡替尼(saracatinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、凡德他尼(vandetanib)、ap23451、威罗菲尼(vemurafenib)、mk-2206、gsk690693、a-443654、vqd-002、米替福新(miltefosine)、哌立福新(perifosine)cal101、px-866、ly294002、雷帕霉素(rapamycin)、西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、阿伏西地
(alvocidib)、染料木素(genistein)、司美替尼(selumetinib)、azd-6244、瓦他拉尼(vatalanib)、p1446a-05、ag-024322、zd1839、p276-00、gw572016或其混合物。
[0120]
在一些方面，pi3k抑制剂选自由以下组成的pi3k抑制剂群组：布帕尼西(buparlisib)、艾代拉利司(idelalisib)、byl-719、达克利司(dactolisib)、pf-05212384、匹替西布(pictilisib)、考泮利司(copanlisib)、二盐酸考泮利司(copanlisib dihydrochloride)、zstk-474、gsk-2636771、杜韦利西布(duvelisib)、gs-9820,pf-04691502,sar-245408、sar-245409、索诺利西布(sonolisib)、太古毒素(archexin)、gdc-0032、gdc-0980、阿皮托利西布(apitolisib)、皮拉力西布(pilaralisib)、dlbs 1425、px-866、伏达利西布(voxtalisib)、azd-8186、bgt-226、ds-7423、gdc-0084、gsk-21 26458、ink-1 1 17、sar-260301、sf-1 1 26、amg-319、bay-1082439、ch-51 32799、gsk-2269557、p-71 70、pwt-33597、cal-263、rg-7603、ly-3023414、rp-5264、rv-1729、他舍利西布(taselisib)、tgr-1 202、gsk-418、incb-040093、帕努利西布(panulisib)、gsk-105961 5、cnx-1351、amg-51 1、pqr-309、17β-羟基渥曼青霉素(17beta-hydroxywortmannin)、aezs-129、aezs-136、hm-5016699、ipi-443、onc-201、pf-4989216、rp-6503、sf-2626、x-339、xl-499、pqr-401、aezs-132、czc-24832、kar-4141、pqr-31 1、pqr-316、rp-5090、vs-5584、x-480、aezs-126、as-604850、bag-956、cal-130、czc-24758、etp-46321、etp-471 87、gne-317、gs-548202、hm-032、kar-1 139、ly-294002、pf-04979064、pi-620、pki-402、pwt-143、rp-6530、3-hoi-ba-01、aezs-134、as-041 164、as-252424、as-605240、as-605858、as-606839、bcca-621c、cay-10505、ch-5033855、ch-51 08134、cudc-908、czc-1 9945、d-106669、d-87503、dpt-nx7、etp-46444、etp-46992、ge-21、gne-123、gne-151、gne-293、gne-380、gne-390、gne-477、gne-490、gne-493、gne-614、hmpl-51 8、hs-104、hs-1 06、hs-1 16、hs-173、hs-196、ic-486068、ink-055、kar 1 141、ky-1 2420、渥曼青霉素(wortmannin)、lin-05、npt-520-34、pf-04691503、pf-06465603、pgnx-01、pgnx-02、pi 620、pi-103、pi-509、pi-516、pi-540、pik-75、pwt-458、ro-2492、rp-5152、rp-5237、sb-201 5、sb-2312、sb-2343、shbm-1009、sn 32976、sr-13179、srx-2523、srx-2558、srx-2626、srx-3636、srx-5000、tgr-5237、tgx-221、ucb-5857、way-266175、way-266176、ei-201、aezs-131、aqx-mn100、kcc-tgx、oxy-1 1 1a、pi-708、px-2000和wjd-008。
[0121]
设想额外的癌症疗法可以包含靶向例如以下的抗体、肽、多肽、小分子抑制剂、sirna、mirna或基因疗法：表皮生长因子受体(egfr、egfr1、erbb-1、her1)、erbb-2(her2/neu)、erbb-3/her3、erbb-4/her4、egfr配体家族；胰岛素样生长因子受体(igfr)家族、igf结合蛋白(igfbp)、igfr配体家族(igf-1r)；血小板衍生生长因子受体(pdgfr)家族、pdgfr配体家族；成纤维细胞生长因子受体(fgfr)家族、fgfr配体家族、血管内皮生长因子受体(vegfr)家族、vegf家族；hgf受体家族；trk受体家族；肝配蛋白(eph)受体家族；axl受体家族；白细胞酪氨酸激酶(ltk)受体家族；tie受体家族；血管生成素1、2；受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ror)受体家族；盘状结构域受体(ddr)家族；ret受体家族；klg受体家族；ryk受体家族；musk受体家族；转化生长因子α(tgf-α)、tgf-α受体；转化生长因子β(tgf-β)、tgf-β受体；白介素13受体α2链(1l13rα2)、白介素-6(il-6)、1l-6受体、白介素-4、il-4受体、细胞因子受体、i类(造血家族)和ii类(干扰素/1l-10家族)受体、肿瘤坏死因子(tnf)家族、tnf-α、肿瘤坏死因子(tnf)受体超家族(tntrsf)、死亡受体家族、trail-受体；睾丸癌(ct)抗原、谱
系特异性抗原、分化抗原α-肌动蛋白-4、artc1、断点聚类区域-abelson(bcr-abl)融合产物b-raf、半胱天冬酶-5(casp-5)、半胱天冬酶-8(casp-8)、β-连环蛋白(ctnnb1)、细胞分裂周期27(cdc27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(cdk4)、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、eftud-2、延长因子2(elf2)、ets变体基因6/急性骨髓性白血病1基因ets(etc6-aml1)n融合蛋白、纤维连接蛋白(fn)、gpnmb、低密度脂质受体/gdp-l岩藻糖；β-d半乳糖2-α-l岩藻糖基转移酶(ldlr/fut)融合蛋白、hla-a2、hla-a2基因中α2结构域的α螺旋的170位残基处的精氨酸与异亮氨酸交换(hla-a*201-r1700、mla-a11、热休克蛋白70-2突变型(hsp70-2m)、kiaa0205、mart2、黑色素瘤普遍突变型1、2、3(mum-1、2、3)、前列腺酸性磷酸酶(pap)、neo-pap、肌球蛋白1类、nfyc、ogt、os-9、pml-rarα融合蛋白、prdxs、ptprk、k-ras(kras2)、n-ras(nras)、hras、rbaf600、sirt2、snrpd1、syt-ssx1或ssx2融合蛋白、磷酸丙糖异构酶、bage、bage-1、bage-2,3,4,5、gage-1,2,3,4,5,6,7,8、gnt-v(异常的n-乙酰基葡糖胺基转移酶v、mgats)、herv-k-mel、kk-lc、lage、lage-1、黑色素瘤上的ctl识别抗原(camel)、mage-a1(mage-1)、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-as、mage-a6、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11、mage-a12、mage-3、mage-b1、mage-b2、mage-b5、mage-b6、mage-c1、mage-c2、粘蛋白1(muc1)、mart-1/melan-a(mlana)、gp100、gp100/pme117(s1lv)、酪氨酸酶(tyr)、trp-1、hage、na-88、ny-eso-1、ny-eso-1/lage-2、sage、sp17、ssx-1,2,3,4、trp2-1nt2、癌胚抗原(cea)、血管舒缓素4、乳腺珠蛋白-a、oa1、前列腺特异性抗原(psa)、前列腺特异性膜抗原、trp-1/gp75、trp-2、亲脂素(adipophilin)、nielanorna 2中缺失的干扰素可诱导蛋白(aim-2)、bing-4、cpsf、细胞周期素d1、上皮细胞粘附分子(ep-cam)、epba3、成纤维细胞生长因子-5(fgf-5)、糖蛋白250(gp250肠羧酸酯酶(ice)、α-胎儿蛋白(afp)、m-csf、mdm-2、muci、p53(tp53)、pbf、frame、psma、rage-1、rnf43、ru2as、sox10、steap1、存活素(bircs)、人端粒酶逆转录酶(htert)、端粒酶、威尔姆斯肿瘤基因(wilms'tumor gene)(wt1)、sycp1、brdt、spanx、xage、adam2、page-5、lip1、ctage-1、csage、mma1、cage、boris、hom-tes-85、af15q14、hca66i、ldhc、morc、sgy-1、spo11、tpx1、ny-sar-35、fthli7、nxf2 tdrd1、tex 15、fate、tpte、免疫球蛋白独特型、本斯-琼斯蛋白(bence-jones protein)、雌激素受体(er)、雄激素受体(ar)、cd40、cd30、cd20、cd19、cd33、cd4、cd25、cd3、癌症抗原72-4(ca72-4)、癌症抗原15-3(ca15-3)、癌症抗原27-29(ca27-29)、癌症抗原125(ca125)、癌症抗原19-9(ca19-9)、β-人绒毛膜促性腺激素、1-2微球蛋白、鳞状细胞癌抗原、神经元特异性烯醇酶(neuron-specific enojase)、热休克蛋白gp96、gm2、沙莫司亭(sargramostim)、ctla-4、707丙氨酸脯氨酸(707-ap)、t细胞识别的腺癌抗原4(art-4)、癌胚抗原肽-1(cap-1)、钙活化氯离子通道-2(clca2)、亲环蛋白(cyclophilin)b(cyp-b)、人印戒肿瘤(human signet ring tumor)-2(hst-2)、人乳头状瘤病毒(hpv)蛋白(hpv-e6、hpv-e7、主要或次要衣壳抗原、其它者)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)蛋白(ebv潜伏膜蛋白-lmp1、lmp2；其它者)、乙型或丙型肝炎病毒蛋白和hiv蛋白。
[0122]
在一些实施方案中，本文所述的方法包括向受试者施用检查点抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是小分子、抑制性核酸、抑制性多肽、抗体或其抗原结合结构域或抗体试剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗体或其抗原结合域，或抗体试剂结合免疫检查点多肽并抑制其活性。针对治疗的常见检查点包括但不限于pd-l1、pd-l2、pd-1、ctla-4、tim-3、lag-3、vista和tigit。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗体或其抗原结合域，
或抗体试剂结合pd-1、pd-l1或pd-l2多肽并抑制其活性。
[0123]
已知检查点调节剂的抑制剂(例如，pd-l1、pd-l2、pd-1、ctla-4、tim-3、lag-3、vista或tigit)在本领域中是已知的。检查点抑制剂的非限制性实例(在括号中注明检查点目标和制造商)可以包括：mga271(b7-h3：宏基因(macrogenics))；伊匹单抗(ctla-4；百时美施贵宝(bristol meyers squibb))；派姆单抗(pd-1；默克(merck))；纳武单抗(pd-1；百时美施贵宝)；阿特珠单抗(pd-l1；基因泰克)；imp321(lag3：免疫泰普(immuntep))；bms-986016(lag3；百时美施贵宝)；iph2101(kir；先天制药(innate pharma))；替西木单抗(ctla-4；医学免疫公司(medimmune))；匹地利珠单抗(pd-1；麦迪韦逊(medivation))；mpdl3280a(pd-l1；罗氏(roche))；medi4736(pd-l1；阿斯利康(astrazeneca))；msb0010718c(pd-l1；emd雪兰诺(emd serono))；aunp12(pd-1；奥瑞金(aurigene))；阿维鲁单抗(pd-l1；默克)；德瓦鲁单抗(pd-l1；医学免疫公司)；和tsr-022(tim3；泰萨罗(tesaro))。
[0124]
在一些实施方案中，检查点抑制剂抑制pd-1。pd-1抑制剂包括但不限于派姆单抗(keytruda
tm
)、纳武单抗、aunp-12和匹地利珠单抗。在另一个实施方案中，检查点抑制剂抑制pd-l1。pd-l1抑制剂包括但不限于阿特珠单抗、mpdl3280a、阿维鲁单抗和德瓦鲁单抗。
[0125]
监测治疗的功效
[0126]
给定的癌症治疗的功效可由熟练的临床医生确定。然而，如果例如肿瘤的任何一种或所有体征或症状以有益的方式改变或其它临床上可接受的症状得到改善或甚至改良，例如在用本文所述的药剂治疗后改善或甚至改良至少10％，那么治疗被认为是本文所用术语“有效治疗”。功效还可以通过个体并未如通过住院治疗所评估恶化或需要医疗干预(例如，疾病的进展停止)来测量。测量这些指标的方法是所属领域技术人员已知的和/或描述于本文中。
[0127]
用于治疗疾病的有效量是指当向有需要的哺乳动物施用时足以使得如本文所定义的所述术语对所述疾病进行有效治疗的量。可以通过评估例如癌症的物理指标来确定药剂的功效，例如肿瘤大小、肿瘤质量、肿瘤密度、血管生成、肿瘤生长速率等。此外，可以通过用包含如本文所述的抗体或其抗原结合部分或编码如本文所述的抗体或其抗原结合部分的核酸的药剂治疗的受试者中循环mic肽或其片段的减少来测量药剂的功效。
[0128]
本公开的实施方案的描述并非旨在是详尽的或将本公开限制于所公开的精确形式。虽然本文出于说明的目的描述了本公开的特定实施方案和实例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，各种等效修改在本公开的范围内是可能的。在此提供的本公开的教导可以适当地应用于其它程序或方法。可以组合本文所述的各种实施方案以提供另外的实施方案。如果需要，可以修改本公开的方面以采用以上参考文献和应用的组成、功能和概念来提供本公开的其它另外的实施方案。根据详细描述，可以对本公开做出这些和其它改变。
[0129]
任何前述实施方案的特定要素可以组合或取代其它实施方案中的要素。此外，虽然已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其它实施方案也可以展现出这些优点，并且并非所有实施方案都需要展示这些优点来落入本公开的范围内。
[0130]
为了描述并公开例如在这些出版物中描述的可能与本发明结合使用的方法的目的，通过引用明确地将所有专利和其它出版物并入本文。这些出版物仅提供用于在本技术
的提交日期之前对其进行公开。这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人无权凭借先前的发明或出于任何其它原因而先于此类公开。所有关于这些文件的日期或内容的陈述均基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
[0131]
实施例
[0132]
材料和方法
[0133]
smic/mic阴性癌症的鉴定：可以通过使用标准mica或micb检测elisa测定血清水平smica或smicb来鉴定smic阴性肿瘤。mic阴性受试者不应含有超出背景噪声的可检测smic。对于活检可用的肿瘤，也可以选择mic表达为阴性或通过免疫组织化学证实与抗mic抗体无交叉反应。
[0134]
非阻断抗smic/mic抗体d4h3的肽结合区：使用化学交联、高质量maldi质谱法和nlc-orbitrap质谱法表征抗原与抗体ab-d4h3之间的相互作用界面。结果表明，ab-d4h3与抗原的两个区域结合，在抗原上具有以下氨基酸：68、72、75、77和206、207和209。这些区域不与mic的α-1和α-2结构域中的nkg2d结合区竞争(li等人,《自然免疫学(nat immunol.)》2001年5月；2(5):443-51.，其公开内容通过引用整体并入本文)。
[0135]
smic/抗-smic复合物的产生：通过在室温或37
°
℃(摩尔比1:1或2:1)下将smic与抗smic抗体混合来形成复合物。也可以通过用多接头将smic连接至抗smic抗体的重链或轻链来形成复合物。
[0136]
实施例1
–
smic/抗smic复合物在体外增强cd3/tcr介导的cd8 t细胞活化
[0137]
在存在smic、抗smic抗体(例如，d4h3)或smic/抗smic mab复合物的情况下，在存在或不存在板结合的cd3的情况下刺激来自正常供体的pbmc持续3天，并且通过细胞内染色来测定cd8 t细胞ifnγ产生。可溶性抗cd28刺激用作阳性对照。如图1所示，类似于抗cd28刺激，smic/抗mic复合物在cd3连接后活化cd8 t细胞，从而表明smic/抗mic复合物的共刺激作用。单独的smic和抗mic mab都没有类似的作用。此外，smic/抗-mic和抗-cd28产生相加作用来扩增cd3介导的cd8 t细胞活化(图1)。此外，羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(cfse)稀释测定显示smic/抗mic共刺激也增强了cd8 t细胞增殖(图1)。
[0138]
在另一个实施例中，在存在smic、抗smic抗体(例如，no4)或smic/no4复合物情况下，在存在或不存在板结合的cd3的情况下刺激pbmc持续48小时，然后通过细胞内染色测定cd8 t细胞表面nkg2d表达和ifnγ产生。类似地，抗cd28激动剂抗体刺激用作cd8 t细胞共刺激的阳性对照。图2显示复杂刺激扩增了cd3/tcr活化，如通过cfse稀释测定进行的ifnγ产生和增殖所测量。有趣的是，与cd3或cd3/抗cd28刺激相比，cd3和smic/no4复合物刺激增加了cd8 t细胞表面nkg2d表达。总之，本实施例中提供的数据显示smic/抗smic复合物共刺激与抗cd28共刺激是无冗余的。
[0139]
实施例2-smic/抗smic复合物扩增抗原特异性cd8 t细胞反应。
[0140]
在存在或不存在smic(a)/d4h3复合物或酪氨酸酶肽
369-377
的情况下，将til1383i细胞(经工程化以表达cd34作为报告基因)与hla-a
2
替代t2-a2抗原呈递细胞(apc)一起培养。过夜培养后，通过对ifn、tnf和cd107a(脱颗粒)的细胞内染色来评估til13831活化。如图3所示，smic/d4h3复合物显著增强了til13831对hla-a2限制性酪氨酸酶肽的刺激。smic/d4h3复合物与乱序的ova肽一起不刺激til13831。用mab m585阻断nkg2d消除了smic/d4h3的共刺激作用。
[0141]
实施例3-使用smic/d4h3复合物的疗法抑制了mic阴性肿瘤的生长
[0142]
将mic
阴性
mc38结肠肿瘤细胞植入同系b6/micb雄性小鼠群组中。当肿瘤体积达到大约100mm 3
大小时，通过一周两次以4mg/kg的剂量腹膜内施用，分别单独或组合地用对照igg、重组rsmic、d4h3或smic/d4h3复合物治疗动物。如图4所示，smic/d4h3复合物显著抑制了肿瘤生长。复合疗法引起抗原特异性免疫反应。
[0143]
实施例4-通过elisa检测与受体nkg2d结合的mic/抗smic抗体
[0144]
elisa方法用于证实由smic和非阻断抗smic抗体(例如，no4或d4h3)构成的复合物与受体nkg2d结合以活化nkg2d介导的共刺激信号传导。
[0145]
图5显示复合物通过elisa测定与nkg2d结合。在这个测定中，将重组可溶性人nkg2d(rs-hnkg2d)固定到96孔板过夜，在洗涤以去除未结合的s-hnkg2d后，添加与各种浓度的抗smic单克隆抗体d4h3(图5a)或no4(图5b)(小鼠igg)复合的给定浓度的重组smica(来源：研发系统(r&d systems))或重组micb-his(来源：飞世尔(fisher))。用hrp结合的山羊抗小鼠抗体检测复合物与rs-hnkg2d的结合。
[0146]
实施例5
–
smic/d4h3复合疗法快速清除lcmv病毒感染。
[0147]
使c57bl/6小鼠群组静脉内(iv)接种2x106个pfu lcmv(淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒)阿姆斯壮毒株(armstrong strain.)。向小鼠给予(腹腔注射)smic/d4h3复合物(6mg/kg)或对照pbs：病毒接种后的第1天和第3天。在病毒接种后第1天和第5天从小鼠采集血液样品。血清病毒载量用噬菌斑测定来测定(如先前在welsh和seedhom,《current protocols in microbiology(curr protoc microbiol)》2008年2月；章节：单元-15a.1中所述)。如图8所示，接受smic/d4h3复合物疗法的小鼠的lcmv滴度显著降低。
[0148]
本文引用的任何期刊文章或专利文件均通过引用整体并入本文。