小檗碱生产菌株、其建立方法及其应用与流程

1.本发明属于合成生物学及工业生物学技术领域；更具体地，本发明涉及利用原核生物发酵生产植物天然产物。


背景技术：

2.植物次生代谢物由于其潜在的优势，长期受到人们的关注，但其面临生产难度大、成本高的问题。作为植物代谢产物的一种，生物碱在植物中的含量受到严格的调控，体现出种、属特异性。
3.小檗碱是一种原小檗碱组的苄基异喹啉类季铵型生物碱，主要存在于berberidaceae(小檗科)，ranunculaceae(毛茛科)，papaveraceae(罂粟科)，rutaceae(芸香科)植物的根、茎、树皮中。作为传统中药植物黄连的主要成分，具有抗菌消炎的作用。然而，近年来大量的研究表明，小檗碱还对多种肿瘤和心血管疾病等具有治疗潜力，且具有很高的成药性。
4.小檗碱的制备方式包括植物提取、化学合成和生物合成，因为小檗碱和青蒿素类似，在原生植物中含量高(黄连中小檗碱的含量可高达7-13％，占其总生物碱的70％左右)，所以它的制备主要通过从植物中分离纯化。然而，从植物中提取生物活性成分的方式受限于：1.植物的种植面积少；2.植物生长所需的时间长；3.生物活性成分含量低；4.提取方式损失大等方面因素。同时，化学合成的技术虽然成熟，但是在合成复杂天然产物时还存在诸多问题，包括合成某些消旋化合物的复杂性，以及化学合成途径的污染性等。因此，需要找到一种新的制备方式，补足植物提取和化学合成的短板，增加小檗碱的供应。
5.虽然直接对原产植物进行代谢工程的设计，理论上能获得更高的产量，然而这种手段在实际应用时往往受到多种限制，包括植物遗传操作的困难性和植物自身严密复杂的代谢调控。伴随代谢工程和合成生物学技术的发展，通过生物合成的方式获取生物碱，尤其是依托微生物的方法，由于微生物繁殖快、产量高且环境友好等优势快速兴起，引起研究人员的广泛关注。而合成生物学，更是突破了物种的局限性，为上述问题提供了解决之道。
6.尽管本领域技术人员关注利用合成生物学来进行小檗碱的合成，但是仍需要更多的技术改进，来实现外源基因于宿主更好地配合、生产。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供小檗碱生产菌株、其建立方法及其应用。
8.在本发明的第一方面，提供用于生产四氢小檗碱或小檗碱的重组原核细胞，其中包括：(a)酪氨酸羟化酶和辅酶四氢单喋呤循环再生模块，其从l-酪氨酸生成左旋多巴；(b)网状番荔枝碱合成模块，其从左旋多巴生成网状番荔枝碱；以及，(c)小檗碱合成模块，其从网状番荔枝碱生成四氢小檗碱或小檗碱。
9.在一个优选例中，(a)中包括：酪氨酸羟化酶；及，用于从4α-羟基四氢单喋呤生成四氢单喋呤的酶，较佳地包括：4α-羟基四氢喋呤脱水酶，二氢喋呤还原酶。
10.在另一优选例中，(b)中包括：用于从左旋多巴合成去甲劳丹碱的酶，较佳地包括多巴脱羧酶，单胺氧化酶，去甲乌药碱合酶2；及，用于从去甲劳丹碱合成网状番荔枝碱的酶，较佳地包括：去甲乌药碱6位氧甲基转移酶，乌药碱氮甲基转移酶，3’羟基氮甲基乌药碱4位氧甲基转移酶。
11.在另一优选例中，(c)中包括：用于从网状番荔枝碱合成四氢小檗碱或小檗碱的酶；较佳地包括：小檗碱桥酶1，金黄紫堇碱9位氧甲基转移酶，四氢小檗碱氧化酶，细胞色素p450氧化还原酶或细胞色素p450氧化还原酶2。
12.在另一可选例中，(c)中还包括：四氢原小檗碱氧化酶(stox)。
13.在另一优选例中，所述小檗碱桥酶1为截短体，其氨基酸序列的n端10～30个(如12、15、18、20、25个)氨基酸残基被删除。
14.在另一优选例中，所述酪氨酸羟化酶为突变体，其第37位突变为glu，第38位突变为glu，第166位突变为tyr。
15.在另一优选例中，所述去甲乌药碱合酶2为截短体，其氨基酸序列的n端5～20个(如6、8、11、13、15、18个)氨基酸残基被删除。
16.在另一优选例中，所述四氢原小檗碱氧化酶为截短体，其氨基酸序列的n端3～25个(如3、6、11、15、18、24个)氨基酸残基被删除。
17.在另一优选例中，细胞色素p450氧化还原酶或细胞色素p450氧化还原酶2两者中，选用细胞色素p450氧化还原酶2。
18.在另一优选例中，(a)中，酪氨酸羟化酶来自鼠，4α-羟基四氢喋呤脱水酶来自鼠，或二氢喋呤还原酶来自鼠。
19.在另一优选例中，(b)中，多巴脱羧酶来自恶臭假单胞菌，单胺氧化酶来自藤黄微球菌，去甲乌药碱合酶2来自日本黄连，去甲乌药碱6位氧甲基转移酶来自罂粟，乌药碱氮甲基转移酶来自罂粟，或3’羟基氮甲基乌药碱4位氧甲基转移酶来自日本黄连。
20.在另一优选例中，(c)中，小檗碱桥酶1来自罂粟，金黄紫堇碱9位氧甲基转移酶来自日本黄连，四氢小檗碱氧化酶来自日本黄连，细胞色素p450氧化还原酶2来自拟南芥，细胞色素p450氧化还原酶来自罂粟，或四氢原小檗碱氧化酶来自金花小檗。
21.在另一优选例中，(a)中，所述酪氨酸羟化酶及用于从4α-羟基四氢单喋呤生成四氢单喋呤的酶的编码基因操作性连接于一个构建体后引入细胞，较佳地构建体以pacyc为基础。
22.在另一优选例中，(b)中，用于从左旋多巴合成去甲劳丹碱的酶的编码基因及用于从去甲劳丹碱合成网状番荔枝碱的酶的编码基因操作性连接于同一构建体后引入细胞，较佳地构建体以pet21a为基础；或用于从左旋多巴合成去甲劳丹碱的酶的编码基因操作性连接于一个构建体、用于从去甲劳丹碱合成网状番荔枝碱的酶的编码基因操作性连接于另一构建体后共同引入细胞；较佳地所述构建体以phj352或pet21a为基础。
23.在另一优选例中，(c)中，所述用于从网状番荔枝碱合成四氢小檗碱或小檗碱的酶的编码基因操作性连接于同一构建体后引入细胞，较佳地构建体以含有his标签的载体为基础，更佳地以pet28a或pacyc-duet为基础。
24.在另一优选例中，所述构建体中，以t7启动子或t7终止子进行表达的调控。
25.在另一优选例中，所述重组原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌；更佳地，所
述重组原核细胞为大肠杆菌。
26.在另一优选例中，该细胞中还包括上游合成l-酪氨酸的途径；较佳地，包括：由葡萄糖或甘油，通过糖酵解、磷酸戊糖途径、莽草酸途径生成l-酪氨酸。
27.在另一优选例中，该细胞培养时，在培养基中添加外源的l-酪氨酸。
28.在另一优选例中，所述的酶的编码基因表达时，其表达基因操作性连接于同一表达盒中、由一启动子驱动表达；或表达基因分别连接各自的启动子构成表达盒、操作性连接于构建体中。
29.在另一优选例中，所述合成l-酪氨酸的途径为大肠杆菌内源途径，或者在其内源途径基础上经人工改造后加强l-酪氨酸合成的途径。
30.在另一优选例中，所述的酶的编码基因可以是经原核细胞如大肠杆菌密码子优化的基因。
31.在本发明的另一方面，提供所述的重组原核细胞的用途，用于生产四氢小檗碱或小檗碱；较佳地，用于将l-酪氨酸或其上游底物(如葡萄糖、莽草酸途径产物)转化为四氢小檗碱或小檗碱。
32.在本发明的另一方面，提供一种生产四氢小檗碱或小檗碱的方法，所述方法包括：(1)提供前面任一所述的重组原核细胞；和，(2)培养(1)的重组原核细胞，从而生产四氢小檗碱或小檗碱。
33.在一个优选例中，(2)中，所述细胞在添加l-酪氨酸或合成l-酪氨酸上游底物的体系中培养；较佳地，所述合成l-酪氨酸上游底物包括：葡萄糖，甘油。
34.在另一优选例中，所述的重组原核细胞以甘油为碳源进行生产。
35.在另一优选例中，所述重组原核细胞的发酵时间为1～20天，较佳地2～15天，更佳地2.5～10天(如3、4、5、6、7、8、9天)。
36.在另一优选例中，所述l-酪氨酸在培养体系中的浓度为：0.05～50g/l，较佳地0.1～40g/l，更佳地0.2～20g/l。所述培养体系中的浓度例如0.3g/l，0.5g/l，0.8g/l，1g/l，1.2g/l，1.5g/l，2g/l，3g/l，5g/l，10g/l，15g/l，30g/l等。
37.在另一优选例中，所述方法还包括：从反应产物中分离氢化小檗碱或小檗碱。
38.在本发明的另一方面，提供一种用于生产四氢小檗碱或小檗碱的试剂盒，其中包括前面任一所述的重组原核细胞。
39.在本发明的另一方面，提供一种用于生产四氢小檗碱或小檗碱的试剂盒，其中包括下组的表达构建体：
40.构建体1，包括操作性连接的酪氨酸羟化酶及用于从4α-羟基四氢单喋呤生成四氢单喋呤的酶的编码基因；较佳地包括：酪氨酸羟化酶、4α-羟基四氢喋呤脱水酶、二氢喋呤还原酶的编码基因；较佳地，其以pacyc为基础；
41.构建体2，包括从左旋多巴合成去甲劳丹碱的酶及用于从去甲劳丹碱合成网状番荔枝碱的酶的编码基因；较佳地包括多巴脱羧酶、单胺氧化酶、去甲乌药碱合酶2、去甲乌药碱6位氧甲基转移酶、乌药碱氮甲基转移酶、3’羟基氮甲基乌药碱4位氧甲基转移酶的编码基因；较佳地所述构建体以pet21a为基础；
42.构建体3，包括从网状番荔枝碱合成四氢小檗碱或小檗碱的酶的编码基因；较佳地包括小檗碱桥酶1、金黄紫堇碱9位氧甲基转移酶、四氢小檗碱氧化酶、细胞色素p450氧化还
原酶或细胞色素p450氧化还原酶2；可选地还包括四氢原小檗碱氧化酶的编码基因；较佳地所述构建体以pet28a或pacyc-duet为基础。
43.在另一优选例中，所述构建体中，以t7启动子或t7终止子进行表达的调控。
44.在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：原核细胞或细胞培养物；较佳地，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌；更佳地，所述原核细胞为大肠杆菌。
45.在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：l-酪氨酸或能生成l-酪氨酸的上游底物。
46.在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：表达诱导剂。
47.在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：基础培养基。
48.在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于生产四氢小檗碱或小檗碱。
49.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
50.图1显示了参与小檗碱合成的质粒的构建。
51.图2显示了基于液相色谱检测绘制的网状番荔枝碱及下游代谢物的标准曲线。
52.图3显示了大肠杆菌中小檗碱的合成代谢途径。
53.图4显示了网状番荔枝碱合成相关酶的sds-page凝胶及westernblot图谱。
54.图5显示了对小檗碱桥酶bbe的工程化改造。
55.图6显示了小檗碱下游生物合成途径酶的sds-page凝胶及westernblot图谱。
56.图7显示了基于质谱检测对工程菌发酵液成分的定性分析结果。
57.图8显示了基于质谱检测绘制的四氢小檗碱及小檗碱的标准曲线。
58.图9显示了工程菌sqz07发酵生产网状番荔枝碱的产量(mg/l)。
59.图10显示了工程菌sqz09发酵液成分的色谱检测结果。
60.图11显示了产小檗碱工程菌发酵液成分的质谱检测结果。
具体实施方式
61.本发明人经过深入的研究，通过基因重组技术建立了用于发酵生产小檗碱类化合物的原核宿主细胞，首次实现了以原核生物为底盘合成小檗碱类化合物。本发明建立的表达体系代谢背景低、异源表达能力强、成本低，为工业化生产小檗碱类化合物提供了新的途径。
62.术语
63.如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
64.如本文所用，所述的“表达盒”或“基因表达盒”是指包含有表达目的多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。
65.如本文所用，所述的“表达构建物”或“表达构建体”是指重组dna分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的“构建物”通常被包含在表达载体中。
66.如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质(多肽)序列之间的关系，或者来自不同来源的核酸或蛋白质与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸/蛋白质与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
67.如本文所用，所述的小檗碱也包括小檗碱类化合物。所述的“小檗碱类化合物”也可以是在本发明披露的化合物小檗碱基础上的变化形式，包括其前体如四氢小檗碱，或其衍生物。例如，化合物的母核结构保持不变，但在个别(如1-3个，1-2个)位置上发生基团(如含有1-4个碳原子(较佳地1-2个碳原子)的脂族烃类基团)的取代。
68.酶组合及其表达系统
69.本发明的技术方案的主要原理为：在工程菌中通过整合：酪氨酸羟化酶和辅酶四氢单喋呤循环再生模块、网状番荔枝碱合成模块以及小檗碱合成模块，生产小檗碱类化合物。小檗碱的合成途径如图3所示。在优选的方式中，本发明人优化了一些酶以及工艺，从而使得该三大模块在宿主内良好兼容、配合和工作。
70.作为本发明人建立的三大模块之一，所述的酪氨酸羟化酶和辅酶四氢单喋呤循环再生模块用于从l-酪氨酸生成左旋多巴，其包括：酪氨酸羟化酶(tyrh)；及，用于从4α-羟基四氢单喋呤生成四氢单喋呤的酶，较佳地包括：4α-羟基四氢喋呤脱水酶(pcbd1)，二氢喋呤还原酶(qdhpr)。
71.作为本发明人建立的三大模块之二，所述的网状番荔枝碱合成模块用于从左旋多巴生成网状番荔枝碱，其包括：用于从左旋多巴合成去甲劳丹碱的酶：多巴脱羧酶(dodc)，单胺氧化酶(mao)，去甲乌药碱合酶2(ncs)；及，用于从去甲劳丹碱合成网状番荔枝碱的酶：去甲乌药碱6位氧甲基转移酶(6omt)，乌药碱氮甲基转移酶(cnmt)，3’羟基氮甲基乌药碱4位氧甲基转移酶(4’omt)。
72.作为本发明人建立的三大模块之三，所述的小檗碱合成模块用于从网状番荔枝碱生成小檗碱，其包括：用于从网状番荔枝碱合成小檗碱的酶：小檗碱桥酶1(bbe)，金黄紫堇碱9位氧甲基转移酶(9’omt)，四氢小檗碱氧化酶(cas)，细胞色素p450氧化还原酶(cpr)或细胞色素p450氧化还原酶2(cpr2)。
73.所述小檗碱合成模块中，在生成氢化小檗碱后，可以内源性地基于氢化小檗碱自身的氧化还原特性来形成小檗碱；也可以进一步地引入促进氢化小檗碱形成小檗碱的酶，为四氢原小檗碱氧化酶。因此，作为本发明的可选方式，在所述的小檗碱合成模块中，还可包括四氢原小檗碱氧化酶(stox)。
74.本发明人在研究中发现，虽然大肠杆菌中能够实现网状番荔枝碱的合成，但是由于细胞色素p450氧化酶和黄素蛋白氧化酶在原核生物中存在显著的表达障碍，这严重阻碍了在大肠杆菌中实现小檗碱的合成。在此基础上，本发明人优化选择了于细胞色素p450氧化酶，以及对黄素蛋白氧化酶进行了优化改造。
75.因此，在本发明的优选方式中，所述黄素蛋白氧化酶为小檗碱桥酶1，其为截短体，其氨基酸序列的n端至少10～30个(如12、15、18、20、25个)氨基酸残基被删除。在本发明的
优选方式中，选用细胞色素p450氧化还原酶2进行反应。
76.在本发明的优选方式中，其它的一些酶也进行了优化，包括但不限于：所述酪氨酸羟化酶为突变体，其第37位突变为glu，第38位突变为glu，第166位突变为tyr；所述去甲乌药碱合酶2为截短体，其氨基酸序列的n端5～20个氨基酸残基被删除，所述四氢原小檗碱氧化酶为截短体，其氨基酸序列的n端3～25个氨基酸残基被删除。
77.本发明中，通过在工程细胞(工程菌)中转化入上述一系列的模块来实现小檗碱类化合物在工程菌中的高效生产。
78.编码本发明所述的酶的基因可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植物或微生物。此外，所述的基因也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来获得所述的基因，或者通过人工合成的方法来获得所述的基因。
79.本发明所述的酶或其编码核酸的序列信息可以是与本发明实施例表1～表3中所提供的序列信息相同，也可以是它们的变异体或简并序列。“简并的序列”在本发明中是指编码具有同功能的蛋白质，但与发明实施例表2中所提供的序列信息有差别的核酸序列。本发明中可以运用编码所述酶的天然序列，也可以运用进行密码子优化后的序列。所述酶的编码核酸可以包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
80.本发明还涉及所述酶的变体，与其相应的野生型多肽在氨基酸序列上不同，是野生型多肽的单位点或多位点变体、片段、类似物或衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
81.应理解的是，利用一些本领域公知的密码子优化方法、蛋白变体筛选方法、酶活性促进方法等进行优化、并建立优化的工程菌，还可以进一步地提高小檗碱类化合物的产量。这些在本发明的方案基础上的进一步优化技术，也应被涵盖在本发明的技术方案中。
82.在本发明的优选方式中，酪氨酸羟化酶来自鼠，4α-羟基四氢喋呤脱水酶来自鼠，或二氢喋呤还原酶来自鼠；多巴脱羧酶来自恶臭假单胞菌，单胺氧化酶来自藤黄微球菌，去甲乌药碱合酶2来自日本黄连，去甲乌药碱6位氧甲基转移酶来自罂粟，乌药碱氮甲基转移酶来自罂粟，3’羟基氮甲基乌药碱4位氧甲基转移酶来自日本黄连；或小檗碱桥酶1来自罂粟，金黄紫堇碱9位氧甲基转移酶来自日本黄连，四氢小檗碱氧化酶来自日本黄连，细胞色素p450氧化还原酶2来自拟南芥，细胞色素p450氧化还原酶来自罂粟，或四氢原小檗碱氧化酶来自金花小檗。本发明也可包括运用来自其它微生物、动物或植物的此类酶，只要它们与本发明实施例列举的酶高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如blast。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。但是应理解的是，本发明中为了克服技术缺陷所特定优化的相应酶的相应序列位置则应是保守的，例如小檗碱桥酶1选用其截短体。
83.本发明的各酶的编码核酸的全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，扩增而得有关序列。当序列较长时，可以进行两次或多次pcr扩
增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
84.本发明也涉及包含所述的编码核酸的载体，以及用所述的载体经基因工程产生的宿主细胞。
85.本发明中，各酶的编码核酸的序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
86.各酶的编码核酸的序列可以分别插入到重组表达载体中，多个重组表达载体共转宿主细胞；多个基因的表达盒也可以以串联的方式插入到同一重组表达载体中，转入宿主细胞。所述的重组表达载体还可包含与所述基因的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。应理解，在本领域人员了解了本发明的技术内容后，可以方便地构建重组表达载体。获得的重组表达载体也包含在本发明中。
87.表达调控序列或表达盒中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及化合物生产，有利于工业化应用。
88.作为本发明的优选方式，提供了一种表达盒或重组构建物(如表达载体)，其中包括本发明所述的三大模块及其相应的酶。
89.表达载体(表达构建物)的建立可以采用本领域技术人员熟悉的技术。在得知了所需选择的酶以及所需表达的细胞体系之后，本领域技术人员可以进行表达构建物的建立。基因序列可以被插入到不同的表达构建物(如表达载体)中，也可以被插入到同一表达构建物中，只要在转入到细胞后其编码的多肽能够被有效地表达和发挥活性即可。
90.包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本发明中，所述的宿主细胞可包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌或链霉菌，或所述真核细胞包括真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在更为优选的方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌，例如是大肠杆菌bl21(de3)。
91.用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可以用常规方法培养，培养中所用的培养基可以是本领域熟知的培养基，在适于细胞生长的条件下进行培养。在优选的方式中，所述的细胞的培养基中含有反应前体l-酪氨酸。
92.本发明也提供了用于生物合成小檗碱类化合物的试剂盒，其中包括：本发明所构建的重组细胞(工程菌)。或者，其中包括：本发明所构建的表达盒或重组构建物，这种情况下，较佳地还在试剂盒中包含宿主细胞，从而便于本领域技术人员进行操作。
93.在更优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括说明进行生物合成的方法的使用说明书。
94.本发明通过基因重组技术获得的重组细胞具有代谢背景低、异源表达能力强、成本低，可通过相对简单的步骤合成终产物且具备易分离等特征，将在很大程度上解决传统生物、化学方法合成存在的问题，为工业化生产小檗碱类药物提供新途径。
95.本发明中构建的重组工程菌，其与各个被外源引入的酶具有良好的适配性、兼容性，表达活性和催化活性良好，具有开发应用潜力。应理解，在本发明的基础上对酶结构或功能进行进一步改进后获得的技术方案，也应被包含在本发明中。
96.本领域中，以酿酒酵母为底盘，人们实现了以去甲劳丹碱为底物合成四氢小檗碱以及小檗碱，通过摇瓶培养，在12.5ml体系中，以1mm(约287mg/l)去甲劳丹碱为底物，合成四氢小檗碱1.8mg/l，同时能检测到6.5μg/l自发形成的小檗碱。但在实际生产过程中，以去甲劳丹碱为底物的成本相对较高，且由于邻苯二酚基团的存在，去甲劳丹碱很容易在发酵液的碱性环境中氧化。而本发明以酪氨酸为底物，可以大大降低成本且相对稳定。在本发明的小规模发酵验证中已经表明，通过10ml发酵体系，以500mg/l的酪氨酸为底物，经摇瓶发酵，获得5.36mg/l的四氢小檗碱，获得小檗碱0.59mg/l，明显优于酵母中合成的四氢小檗碱及小檗碱的产量，且本发明利用的是大肠杆菌底盘，在原核生物中合成四氢小檗碱及小檗碱的进展尚属首次。
97.合成小檗碱的方法
98.基于本发明人的新发现，本发明公开一种利用微生物异源合成小檗碱的方法。所述方法包括：培养本发明前述构建的重组细胞，使之生产小檗碱。本发明的技术方案中，小檗碱类化合物的合成途径可参考图3所示。
99.本发明所述的合成途径中，以l-酪氨酸作为反应前体，所述l-酪氨酸在培养体系中的浓度为：0.05～50g/l，较佳地0.1～40g/l，更佳地0.2～20g/l。根据发酵规模的不同，以及发酵条件的不同，本领域技术人员还可对该前体的用量进行适当的调整，这也被包含在本发明中。
100.此外，在原核细胞中，还包括l-酪氨酸的上游生成途径，例如包括：由葡萄糖或甘油通过糖酵解、磷酸戊糖途径、莽草酸途径生成l酪氨酸。应理解，基于此类途径来形成l-酪氨酸的方案也包含在本发明中。通过本领域已知手段来加强所述形成l-酪氨酸途径的方法可包含在本发明中。
101.在建立菌株以及进行表达的基础上，本领域人员还可系统研提高小檗碱产量的一系列因素，包括基因的效率和适宜性、基因剂量和培养基。此外，也可通过扩大生产规模来提高小檗碱的产量。例如，在摇瓶规模、简单培养条件下的产量基础上，当进一步扩大生产规模、进行培养基流加方案(可以源源不断提供充沛的底物)或给予良好的发酵罐水平生产条件(如温度的优化控制、溶氧的优化控制等)时，其产量通常可增加2～1000倍。这些操作和优化方式也应被包含在本发明中。可以预期，本发明的重组原核细胞，在一些优化的设备和操作工艺中，目标产物的量会发生长足的增长。
102.在本发明的另一种优选方式中，以甘油作为碳源；更优选地以按照体积1.5～4％、更特别地约2％的甘油浓度进行工程菌的培养。发酵所用的基础培养基可以是商用的培养基，例如但不限于：m9y培养基、m9培养基、tb培养基、或lb培养基等。
103.在获得了发酵产物后，从发酵产物中提取小檗碱可以采用本发明已知的技术。可以采用一些公知技术如高效液相色谱来对产物进行分析鉴定，以确定获得了所需的化合物。
104.本发明的主要优点在于：
105.本发明首次运用原核细胞、特别是大肠杆菌生产小檗碱类化合物，不仅解决了植物提取小檗碱类化合物消耗大量植物原材料、受季节地域因素限制以及提取效率低等问题；也避免了化学合成法中副产物多、目标产物活性低、环境污染大等不利因素。尽管本发明运用了原核细胞，但避免了酶异源表达于原核细胞时活性不高的问题，特别适合于小檗
碱类化合物的规模化合成，为工业生产此类化合物开辟了新途径。
106.本发明首次巧妙地利用了原核宿主、特别是大肠杆菌内源的辅酶替代四氢生物喋呤，同时借助外源的辅酶再生系统，实现了酪氨酸羟化酶的活性表达。
107.尽管在研究之初，本发明人未能成功利用原核宿主生产小檗碱，但是本发明人深入研究后找到了原因，通过改造小檗碱合成模块的第一个酶，建立其截短体，从而克服了无法表达的问题。
108.本发明可以从低成本的底物中生产小檗碱类化合物，克服了现有技术中成本高，污染环境，产物不单一的缺点，提供了一种低成本、环保、产物单一的小檗碱生产方法。
109.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
110.材料和方法
111.1、本发明所涉及的菌株及质粒
112.escherichia coli dh10b作为克隆宿主用于质粒构建过程，escherichia coli bl21(de3)作为表达宿主用于检测单个基因质粒的表达，以及作为发酵的原始菌株：多个模块质粒的共同转化检测发酵产物。载体骨架选择，3种不同的抗性，分别是抗氨苄霉素的质粒pet21a，抗卡那霉素的质粒pet28a，抗氯霉素的质粒pacyc-duet，抗阿布拉霉素的质粒来自本实验室的改造质粒phj352。
113.phj352质粒的建立：以pjf25(将常规的pet21c质粒的氨苄青霉素抗性基因由阿布拉霉素抗性基因替换而形成)为模板，hj335-vf/r为引物，pcr得到剔除复制子的3.1kb片段。以pacyc184为模板，hj335-inf/r为引物，pcr得到包含p15a复制子的1.1kb片段。两个片段通过无缝拼接试剂盒连接，构建质粒。
114.hj335-vf：gccaatcgactggcgagc(seq id no:1)；
115.hj335-vr：tcactgcccgctttccag(seq id no:2)；
116.hj352-inf：gaaagcgggcagtgagtttttgaggtgctccag(seq id no:3)；
117.hj352-inr：cgccagtcgattggcagctcactcattaggcac(seq id no:4)。
118.2、酶的选择
119.(1)网状番荔枝碱合成相关的酶基因
120.催化左旋酪氨酸羟基化生成左旋多巴(l-dopa)的酶，最初选择使用茄科雷尔氏菌来源的酪氨酸酶，tyrosinase of ralstonia solanacearum(tyr，genbank accession number:al646052)。由于该酶容易氧化含有邻苯二酚基团的化合物，比如途径下游的l-dopa、多巴胺(dopamine)、3,4-二羟基苯乙醛(3,4-dhpaa)等生成酚类化合物，影响下游代谢物的积累。因此，在进行小檗碱的合成时，选择褐家鼠来源的酪氨酸羟化酶，rattus norvegicus tyrosine hydroxylase(tyrh，uniprotkb:p04177)，并对三个位点(r37e，r38e，w166y)的氨基酸突变(mu)解除反馈抑制，提高酪氨酸羟化酶的活性。然而哺乳动物中的酪氨酸羟化酶发挥活性往往需要辅酶四氢生物喋呤(bh 4)的参与，由于大肠杆菌内源的辅酶四氢单喋呤(mh4)也可以实现相同的效果，因此本发明人只在大肠杆菌中引入mh4的再生途径。mh4在酪氨酸羟基化的过程中形成4α-羟基四氢单喋呤，随后鼠源4α-羟基四氢喋呤
脱水酶，rattus norvegicus pterin-4alpha-carbinolamine dehydratase 1(pcbd1，ncbi accession：np_001007602)，催化4α-羟基四氢单喋呤脱水生成二氢单喋呤。之后使用鼠源的二氢喋呤还原酶，rattus norvegicus quinoid dihydropteridine reductase(qdhpr，uniprotkb:p11348)，催化二氢单喋呤生成四氢单喋呤。经以上酶的参与，实现酪氨酸的羟基化及辅酶再生。
121.催化l-dopa脱羧生成多巴胺(dopamine)的酶，选择恶臭假单胞菌来源的多巴脱羧酶，dopa decarboxylase from pseudomonas putida kt2440(dodc，genbank登录号bk006920.1)。催化多巴胺生成3,4-二羟基苯乙醛(3,4-dhpaa)的酶，选择藤黄微球菌来源的单胺氧化酶，monoamine oxidase of micrococcus luteus(mao，uniprotkb:c5cb11)。至此，左旋酪氨酸可以催化形成网状番荔枝碱合成的两个前体，多巴胺和3,4-dhpaa。
122.催化多巴胺和3,4-二羟基苯乙醛缩合生成去甲劳丹碱的去甲乌药碱合酶2，来自日本黄连，norcoclaurine synthase 2of cjpr10a from coptis japonica(ncs，uniprotkb:a2a1a1)。催化去甲劳丹碱生成3’羟基乌药碱的酶，选择来自罂粟的去甲乌药碱6位氧甲基转移酶，norcoclaurine 6-o-methyltransferase of papaver somniferum(6omt，uniprotkb:q6wuc1)。催化3’羟基乌药碱生成3’羟基氮甲基乌药碱的酶，选择来自罂粟的乌药碱氮甲基转移酶，coclaurine n-methyltransferase of papaver somniferum(cnmt，uniprotkb:q7xb08)。催化3’羟基氮甲基乌药碱生成网状番荔枝碱的酶，选择来源日本黄连的3’羟基氮甲基乌药碱4位氧甲基转移酶，3
’-
hydroxy-n-methylcoclaurine-4
’-
o-methyltransferase of coptis japonica(4’omt，uniprotkb:q9lel5)。至此，大肠杆菌中以酪氨酸为底物，在以上酶的参与下，可以经发酵获得网状番荔枝碱。实施例所用的酶及其来源总结如表1～表2。
123.表1、酪氨酸羟化酶和mh4循环模块酶
[0124][0125]
表2、网状番荔枝碱合成模块酶
[0126][0127]
(2)小檗碱合成相关的酶基因
[0128]
催化网状番荔枝碱生成金黄紫堇碱的酶，选择罂粟来源的小檗碱桥酶1，网状番荔枝碱oxidase:bbe1 of papaver somniferum(bbe，genbank:af025430)。
[0129]
催化金黄紫堇碱生成四氢非洲防己碱的酶，选择日本黄连来源金黄紫堇碱9位氧甲基转移酶，(s)-scoulerine 9-o-methyltransferase of coptis japonica(9’omt，genbank:d29809)。
[0130]
催化四氢非洲防己碱生成四氢小檗碱的酶，选择日本黄连的四氢小檗碱氧化酶，canadine synthase(cyp719a1)of coptis japonica(cas，genbank:ab026122)。
[0131]
还原氧化态的细胞色素p450的酶，选择拟南芥的细胞色素p450氧化还原酶2或者罂粟来源的细胞色素p450氧化还原酶，arabidopsis thaliana p450 reductase 2(atcpr2，ncbi:nm_179141.2)，papaver somniferum nadph:ferrihemoprotein oxidoreductase(pscpr，genbank:u67185.1)。
[0132]
利用上述酶基因，催化网状番荔枝碱生成最终的产物小檗碱。实施例所用的酶及其来源总结如表3。
[0133]
表3、小檗碱合成模块酶
[0134][0135]
3、质粒的构建
[0136]
构建含单个基因的质粒：首先在合成的基因氮端增加ndei酶切位点，碳端增加spei和bamhi位点，载体骨架选择pet21a，质粒和基因经过ndei和bamhi酶切后连接。在质粒构建的前期，本发明人起初将全部基因均构建于pet21a载体，随后经聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色的结果判断基因的表达情况。然而，本发明人发现，对某些难表达或者表达量低的蛋白，普通的染色难以看出基因是否表达，经过对一些候选载体的分析比较后，本发明人将一些基因的载体更换为含有his标签的载体如pet28a或pacyc-duet载体，通过免疫印迹实验，用抗体与含组氨酸标签的蛋白杂交，判断蛋白是否表达。
[0137]
在建立含多个基因串联的质粒时，利用biobrick的方式串联基因，基于bglii和bamhi的同尾酶组合进行串联，构建成每个基因前均有t7启动子的质粒，去甲劳丹碱模块pqz21和甲基转移酶模块pqz16。之后利用spei和xhoi的同尾酶组合，串联基因，构建为操纵子模式的质粒：去甲劳丹碱模块pqz23和甲基转移酶模块pqz22。小檗碱合成模块参与的基因，均为操纵子模式，利用spei和xhoi的同尾酶组合构建。质粒详细信息见表4～表5；其中质粒构建方式见图1。
[0138]
表4、用于蛋白表达的含单个基因的质粒信息
[0139]
[0140][0141]
表5、实施例中涉及的质粒
[0142][0143]
表中，“opt”为经大肠杆菌偏好密码子优化的序列；“trun”表示截短；“mu”为“突变”的简称。
[0144]
4、蛋白表达与western blot检测
[0145]
含单基因的表达载体转化bl21(de3)，37℃培养12h后，从平板上挑取单克隆于2ml lb抗性培养基中，37℃，250rpm摇菌10h作为种子液。种子液2％接种于10ml lb抗性培养基中，37℃，250rpm至od
600
＝0.6，充分降温后用0.1mm iptg诱导，22℃，250rpm，振荡培养16-20h。
[0146]
对含有网状番荔枝碱合成上游基因的大肠杆菌发酵液，取1ml收菌后加1ml buffera(20mm tris-hcl(ph 8.0)，100mm nacl)重悬混匀。
[0147]
对含有网状番荔枝碱合成下游基因的大肠杆菌发酵液，10ml菌液全部收菌后加
1ml buffera重悬混匀，现加1％100mm pmsf(蛋白酶抑制剂)混匀后冰上放置30min，超声2-3次，5s/次，取样50μl，暂放冰上，记为全细胞样品。
[0148]
超声碎菌后的样品，12000rpm，10min，4℃离心，取上清80μl冰上放置，记为可溶性蛋白样品。可溶性样品中加20μl的5
×
sds上样缓冲液混匀，全细胞样品中加50μl的5
×
sds上样缓冲液混匀后，沸水煮10min，12000rpm，3min离心，上样marker：5μl，全细胞样品5μl，上清样品10μl。电泳100v，20min；160v，60min后，考马斯亮蓝染色或者westernblot检测基因的表达情况。
[0149]
5、大肠杆菌发酵生产小檗碱
[0150]
发酵菌株的准备：构建好的质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，37℃倒置培养12h后挑阳性克隆于2ml lb抗性的培养基中，37℃，250rpm培养10h制备发酵种子菌，发酵工程菌的详细信息见表6。
[0151]
表6、本发明中涉及的菌株
[0152][0153]
种子液5％转接至10ml含2％甘油的tb(terrificbroth)培养基中(培养基中先加入相应的抗生素，0.1mm的iptg及0.5mg/ml的l-酪氨酸)，22℃，250rpm发酵5天，取样1ml，菌液超声破碎3次，等体积正丁醇混匀萃取两次，12000rpm，2min离心转移有机相至新管，室温或30℃旋转蒸干后，加100μl甲醇复溶(浓缩10倍)充分混匀，12000rpm，2min后转移上清uplc及uplc-qtof/ms检测。
[0154]
6、样品的检测分析
[0155]
uplc检测，色谱柱：c18(250
×
4.6mm，5μm)，检测条件：柱温30℃，流速1ml/min；uv 235&280nm。流动相组成为b：去离子水(0.1％甲酸)，c：乙腈(0.1％甲酸)，流动相梯度设置：0-10min，5-40％c；10-16min，40-65％c；16-16.1min，65-95％c；16.1-19.0min，95％c；19.0-19.1min，95-5％c；19.1-22.0min，5％c。发酵液上样量为10μl。标准曲线的绘制，配置500mg/l的标准品混合溶液，逐级稀释配成以下浓度：250mg/l，100mg/l，50mg/l，20mg/l，10mg/l，5mg/l，1mg/l，标准品上样2μl根据紫外吸收的峰面积与上样量关系绘制标准曲线。标准曲线如图2。
[0156]
lc-ms/ms检测，用于对发酵液中含量较低的化合物进行定性与定量分析。仪器agilent lc1260&1290-ms/qtof6545，色谱柱agilent infinitylab poroshell120ec-c18(3
×
150mm，2.7μm)，检测条件：柱温30℃，流速0.3ml/min，uv 235&280nm。流动相设置：a：(0.1％甲酸)水；b：(0.1％甲酸)乙腈，流动相梯度：5％b(0-0.8min)；5-98％b(0.8-12min)；98％b(12-15min)；98-5％b(15-15.5min)。上样量为1.2μl。其他参数设置：阳离子模式，离子源：gastemp＝300℃，流速：6l/min；压力：30psig；sheath gastemp＝320℃；流速：11l/min；压力：30psig。fragmentor:135v；skimmer:65v；oct1rfvpp:750v；vcap:3500v；nozzle voltage:1000v；scan(m/z):100-1100；2级质谱碰撞能量：0ev，10ev，20ev，40ev。
[0157]
实施例1、小檗碱合成相关基因的表达与优化
[0158]
大肠杆菌以l-酪氨酸为底物合成小檗碱的过程需要经过11步反应，如图3提供了大肠杆菌合成小檗碱的代谢途径示意图。整体反应过程大体上可以分为两个阶段，分别是网状番荔枝碱的合成阶段和下游产物小檗碱等的合成阶段。
[0159]
本发明涉及的途径中存在3个甲基转移酶：4omt、6omt、cnmt，该三个酶的编码基因大小约1000bp，表达产物约40kda，大小接近，若在串联质粒上从发酵液中直接检测蛋白表达，不容易判断是否全部均表达；同样地dodc和mao的表达如此；因此本发明人进行单个基因的质粒构建来进行基因表达分析。
[0160]
本发明人首先使用大肠杆菌中从头合成网状番荔枝碱的工作，合成涉及的基因。将合成的基因分别构建于pet21a载体，以t7为启动子，对于酪氨酸羟化酶和辅酶再生途径的基因，用pet28a或pacyc-duet载体，通过n端his-tag标签检测蛋白表达。在相同的培养条件下，参与网状番荔枝碱合成的基因全部表达，结果见图4。
[0161]
之后，本发明人对下游途径中的蛋白逐一表达，各蛋白的编码基因一一引入到pet28a中表达。本发明人发现，除bbe外，其它蛋白的编码基因均表达。同时结合实验现象，本发明人发现，全长的bbe蛋白对细胞有毒性，抑制菌体生长且蛋白表达量相对而言很低。
[0162]
因此，本发明人决定对bbe进行工程化的改造。具体的工程化策略如下：首先进行氨基酸结构分析，发现bbe基因的氮端有疏水信号肽区域。随后结合酿酒酵母中bbe的截短策略，对其进行n端25个氨基酸的截短。截短的bbe基因在相同的培养条件下诱导表达，能看到明显的条带，说明bbe的截短能显著提高蛋白的表达，结果见图5。
[0163]
bbe优化后，通过组氨酸标签抗体，检测诱导后菌体中的氮端含有组氨酸标签的蛋白表达情况，虽然表达量差别较大，但全部基因均在大肠杆菌中表达，结果见图6。同bbe类似，对stox蛋白n端进行的工程化改造(截短n端3个氨基酸)，改造后蛋白表达量相对改造前有显著提升，蛋白表达结果见图4。
[0164]
实施例2、基因串联与发酵工程菌检测代谢物
[0165]
在确定全部基因能够在大肠杆菌中表达后，对这些基因进行模块化的串联组装，首先将酪氨酸到网状番荔枝碱的合成分为两个模块：去甲劳丹碱模块和甲基转移酶模块，将下游途径的基因全部串联构成第三个模块。
[0166]
由于在发酵液中部分四氢小檗碱会自发氧化形成小檗碱，因此产四氢小檗碱的菌株理论上能检测到小檗碱生成。菌株sqz05和sqz06为产四氢小檗碱的菌株，主要差别是使用的细胞色素p450还原酶不同，sqz05使用拟南芥来源的atcpr2，而sqz06使用罂粟来源的pscpr，两种工程菌发酵5天后，取发酵液处理后进行lc-ms/ms检测。通过提取目标化合物的分子量(eic)并与标准品的保留时间及碎片信息(参与小檗碱合成的中间代谢物的分子量及碎片信息整理于表7)的比对后确定sqz05和sqz06发酵液中均有四氢小檗碱和小檗碱生成。sqz05及sqz06发酵样品eic结果见图7。对标准品逐级稀释获得4种浓度的标准品溶液(0.016mg/l、0.08mg/l、0.4mg/l和2mg/l)，并根据标准品的浓度和响应峰面积绘制四氢小檗碱和小檗碱的标准曲线，见图8，来对发酵液中的产物进行定量分析(定量分析时标准浓度最高不超过3mg/l，若超过该浓度，lc-ms仪器的响应值达到临界范围，定量不准确)发现sqz05比sqz06生产四氢小檗碱的效果好，对sqz05发酵液中的四氢小檗碱定量为1.08mg/l，同时能够检测到0.14mg/l小檗碱，此后优选地以pqz64为四氢小檗碱生成模块质粒。
[0167]
表7、小檗碱合成相关化合物的分子量及碎片信息
[0168][0169]
实施例3、优化网状番荔枝碱合成模块提高四氢小檗碱产量
[0170]
网状番荔枝碱作为小檗碱合成的重要中间体，对于目标产物的合成具有重要的意义，要提高小檗碱产量首先需要考虑的就是提高网状番荔枝碱的产量。大肠杆菌中关于网状番荔枝碱合成模块中，通过使用酪氨酸羟化酶并引入四氢生物喋呤的合成模块，网状番荔枝碱的产量提高了4倍。然而，由于四氢生物喋呤合成模块参与的基因较多，且缺乏再生途径。本发明人考虑到，大肠杆菌可以使用自身的辅酶替代四氢生物喋呤，同时借助外源的辅酶再生系统，来实现酪氨酸羟化酶的活性表达。基于此，本发明人在菌株sqz02(含pqz22 pqz23)的基础上，剔除质粒pqz23中酪氨酸羟化酶(optrstyr)使pqz23转变为pqz89，同时引入质粒pqz79(酪氨酸羟化酶和辅酶再生模块)构成菌株sqz07(含pqz22 pqz79 pqz89)，发酵检测网状番荔枝碱的生成情况，如图9。本发明人发现，网状番荔枝碱的产量出乎意料地比sqz02提高了约10倍，达到11.14mg/l。
[0171]
在此基础上，本发明人将上游的两个模块(去甲劳丹碱模块和甲基转移酶模块)合
并构建质粒pqz90，与酪氨酸羟化酶及辅酶再生模块(pqz79)一同转化构建菌株sqz08，并比较sqz08和sqz07发酵生产网状番荔枝碱的差别，hplc检测发现sqz08和sqz07生产网状番荔枝碱的潜力相当。
[0172]
进一步可以在sqz08的基础上进行下游模块的引入，构建工程菌发酵检测下游代谢物。于是，本发明人通过将pqz64质粒引入到sqz08，获得sqz09。发酵结果显示，工程菌sqz09发酵生产四氢小檗碱5.36mg/l，生产小檗碱0.59mg/l。hplc结果见图10。
[0173]
在sqz09的基础上引入质粒pqz77，获得四氢小檗碱2.37mg/l，小檗碱0.41mg/l，lc-ms/ms检测结果见图11，增加四氢原小檗碱氧化酶后，四氢小檗碱和小檗碱的产量相对低于增加前(sqz09)，可见四氢原小檗碱氧化酶对于提高产量是非必需的。
[0174]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。