抗TIGIT抗体及双抗体和它们的应用的制作方法

抗tigit抗体及双抗体和它们的应用
技术领域
1.本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及一种抗tigit抗体或其抗原结合片段，抗tigit/抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，包含抗tigit抗体或其抗原结合片段或者抗tigit/抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及它们的应用。


背景技术：

2.tigit是脊髓灰质炎病毒受体结合蛋白家族成员之一，属于免疫球蛋白超家族亚型，由胞外的免疫球蛋白结构域(igv)、一个跨膜结构、胞内的基于酪氨酸抑制基序免疫受体(itim)和免疫球蛋白酪氨酸尾巴基序(itt)组成。tigit仅表达于淋巴细胞，高表达于效应cd4 t细胞与调节t细胞、cd4 囊泡辅助t细胞、效应cd8 t细胞以及nk细胞。免疫系统中tigit与cd226、cd96竞争结合pvr(cd155)，与cd226、cd112r竞争结合cd122。通过网络信号传导协调免疫系统，调节免疫激活和免疫抑制。研究表明tigit在肿瘤免疫抑制调节中起到重要的作用。tigit与其配体pvr、pvr2及pvr3(潜在配体)结合后通过三种不同的作用方式抑制免疫反应。第一种作用方式是通过tigit的信号传导，触发pvr快速磷酸化向抗原递呈细胞或者肿瘤细胞传递信号，tigit自身是通过胞内itim/itt结构域将其信号传递给淋巴细胞；第二种影响免疫反应的作用方式是通过抗原递呈细胞接收tigit信号后表达分泌il10、tgf-β等炎症因子抑制t细胞活性；第三种作用方式是通过与cd226竞争结合pvr干扰cd226的平衡来抑制t细胞的激活。抗tigit抗体可阻断其信号通路，解除肿瘤免疫抑制，提高效应t细胞、nk细胞细胞毒性，并能建立长期的抗肿瘤免疫记忆，达到治疗肿瘤的效果。
3.考虑到tigit在免疫检查点调节中的重要作用，本领域仍需要开发对tigit具有特异性的拮抗性抗体以单独或与其它试剂组合用于免疫疗法和癌症治疗。
4.pd-l1是一种大小为40kd的i型跨膜蛋白，在抑制免疫系统中起重要作用。pd-l1通过与pd-1和b7-1形成免疫复合物，负调控t细胞受体信号通路，进而引起t细胞激活受阻，抑制t细胞的抗肿瘤活性，其中pd-1作为pd-l1的受体，主要参与激活t细胞、b细胞、单核细胞和髓系细胞，cd80(b7-1)是一种t细胞共刺激分子。pd-l1的这种免疫调节作用主要发生在一些慢性疾病中，诸如异体移植、自身免疫性疾病和癌症等。pd-l1在许多肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞表面高表达，包括大多数实体瘤和血液淋巴瘤，例如骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤等。因此，pd-l1可以作为一个重要的肿瘤治疗靶标。目前，通过阻断pd-l1发挥抗肿瘤作用的单克隆抗体已经广泛应用于临床，并在多种肿瘤中展示出强大的抗肿瘤活性。
5.同一种疾病在体内往往是受不同的信号通路、不同的细胞因子以及不同的受体调节机制等控制。多个免疫检查点通路的联合阻断，可能是巧妙且必要的抗肿瘤免疫治疗策略。抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体可以通过阻断pd-1/pd-l1通路和tigit/cd155通路激活免疫应答，并将肿瘤细胞招募至淋巴细胞周围，进一步提高抗肿瘤活性。因此，开发抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体显得尤为必要。


技术实现要素：

6.本发明一方面提供一种抗tigit抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中所述重链可变区包含重链可变区的互补决定区1(h1cdr1)、重链可变区的互补决定区2(h1cdr2)和/或重链可变区的互补决定区3(h1cdr3)，所述轻链可变区包含轻链可变区的互补决定区1(l1cdr1)、轻链可变区的互补决定区2(l1cdr2)和/或轻链可变区的互补决定区3(l1cdr3)。
7.在一些实施方案中，本发明提供一种抗tigit抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
8.(1)所述重链可变区包含选自如下组的h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3：
9.(a1)如seq id no:25、26和27所示的氨基酸序列；
10.(a2)如seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列；和
11.(a3)与(a1)或(a2)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和
12.(2)所述轻链可变区包含选自如下组的l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3：
13.(a4)如seq id no:31、32和33所示的氨基酸序列；
14.(a5)如seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列；和
15.(a6)与(a4)或(a5)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
16.在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit抗体或其抗原结合片段，其具有所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3分别为seq id no:25、26和27或与seq id no:25、26和27所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3分别为seq id no:31、32和33或与seq id no:31、32和33所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
17.在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit抗体或其抗原结合片段，其具有所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3分别为seq id no:28、29和30或与seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3分别为seq id no:34、35和36或与seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
18.在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
19.在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段是鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段或人源化抗体或其抗原结合片段。
20.在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中
21.(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：
22.(b1)如seq id no:75、seq id no:76、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:88、seq id no:89、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:92所示的氨基酸序列；
23.(b2)(b1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
24.(b3)与(b1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
25.(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：
26.(b4)如seq id no:77、seq id no:78、seq id no:84、seq id no:85、seq id no:86、seq id no:87、seq id no:93、seq id no:94、seq id no:95、seq id no:96、seq id no:97所示的氨基酸序列；
27.(b5)(b4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
28.(b6)与(b4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
29.在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no:75，seq id no:75经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:75功能相同的氨基酸序列或与seq id no:75具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:77，seq id no:77经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:77功能相同的氨基酸序列或与seq id no:77具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
30.在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no:76，seq id no:76经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:76功能相同的氨基酸序列或与seq id no:76具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:78，seq id no:78经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:78功能相同的氨基酸序列或与seq id no:78具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
31.在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no:75，seq id no:75经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:75功能相同的氨基酸序列或与seq id no:75具有至少85％序列同一性且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:25、26和27所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:77，seq id no:77经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:77功能相同的氨基酸序列或与seq id no:77具有至少85％序列同一性且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:31、32和33所示的氨基酸序列。
32.在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no:76，seq id no:76经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:76功能相同的氨基酸序列或与seq id no:76具有至少85％序列同一性且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:78，seq id no:78经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:78功能相同的氨基酸序列或与seq id no:78具有至少85％序列同一性且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列。
33.在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit抗体为鼠源抗体，其还含有鼠源的igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3或其变体的重链恒定区，和鼠源的κ链或其变体的轻链恒定区。
34.在一些优选的实施方案中，根据本发明的抗tigit鼠源抗体还含有鼠源的igg1、
igg2a、igg2b、igg2c或其变体的重链恒定区，和鼠源κ链或其变体的轻链恒定区。
35.在一些具体的实施方案中，本发明提供抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段，其中：
36.(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：
37.(c1)如seq id no:98或seq id no:99所示的氨基酸序列；
38.(c2)(c1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
39.(c3)与(c1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
40.(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：
41.(c4)如seq id no:100或seq id no:101所示的氨基酸序列；
42.(c5)(c4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
43.(c6)与(c4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
44.在一些具体的实施方案中，本发明提供抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no:98，seq id no:98经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:98功能相同的氨基酸序列或与seq id no:98具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:100，seq id no:100经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:100功能相同的氨基酸序列或与seq id no:100具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
45.在一些具体的实施方案中，本发明提供抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no:99，seq id no:99经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:99功能相同的氨基酸序列或与seq id no:99具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:101，seq id no:101经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:101功能相同的氨基酸序列或与seq id no:101具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
46.在一些具体的实施方案中，本发明提供抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no:98，seq id no:98经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:98功能相同的氨基酸序列或与seq id no:98具有至少85％序列同一性且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:25、26和27所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:100，seq id no:100经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:100功能相同的氨基酸序列或与seq id no:100具有至少85％序列同一性且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:31、32和33所示的氨基酸序列。
47.在一些具体的实施方案中，本发明提供抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no:99，seq id no:99经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:99功能相同的氨基酸序列或与seq id no:99具有至少85％序列同一性且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:101，seq id no:101经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:101功能相同的氨基酸序列或与seq id no:
101具有至少85％序列同一性且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列。
48.在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源抗tigit抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，和/或进一步包含鼠源igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3或其变体的重链恒定区。
49.在本发明一个优选的实施方案中，所述的抗tigit嵌合抗体或其抗原结合片段的抗体轻链进一步包含鼠源κ、λ链或其突变序列的轻链恒定区。所述的抗tigit嵌合抗体或其抗原结合片段的抗体重链进一步包含鼠源igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3或其突变序列的重g链恒定区，优选包含人源igg1、igg2a、igg2b、igg2c重链恒定区，或者使用氨基酸突变后显著降低adcc(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的igg4恒定区。
50.在一些具体的实施方案中，本发明的抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段还包含人源igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3或其变体的重链恒定区，和人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。在一些优选的实施方案中，本发明的抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段还包含人源igg1、igg2a、igg2b、igg2c或其变体的重链恒定区，和人源κ链或其变体的轻链恒定区。
51.在一些实施方案中，本发明提供抗tigit抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段为fab、fv、sfv或f(ab)2。
52.本发明的另一方面提供一种分离的核酸，其编码根据本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段。
53.在一些具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其包含编码重链可变区氨基酸序列如seq id no:75、seq id no:76、seq id no:98或seq id no:99的核苷酸序列；和编码轻链可变区氨基酸序列如seq id no:77、seq id no:78、seq id no:100或seq id no:101的核苷酸序列。
54.在一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其包含编码重链可变区seq id no:75的核苷酸序列；和编码轻链可变区seq id no:77的核苷酸序列。
55.在一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其包含编码重链可变区seq id no:76的核苷酸序列；和编码轻链可变区seq id no:78的核苷酸序列。
56.在一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其包含编码重链可变区seq id no:98的核苷酸序列；和编码轻链可变区seq id no:100的核苷酸序列。
57.在一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其包含编码重链可变区seq id no:99的核苷酸序列；和编码轻链可变区seq id no:101的核苷酸序列。
58.本发明的另一方面提供一种表达载体，其表达本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段。根据本发明的表达载体其包含本发明的分离的核酸分子。
59.本发明的另一方面提供一种如上所述的表达载体转化的宿主细胞。
60.在一些实施方案中，根据本发明的宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。在一些实施方案中，所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌。在另一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。
61.本发明的另一方面提供制备本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段的方法，包括在所述宿主细胞中表达抗体以及从宿主细胞中分离所述抗体的步骤。
62.本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明的抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体。在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段，还包含其他活性组分，如其他抗体、靶向药物等。在一些实施方案中，所述药学可接受的载体选自抗氧化剂、多肽、蛋白质、亲水性聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、糖醇、离子和表面活性剂。在一个具体的实施方案中，所述药学可接受的载体为缓冲水溶液。在另一个具体的实施方案中，所述药学可接受的载体为脂质体的形式。
63.可以将本发明的抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于经口、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、脑内、眼内、气管内、皮下、鼻内途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。
64.本发明的另一方面提供抑制tigit活性的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物。
65.本发明的另一方面提供用于检测或测定人tigit的方法，所述方法包括使用本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段的步骤。
66.本发明的另一方面提供用于检测或测定人tigit的试剂，所述试剂包本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段。
67.本发明的另一方面提供一种治疗与tigit相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用药物有效量的本发明的tigit抗体或其抗原结合片段，或包含上述药物组合物，或上述分离的核酸分子。本发明的另一方面提供本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物在制备与tigit相关的疾病的药物中的应用。在一些实施方案中，所述与tigit相关的疾病的药物用于治疗t细胞功能障碍性病症，例如肿瘤、免疫性疾病或感染性病症。在一些实施方案中，所述肿瘤为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑素瘤、头和颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈样肉芽肿、梅克尔细胞癌、肾上腺皮质癌、肝脏肝细胞癌、胰管腺癌、嗜铬细胞瘤、神经节细胞瘤、子宫内膜癌和卵巢浆液性囊腺癌等。在一些实施方案中，所述免疫性疾病为关节炎、炎性肠病、银屑病。在一些实施方案中，所述感染性疾病为慢性病毒感染。
68.本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其包括抗tigit抗体或其抗原结合片段和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗tigit抗体或其抗原结合片段包含第一重链可变区和/或第一轻链可变区，其中所述第一重链可变区包含第一重链可变区的互补决定区1(h1cdr1)、第一重链可变区的互补决定区2(h1cdr2)和/或第一重链可变区的互补决定区3(h1cdr3)，所述第一轻链可变区包含第一轻链可变区的互补决定区1(l1cdr1)、第一轻链可变区的互补决定区2(l1cdr2)和/或第一轻链可变区的互补决定区3(l1cdr3)；和所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段为特异性结合pd-l1的抗体或其抗原结合片段。
69.在一些实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其包括抗tigit抗体或其抗原结合片段和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗tigit抗体或其抗原结合
no:75具有至少85％序列同一性的氨基酸序列且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:25、26和27所示的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:77，seq id no:77经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:77功能相同的氨基酸序列或与seq id no:77具有至少85％序列同一性的氨基酸序列且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:31、32和33所示的氨基酸序列；或
92.所述第一重链可变区的氨基酸序列为seq id no:76，seq id no:76经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:76功能相同的氨基酸序列或与seq id no:76具有至少85％序列同一性的氨基酸序列且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:78，seq id no:78经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:78功能相同的氨基酸序列或与seq id no:78具有至少85％序列同一性的氨基酸序列且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1抗体，所述抗tigit抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其抗原结合片段，其包含第一重链可变区和第一轻链可变区，其中：
93.(1)所述第一重链可变区的氨基酸序列选自：
94.(c1)如seq id no:98或seq id no:99所示的氨基酸序列；
95.(c2)(c1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
96.(c3)与(c1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
97.(2)所述第一轻链可变区的氨基酸序列选自：
98.(c4)如seq id no:100或seq id no:101所示的氨基酸序列；
99.(c5)(c4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
100.(c6)与(c4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
101.在一些实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1抗体，所述抗tigit抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其抗原结合片段，其包含第一重链可变区和第一轻链可变区，其中
102.所述第一重链可变区的氨基酸序列为seq id no:98，seq id no:98经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:98功能相同的氨基酸序列或与seq id no:98具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:100，seq id no:100经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:100功能相同的氨基酸序列或与seq id no:100具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；或
103.所述第一重链可变区的氨基酸序列为seq id no:99，seq id no:99经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:99功能相同的氨基酸序列或与seq id no:99具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:101，seq id no:101经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:101功能相同的氨基酸序列或与seq id no:101具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
104.在一些优选的实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其包括抗tigit抗体或其抗原结合片段和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗tigit抗体或
其抗原结合片段如以上实施方案中所限定；和所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区和/或第二轻链可变区，其中所述第二重链可变区包含第二重链可变区的互补决定区1(h2cdr1)、第二重链可变区的互补决定区2(h2cdr2)和/或第二重链可变区的互补决定区3(h2cdr3)，所述第二轻链可变区包含第二轻链可变区的互补决定区1(l2cdr1)、第二轻链可变区的互补决定区2(l2cdr2)和/或第二轻链可变区的互补决定区3(l2cdr3)。
105.进一步优选地，在一些实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其包括抗tigit抗体或其抗原结合片段和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗tigit抗体或其抗原结合片段如以上实施方案中所限定，和所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区和第二轻链可变区，其中：
106.(1)所述第二重链可变区包含选自如下组的h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3：
107.(a1)如seq id no:1、2和3所示的氨基酸序列；
108.(a2)如seq id no:4、5和6所示的氨基酸序列；
109.(a3)如seq id no:7、8和9所示的氨基酸序列；和
110.(a4)如seq id no:10、11和12所示的氨基酸序列；
111.(a5)与(a1)、(a2)、(a3)或(a4)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和
112.(2)所述第二轻链可变区包含选自如下组的l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3：
113.(a6)如seq id no:13、14和15所示的氨基酸序列；
114.(a7)如seq id no:16、17和18所示的氨基酸序列；
115.(a8)如seq id no:19、20和21所示的氨基酸序列；
116.(a9)如seq id no:22、23和24所示的氨基酸序列；
117.(a10)与(a6)、(a7)、(a8)或(a9)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
118.在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其包括抗tigit抗体或其抗原结合片段和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其中：
119.所述抗tigit抗体或其抗原结合片段包含第一重链可变区和第一轻链可变区，其中：
120.(1)所述第一重链可变区包含选自如下组的h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3：
121.(a1)如seq id no:25、26和27所示的氨基酸序列；
122.(a2)如seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列；和
123.(a3)与(a1)或(a2)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和
124.(2)所述第一轻链可变区包含选自如下组的l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3：
125.(a4)如seq id no:31、32和33所示的氨基酸序列；
126.(a5)如seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列；和
127.(a6)与(a4)或(a5)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和
128.所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区和第二轻链可变区，其中：
129.(1)所述第二重链可变区包含选自如下组的h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3：
130.(a1)如seq id no:1、2和3所示的氨基酸序列；
131.(a2)如seq id no:4、5和6所示的氨基酸序列；
132.(a3)如seq id no:7、8和9所示的氨基酸序列；和
133.(a4)如seq id no:10、11和12所示的氨基酸序列；
134.(a5)与(a1)、(a2)、(a3)或(a4)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和
135.(2)所述第二轻链可变区包含选自如下组的l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3：
136.(a6)如seq id no:13、14和15所示的氨基酸序列；
137.(a7)如seq id no:16、17和18所示的氨基酸序列；
138.(a8)如seq id no:19、20和21所示的氨基酸序列；
139.(a9)如seq id no:22、23和24所示的氨基酸序列；
140.(a10)与(a6)、(a7)、(a8)或(a9)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
141.在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其包括抗tigit抗体或其抗原结合片段和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗tigit抗体或其抗原结合片段包含所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3分别为seq id no:28、29和30或与seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第一重链可变区，和所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3分别为seq id no:34、35和36或与seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第一轻链可变区；和所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含所述h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3分别为seq id no:1、2和3或与seq id no:1、2和3所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第二重链可变区，和所述l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3分别为seq id no:13、14和15或与seq id no:13、14和15所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第二轻链可变区。
142.在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其包括抗tigit抗体或其抗原结合片段和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗tigit抗体或其抗原结合片段包含所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3分别为seq id no:28、29和30或与seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第一重链可变区，和所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3分别为seq id no:34、35和36或与seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第一轻链可变区；和所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含所述h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3分别为seq id no:7、8和9或与seq id no:7、8和9所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第二重链可变区，和所述l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3分别为seq id no:19、20和21或与seq id no:19、20和21所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第二轻链可变区。
143.在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其包括抗tigit抗体或其抗原结合片段和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗tigit抗体或其抗原结合片段包含所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3分别为seq id no:28、29和30或与seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第一重链可变区，和所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3分别为seq id no:34、35和36或与seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第一轻链可变区；和所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含所述h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3分别为seq id no:4、5和
6或与seq id no:4、5和6所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第二重链可变区，和所述l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3分别为seq id no:16、17和18或与seq id no:16、17和18所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第二轻链可变区。
144.在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其包括抗tigit抗体或其抗原结合片段和抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗tigit抗体或其抗原结合片段包含所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3分别为seq id no:28、29和30或与seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第一重链可变区，和所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3分别为seq id no:34、35和36或与seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第一轻链可变区；和所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含所述h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3分别为seq id no:10、11和12或与seq id no:10、11和12所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第二重链可变区，和所述l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3分别为seq id no:22、23和24或与seq id no:22、23和24所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的第二轻链可变区。
145.在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1抗体，所述抗tigit抗体或其抗原结合片段以及抗pd-l1抗体或其抗原结合片段各自独立地为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。
146.在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述抗tigit抗体或其抗原结合片段包含第一重链可变区和第一轻链可变区，其中：
147.(1)所述第一重链可变区的氨基酸序列选自：
148.(b1)如seq id no:98或seq id no:99所示的氨基酸序列；
149.(b2)(b1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与(b1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
150.(b3)与(b1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
151.(2)所述第一轻链可变区的氨基酸序列选自：
152.(b4)如seq id no:100或seq id no:101所示的氨基酸序列；
153.(b5)(b4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与(b4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
154.(b6)与(b4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
155.所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区和第二轻链可变区，其中：
156.(1)所述第二重链可变区的氨基酸序列选自：
157.(b1)如seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:50、seq id no:52或seq id no:61所示的氨基酸序列；
158.(b2)(b1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
159.(b3)与(b1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
160.(2)所述第二轻链可变区的氨基酸序列选自：
161.(b4)如seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44、seq id no:
54、seq id no:56或seq id no:64所示的氨基酸序列；
162.(b5)(b4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
163.(b6)与(b4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
164.在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述第一重链可变区的氨基酸序列为seq id no:98，seq id no:98经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:98功能相同的氨基酸序列或与seq id no:98具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:100，seq id no:100经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:100功能相同的氨基酸序列或与seq id no:100具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
165.在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述第一重链可变区的氨基酸序列为seq id no:98，seq id no:98经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:98功能相同的氨基酸序列或与seq id no:98具有至少85％序列同一性且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:25、26和27所示的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:100，seq id no:100经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:100功能相同的氨基酸序列或与seq id no:100具有至少85％序列同一性且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:31、32和33所示的氨基酸序列。
166.在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述抗tigit抗体或抗pd-l1抗体可以为鼠源抗体，其还含有鼠源的igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3或其变体的重链恒定区，和鼠源的κ链或其变体的轻链恒定区。
167.在一些优选的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述抗tigit鼠源抗体还含有鼠源的igg1或igg2或其变体的重链恒定区，和鼠源κ链或其变体的轻链恒定区。
168.在一些具体的实施方案中，本发明提供抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述抗tigit抗体或其抗原结合片段包含第一重链可变区和第一轻链可变区，其中：
169.(1)所述第一重链可变区的氨基酸序列选自：
170.(c1)如seq id no:99所示的氨基酸序列；
171.(c2)(c1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与(c1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
172.(c3)与(c1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
173.(2)所述第一轻链可变区的氨基酸序列选自：
174.(c4)如seq id no:101所示的氨基酸序列；
175.(c5)(c4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与(c4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
176.(c6)与(c4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
177.所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区和第二轻链可变区，其中：
178.(1)所述第二重链可变区的氨基酸序列选自：
179.(c1)如seq id no:50、seq id no:52或seq id no:61所示的氨基酸序列；
180.(c2)(c1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
181.(c3)与(c1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
182.(2)所述第二轻链可变区的氨基酸序列选自：
183.(c4)如seq id no:54、seq id no:56或seq id no:64所示的氨基酸序列；
184.(c5)(c4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
185.(c6)与(c4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
186.在一些具体的实施方案中，本发明提供抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述第一重链可变区的氨基酸序列为seq id no:99，seq id no:99经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:99功能相同的氨基酸序列或与seq id no:99具有至少85％序列同一性且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:101，seq id no:101经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:101功能相同的氨基酸序列或与seq id no:101具有至少85％序列同一性且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列；和所述第二重链可变区的氨基酸序列为seq id no:50所示的氨基酸序列，seq id no:50经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:50功能相同的氨基酸序列或与seq id no:50具有至少85％序列同一性且所述h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3如seq id no:1、2和3所示的氨基酸序列，且所述第二轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:54，seq id no:54经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:54功能相同的氨基酸序列或与seq id no:54具有至少85％序列同一性且所述l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3如seq id no:13、14和15所示的氨基酸序列。
187.在一些具体的实施方案中，本发明提供抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述第一重链可变区的氨基酸序列为seq id no:99，seq id no:99经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:99功能相同的氨基酸序列或与seq id no:99具有至少85％序列同一性且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:101，seq id no:101经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:101功能相同的氨基酸序列或与seq id no:101具有至少85％序列同一性且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列；和所述第二重链可变区的氨基酸序列为seq id no:52所示的氨基酸序列，seq id no:52经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:52功能相同的氨基酸序列或与seq id no:52具有至少85％序列同一性且所述h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3如seq id no:1、2和3所示的氨基酸序列，且所述第二轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:56，seq id no:56经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:56功能相同的氨基酸序列或与seq id no:56具有至少85％序列同一性且所述l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3如seq id no:13、14和15所示的氨基酸序列。
188.在一些具体的实施方案中，本发明提供抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述第一重链可变区的氨基酸序列为seq id no:99，seq id no:99经取代、缺失或添加一个或多个氨基
酸获得的且与seq id no:99功能相同的氨基酸序列或与seq id no:99具有至少85％序列同一性且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:101，seq id no:101经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:101功能相同的氨基酸序列或与seq id no:101具有至少85％序列同一性且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列；和所述第二重链可变区的氨基酸序列为seq id no:61所示的氨基酸序列，seq id no:61经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:61功能相同的氨基酸序列或与seq id no:61具有至少85％序列同一性且所述h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3如seq id no:7、8和9所示的氨基酸序列，且所述第二轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:64，seq id no:64经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:64功能相同的氨基酸序列或与seq id no:64具有至少85％序列同一性且所述l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3如seq id no:19、20和21所示的氨基酸序列。
189.在一些优选的实施方案中，本发明提供抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述第一重链可变区的氨基酸序列为seq id no:99，seq id no:99经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:99功能相同的氨基酸序列或与seq id no:99具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:101，seq id no:101经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:101功能相同的氨基酸序列或与seq id no:101具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列；和所述第二重链可变区的氨基酸序列为seq id no:50所示的氨基酸序列，seq id no:50经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:50功能相同的氨基酸序列或与seq id no:50具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3如seq id no:1、2和3所示的氨基酸序列，且所述第二轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:54，seq id no:54经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:54功能相同的氨基酸序列或与seq id no:54具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3如seq id no:13、14和15所示的氨基酸序列。
190.在一些具体的实施方案中，本发明提供抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述第一重链可变区的氨基酸序列为seq id no:99，seq id no:99经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:99功能相同的氨基酸序列或与seq id no:99具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:101，seq id no:101经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:101功能相同的氨基酸序列或与seq id no:101具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列；和所述第二重链可变区的氨基酸序列为seq id no:52所示的氨基酸序列，seq id no:52经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:52功能相同的氨基酸序列或与seq id no:52具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述h2cdr1、
h2cdr2和h2cdr3如seq id no:1、2和3所示的氨基酸序列，且所述第二轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:56，seq id no:56经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:56功能相同的氨基酸序列或与seq id no:56具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3如seq id no:13、14和15所示的氨基酸序列。
191.在一些具体的实施方案中，本发明提供抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述第一重链可变区的氨基酸序列为seq id no:99，seq id no:99经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:99功能相同的氨基酸序列或与seq id no:99具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3如seq id no:28、29和30所示的氨基酸序列，且所述第一轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:101，seq id no:101经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:101功能相同的氨基酸序列或与seq id no:101具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3如seq id no:34、35和36所示的氨基酸序列；和所述第二重链可变区的氨基酸序列为seq id no:61所示的氨基酸序列，seq id no:61经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:61功能相同的氨基酸序列或与seq id no:61具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3如seq id no:7、8和9所示的氨基酸序列，且所述第二轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:64，seq id no:64经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与seq id no:64功能相同的氨基酸序列或与seq id no:64具有至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％序列同一性且所述l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3如seq id no:19、20和21所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种抗tigit/抗pd-l1人源化抗体，其中所述重链包含人源的igg1、igg2、igg3、igg4或其变体的重链恒定区，所述轻链包含人源的κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
192.在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源抗tigit/抗pd-l1抗体，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，和/或进一步包含鼠源igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3或其变体的重链恒定区。
193.在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1抗体，所述抗tigit抗体或其抗原结合片段的抗体轻链进一步包含鼠源κ、λ链或其突变序列的轻链恒定区。所述的抗tigit抗体或其抗原结合片段的抗体重链进一步包含鼠源igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3或其突变序列的重链恒定区，优选包含人源igg1、igg2、igg4重链恒定区。
194.在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1抗体，所述抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段还包含人源igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3或其变体的重链恒定区，和人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。在一些优选的实施方案中，本发明的抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段还包含人源igg1、igg2、igg4或其变体的重链恒定区，和人源κ链或其变体的轻链恒定区。
195.在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1抗体，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的抗体重链进一步包含鼠源igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3或其突变序列的重链恒定区，优选包含人源igg或其突变序列的重链恒定区；所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的抗体轻链进一步包含鼠源κ、λ链或其突变序列的轻链恒定区。
196.在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1抗体，所述抗pd-l1人源化抗体或其抗原结合片段还包含人源igg1、igg2、igg3或igg4或其变体的重链恒定区，和人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。在一些优选的实施方案中，本发明的抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段还包含人源igg4或其变体的重链恒定区，和人源κ链或其变体的轻链恒定区。
197.在一些实施方案中，本发明提供抗tigit/抗pd-l1抗体，其中所述的抗tigit抗体或其抗原结合片段以及抗pd-l1抗体或其抗原结合片段分别为fab、fv、sfv或f(ab)2。在一个具体的实施方案中，本发明提供的抗tigit/抗pd-l1抗体为scf(ab)2。
198.优选地，本发明以上实施方案中的抗tigit/抗pd-l1抗体是抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，所述结合特异性之一是针对tigit，而另一个结合特异性是针对任何其它抗原。在一些实施方案中，所述结合特异性之一是针对tigit，而另一个结合特异性是针对pd-l1。在一些实施方案中，所述双特异性抗体可结合tigit的两种不同表位。所述双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达tigit的细胞。这些抗体拥有tigit结合臂和细胞毒剂结合臂，所述细胞毒剂例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白a链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原。可将本发明的双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如f(ab')2双特异性抗体)。
199.制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组制备基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性(millstein and cuello,nature 305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadroma))可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种分子具有正确的双特异性结构。该正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤进行，相当麻烦且产物产量低。类似的方法在wo93/08829及trauneckeretal.,emboj.10:3655(1991)中有公开。
200.根据一种不同的方法，具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。在一些实施方案中，与包含至少部分铰链、ch2和ch3区的免疫球蛋白重链恒定区进行融合。在一些实施方案中，包含与轻链结合所必需位点的第一重链恒定区(ch1)存在于该融合的至少一部分中。将编码免疫球蛋白重链融合片段以及免疫球蛋白轻链(如果需要)的dna插入不同的表达载体中并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供极大的灵活性。不过，在至少两种多肽链以相同比例表达产生高产量时或比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
201.在该方法的一个实施方案中，所述双特异性抗体由一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。由于免疫球蛋白轻链仅在该双特异性分子的一半中存在提供了便利的分离途径，因此发现该不对称性结构便于将期望的双特异性物质与不想要的免疫球蛋白链组合物分开。该方法在wo 94/04690中公开。关于产生双特异性抗体的进一步信息参见例如sureshetal.,methods in enzymology 121:210(1986)。
202.根据另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面以使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。该界面包含抗体恒定区ch3结构域的至少一部分。在该方法中，将
l1靶向部分之一可以是全长抗体，并且另一个可以是包含重链cdr、轻链cdr或其组合的抗原结合片段(例如scfv)。靶向tigit和pd-l1蛋白之一的全长抗体和靶向另一蛋白的抗原结合片段可以直接或通过连接肽以化学方式连接(例如共价连接)。抗原结合片段(例如scfv)可以直接或通过连接肽与全长抗体的n-末端(例如全长抗体的轻链或重链的n-末端)、全长抗体的c-末端(例如全长抗体的重链(或fc或ch3结构域)的c-末端)或两者连接。
209.在一个实施方案中，双特异性抗体可以包含全长抗tigit抗体、抗pd-l1抗体的抗原结合片段(例如scfab、scfv)以及它们之间的连接肽。在其他实施方案中，双特异性抗体可以包含全长抗tigit抗体、抗pd-l1抗体的抗原结合片段(例如scfab、scfv)以及它们之间的连接肽。
210.在一个实施方案中，双特异性抗体中包含的scfv可以按任何顺序包含重链可变区和轻链可变区。例如，双特异性抗体中包含的scfv可以在从n-末端到c-末端的方向上包含重链可变区和轻链可变区以及任选地在它们之间的连接肽，或者可替代地，双特异性抗体中包含的scfv可以在从n-末端到c-末端的方向上包含轻链可变区和重链可变区以及任选地在它们之间的连接肽。
211.在一些实施方案中，所述连接肽可包括例如gly、asn和/或ser残基，并且还可以包括中性氨基酸，例如thr和/或ala。适用于连接肽的氨基酸序列可以是相关领域中已知的那些。同时，可以在使得融合蛋白功能不受影响的这样的限度内不同地确定连接肽的长度。例如，连接肽可以通过包括总共约1至约100、约2至约50、或约5至约25个选自由gly、asn、ser、thr、和ala组成的组的一种或多种来形成。在一个实施方案中，连接肽可以表示为(gmsl)n(m、l和n独立地是约1至约10的整数，特别是约2至约5的整数)。
212.在另一个实施方案中，pd-l1靶向部分和tigit靶向部分可以均是全长抗体或包含重链cdr、轻链cdr或其组合的抗原结合片段。
213.在另一个实施方案中，双特异性抗体可以是异二聚体形式，其包含第一臂和第二臂，该第一臂包括靶向tigit和pd-l1之一的一对第一重链和第一轻链，该第二臂包括靶向另一者的一对第二重链和第二轻链。
214.在一个实施方案中，全长抗体可以是全长免疫球蛋白形式(例如igg、igm、iga、ige或igd，例如人igg、人igm、人iga、人ige或人igd)，并且抗原结合片段可以选自由fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv、scfv、scfab、单链抗体、sdfv等组成的组。例如，全长抗体可以是全长人igg(人igg1、人igg2、人igg3或人igg4)形式，并且抗原结合片段可以是scfv。
215.例如，本文描述的抗体可以包含柔性接头序列，或者可以被修饰以添加功能部分(例如peg、药物、毒素或标记)。在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体，所述抗tigit抗体或其抗原结合片段的结构为(vl-cl)-连接肽-(vh)-igg4ch，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的结构为(vl-cl)-连接肽-(vh)-igg4ch。在另一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体，所述抗tigit抗体或其抗原结合片段的结构为(vl-vh)-连接肽-igg4fc，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的结构为(vl-cl)-连接肽-(vh)-igg4ch。在一些具体的实施方案中，所述连接肽为(ggggs)n形式，其中n为1-12，优选为3-10，更优选为6-8，例如6、7、8个ggggs重复序列。在另一些具体的实施方案中，靶向tigit部分的(vl-cl)-连接肽-(vh)-igg4ch中的igg4fc为含有s228p、l235e突变的igg4 ch段，靶向pd-l1部分的(vl-cl)-连接肽-(vh)-igg4ch中的
igg4fc为含有s228p、l235e突变的igg4 ch段。在另一些具体的实施方案中，靶向tigit部分的(vl-cl)-连接肽-(vh)-igg4ch中的igg4fc为含有s228p、s354c、t366w突变形成“hole”结构的igg4 ch段，靶向pd-l1部分的(vl-cl)-连接肽-(vh)-igg4ch中的igg4fc为含有s228p、y349c、t366s、l368a、y407v突变形成“knob”结构的igg4 ch段。在另一些具体的实施方案中，靶向tigit部分的(vl-cl)-连接肽-(vh)-igg4ch中的igg4fc为含有s228p、l235e、s354c、t366w突变形成“hole”结构的igg4 ch段，靶向pd-l1部分的(vl-cl)-连接肽-(vh)-igg4ch中的igg4fc为含有s228p、l235e、y349c、t366s、l368a、y407v突变形成“knob”结构的igg4 ch段。在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体，其由两条肽链组成，其中：
216.肽链1的结构为：
[0217][0218]
肽链2的结构为：
[0219][0220]
其中igg4ch/ks表示igg4恒定区(s228p、y349c、t366s、l368a、y407v突变)，igg4ch/hs表示igg4恒定区(s228p、s354c、t366w突变)。
[0221]
在另一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体，其由两条肽链组成，其中：
[0222]
肽链1的结构为：
[0223][0224]
肽链2的结构为：
[0225]
其中igg4ch/pe表示igg4恒定区(s228p、l235e突变)。
[0226]
在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体，其由两条肽链组成，其中肽链1的氨基酸序列为seq id no:102，肽链2的氨基酸序列为seq id no:103。在另一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体，其由两条肽链组成，其中肽链1的氨基酸序列为seq id no:104，肽链2的氨基酸序列为seq id no:105。在另一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体，其由两条肽链组成，其中肽链1的氨基酸序列为seq id no:102，肽链2的氨基酸序列为seq id no:106。在另一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体，其由两条肽链组成，其中肽链1的氨基酸序列为seq id no:107，肽链2的氨基酸序列为seq id no:108。在另一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体，其由两条肽链组成，其中肽链1的氨基酸序列为seq id no:102，肽链2的氨基酸序列为seq id no:109。在另一些具体的实施方案中，根据本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体，其由两条肽链组成，其中肽链1的氨基酸序列为seq id no:110，肽链2的氨基酸序列为seq id no:111。本发明的另一方面提供分离的核酸。在一些实施方案中，根据本发明的分离的核酸编
码本发明的抗tigit/抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，根据本发明的分离的核酸编码本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段。在另一些实施方案中，根据本发明的分离的核酸编码本发明的抗pd-l1抗体或其抗原结合片段。
[0227]
在一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其包含编码第一重链可变区如seq id no:75、seq id no:76、seq id no:98或seq id no:99的核苷酸序列和编码第一轻链可变区如seq id no:77、seq id no:78、seq id no:100或seq id no:101的核苷酸序列。在另一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其包含编码第二重链可变区如seq id no:50、seq id no:52或seq id no:61的核苷酸序列和编码第二轻链可变区如seq id no:54、seq id no:56或seq id no:64的核苷酸序列。在再一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其包含编码第一重链可变区如seq id no:99的核苷酸序列和编码第一轻链可变区如seq id no:101的核苷酸序列。在再一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其包含编码第二重链可变区seq id no:50的核苷酸序列和编码第二轻链可变区seq id no:54的核苷酸序列。在一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸组合，其包含编码第一重链可变区如seq id no:99的核苷酸序列，编码第一轻链可变区如seq id no:101的核苷酸序列，编码第二重链可变区如seq id no:50的核苷酸序列，和编码第二轻链可变区如seq id no:54的核苷酸序列。在另一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸组合，其包含编码第一重链可变区如seq id no:99的核苷酸序列，编码第一轻链可变区如seq id no:101的核苷酸序列，编码第二重链可变区如seq id no:52的核苷酸序列，和编码第二轻链可变区如seq id no:56的核苷酸序列。在另一个具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸组合，其包含编码第一重链可变区如seq id no:99的核苷酸序列，编码第一轻链可变区如seq id no:101的核苷酸序列，编码第二重链可变区如seq id no:61的核苷酸序列，和编码第二轻链可变区如seq id no:64的核苷酸序列。
[0228]
本发明的另一方面提供表达载体。在一些实施方案中，本发明的表达载体表达本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体。在一些实施方案中，本发明的表达载体表达本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段。在另一些实施方案中，本发明的表达载体表达本发明的抗pd-l1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，根据本发明的表达载体，表达本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段的载体和表达本发明的抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的载体是同种表达载体。根据本发明的表达载体其包含本发明的分离的核酸分子。
[0229]
本发明的另一方面提供一种如上所述的表达载体转化的宿主细胞。
[0230]
在一些实施方案中，根据本发明的宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。在一些实施方案中，所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌。在另一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。
[0231]
本发明的另一方面提供制备本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体的方法，包括在所述宿主细胞中表达抗体以及从宿主细胞中分离所述抗体的步骤。
[0232]
本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体和药学可接受的载体。在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体，还包含其他活性组分，如其他抗体、靶向药物等。在一些实施方案中，所述药学可接受的载体选自抗氧化剂、多肽、蛋白质、亲水性聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、糖醇、离子和表面活性剂。在一个具体的实施方案中，所述药学可接受的载体为
缓冲水溶液。在另一个具体的实施方案中，所述药学可接受的载体为脂质体的形式。
[0233]
本发明的另一方面提供一种嵌合抗原受体(car)融合蛋白，其包含本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段和/或抗pd-l1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体融合蛋白包含本发明的抗tigit抗体或其抗原结合片段，其为针对tigit抗原的vh和v
l
的单链可变片段(scfv)。在另一些实施方案中，所述嵌合抗原受体融合蛋白包含本发明的抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其为针对pd-l1抗原的vh和v
l
的单链可变片段(scfv)。在另一些实施方案中，所述嵌合抗原受体融合蛋白包含针对tigit抗原的vh和v
l
的第一单链可变片段(scfv)和针对pd-l1抗原的vh和v
l
的第二单链可变片段(scfv)。所述针对tigit抗原的vh和v
l
的第一scfv具有以上实施方案中描述的第一重链可变区的h1cdr1、h1cdr2和h1cdr3和第一轻链可变区的l1cdr1、l1cdr2和l1cdr3。所述针对pd-l1抗原的vh和v
l
的第二scfv具有以上实施方案中描述的第二重链可变区的h2cdr1、h2cdr2和h2cdr3和第二轻链可变区的l2cdr1、l2cdr2和l2cdr3。
[0234]
可以将本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于经口、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、脑内、眼内、气管内、皮下、鼻内途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。
[0235]
本发明的另一方面提供治疗和/或预防与tigit、pd-l1或两者相关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体或本发明的药物组合物。
[0236]
本发明的另一方面提供本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体或本发明的药物组合物在制备治疗和/或预防与tigit、pd-l1或两者相关的疾病的药物中的应用。在一些实施方案中，所述与tigit、pd-l1或两者相关的疾病包括血液肿瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤和/或黑素瘤。所述肿瘤可以是任何表达pd-l1蛋白的肿瘤，例如膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌等)、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、甲状腺癌等。所述肿瘤可以是原发性或转移性肿瘤。在一些实施方案中，本发明提供上述抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体或本发明的药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用，例如所述肿瘤选自血液肿瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、骨髓瘤、前列腺癌。
[0237]
本发明提供的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体具有显著的抗肿瘤作用，可明显抑制肿瘤生长，可在制备用于治疗各类肿瘤疾病的药物中应用，具有广阔的市场前景。
[0238]
定义
[0239]
除非另有定义，本文中使用的科学和技术术语的含义是本领域技术人员所通常理解的含义。本文中所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡或多核苷酸化学及杂交中使用的命名和技术是本领域公知且普遍使用的。对于重组dna、寡核苷酸合成和组织培养与转化(如电穿孔、脂质转染)，使用了标准技术。酶促反应和纯化技术根据生产商的说
明书或本领域普遍使用或本文所述的方法进行。前述技术和方法通常根据本领域公知且本说明书中引用和讨论的多部综合和较具体的文献中描述的那样使用。参见例如sambrook等，molecular cloning:a laboratory manual)(第2版，cold spring harbor laboratory press，纽约冷泉港(1989))。本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药学化学中使用的命名以及实验室方法和技术是本领域公知且普遍使用的。
[0240]
在本发明中，术语“至少80％序列同一性”是指至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的序列同一性。在本发明中，术语“至少85％序列同一性”是指至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的序列同一性。在一些优选的实施方案中，本发明所述的序列同一性可以至少为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以通过national center for biotechnology instutute网站上的blastn/blastp算法来进行。
[0241]
在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中以相对彼此的位置排列以形成抗原结合表面。抗原结合表面与所结合抗原的三维表面互补，且每条重链和轻链的三个高变区均被称作“互补决定区”或“cdr”。氨基酸向每个结构域的分配是根据kabat《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1987和1991))或chothia和lesk，j.mol.biol.196:901-917(1987)，chothia等，nature 342:878-883(1989)定义。
[0242]
本发明的“抗体”是指特异性地识别并结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整抗体和其任何抗原结合片段或单链。本发明的“抗体”包括含有ig分子的具有结合抗原的生物活性的至少一部分的任何蛋白质或肽。本发明“抗体”的实例包括但不限于重链或轻链的cdr或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分。
[0243]
本发明所述的“抗原结合片段”包括具有抗原结合活性的fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段及与人tigit或pd-l1结合的fv片段、scfv片段。fv片段含有抗体第一重链可变区和第一轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，fv抗体还包含在vh和vl结构域之间的多连接肽，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体或单链fv(scfv)。本发明的抗tigit或抗pd-l1抗体可以是单链可变区片段(scfv)，其源自抗体的单链多肽，保留了结合抗原的能力。scfv的实例包括通过重组dna技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(h链)和轻链(l链)片段的fv区经由间隔序列连接。制备scfv的各种方法是本领域技术人员所熟知的。
[0244]
本发明所述的抗体指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”指抗体与抗原的一种或多种抗原决定簇反应而不与其他多肽反应或以很低的亲和性(kd》10-6
)结合其他多肽。抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、dab(结构域抗体)、单链、fab、fab’和f(ab’)2片段、fv、scfv及fab表达文库。单克隆抗体(mab)是由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术及合成技术如cdr grafting或其它现有技术进行重组得到。
[0245]
本发明所述的“鼠源抗体”为根据本领域知识和技能制备的对人tigit的单克隆抗体。制备时用tigit抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
[0246]
本发明所述的“嵌合抗体”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。
[0247]
本发明所述的“人源化抗体”也称为cdr移植抗体，是将小鼠的cdr序列移植到人的抗体可变区框架(fr)中产生的抗体。此类可变区框架序列可以从公共的dna数据库或公开的参考文献获得，例如从immunogenetics(imgt)网站http://imgt.cines.fr得到或从免疫球蛋白杂志，2001isbn012441351上获得。
[0248]
本发明所述的“双特异性抗体”指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。
[0249]
本发明所述的“连接肽”可以是包括1至10，特别是2至50个任何氨基酸的那些，并且可以包括任何种类的氨基酸而没有任何限制。
附图说明
[0250]
图1是scfab结构的双特异性抗tigit/抗pd-l1抗体结构示意图。
[0251]
图2是scfv结构的双特异性抗tigit/抗pd-l1抗体结构示意图。
具体实施方式
[0252]
下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中未注明条件的实验方法通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册、分子克隆手册等，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件进行。实施例中使用的材料、试剂如无特殊说明均为商购获得。
[0253]
实施例1抗人pd-l1抗体的获得
[0254]
1.动物免疫
[0255]
采用mfc标签的pd-l1抗原蛋白(购于北京百普赛斯生物科技有限公司，中国)与佐剂共同免疫的方法免疫balb/c、sjl品系的实验小鼠和sd品系的实验大鼠。
[0256]
免疫佐剂首次是freund’s adjuvant,complete(sigma,f5881-10ml)，后期用freund’s adjuvant,incomplete(sigma,f5506-10ml)。将不同标签的pd-l1抗原蛋白样品逐滴加入到佐剂溶液中，边滴加边涡旋以充分混合，佐剂使用剂量参考说明书进行。混合均匀形成油包水的乳状后免疫小鼠或大鼠。免疫方案如表1所示：
[0257]
表1免疫方案
ꢀ
colja venturini etal.antibody variable-region sequencing as a method for hybridoma cell-line authentication,2008,78:1071
–
1078)，进行dna测序获得序列，测序结果见表2。
[0268]
表2抗pd-l1鼠源单克隆抗体序列
[0269][0270]
5.嵌合抗体的构建
[0271]
将纯化后的小鼠抗体轻链与重链可变区基因片段分别与线性化的含有人抗体轻链或重链恒定区基因片段的真核表达质粒共转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取测序正确的嵌合抗体分别标记为pl-7chi、pl-15chi、pl-16chi、pl-18chi，嵌合抗体测序结果见表3。
[0272]
pl-7chi、pl-15chi、pl-16chi、pl-18chi轻重链可变区氨基酸序列，分别同鼠源性抗体shs009pl-7、shs009pl-15、shs009pl-16、shs009pl-18轻重链可变区氨基酸序列相同。
[0273]
提取嵌合抗体轻链质粒与重链质粒转染hek 293f细胞，表达纯化获得大量抗体，进行纯度检测、活性分析及亲和力的检测。
[0274]
表3抗pd-l1嵌合抗体序列
[0275]
嵌合抗体重链可变区氨基酸序列轻链可变区氨基酸序列pl-7chiseq id no:37seq id no:41pl-15chiseq id no:38seq id no:42pl-16chiseq id no:39seq id no:43pl-18chiseq id no:40seq id no:44
[0276]
6.抗pd-l1抗体人源化改造
[0277]
根据嵌合抗体的活性分析、亲和力kd值等结果选择pl-7chi、pl-16chi进行人源化抗体改造。
[0278]
鼠源单克隆嵌合抗体pl-7chi、pl-16chi的人源化参照经典的cdr移植策略进行，以pl-7chi、pl-16chi抗体框架区序列fr1-fr3作为模板，在人框架区库中寻找3d结构相似但是免疫原性较低的全人框架替代pl-7chi/pl-16chi的fr1-fr3序列。经同源比对分析，pl-7chi、pl-16chi抗体重链可变区fr区分别与人抗体种系基因m99683|ighv4-31*02(seq id no:45)、x62109|ighv1-3*01(seq id no:46)最为相似，pl-7chi、pl-16chi抗体轻链可变区fr区与人抗体种系基因z00023|igkv4-1*01(seq id no:47)最为相似。人源化后的重链/轻链全长序列进行3d建模并和原抗体重链/轻链序列进行结构比对分析，综合考虑抗原性和3d结构相似度，并将在结构模拟中显示对抗体结构稳定起到关键作用的的氨基酸位点回突变为鼠源性氨基酸残基。最后得到pl-7chi人源化重链5条(pl-7chi人源化重链可变区
id no:67所示。对该氨基酸序列进行密码子优化后合成完整的表达质粒pcdna3.1-tigit-his。
[0290]
2)配体蛋白的表达载体构建
[0291]
人源cd155蛋白胞外区氨基酸序列与higg1-fc或migg1-fc标签氨基酸序列，氨基酸序列设计分别如seq id no:68和seq id no:69所示。对上述氨基酸序列进行密码子优化后合成带有标签的cd155蛋白胞外区基因片段cd155-hfc、cd155-mfc，并将其分别克隆至真核表达质粒phr中，获得其表达质粒phr-cd155-hfc、phr-cd155-mfc。
[0292]
融合人源cd155蛋白胞外区氨基酸序列与his氨基酸序列，氨基酸序列设计如seq id no:70所示。对该氨基酸序列进行密码子优化后合成完整的表达质粒pcdna3.1( )-cd155-his。
[0293]
3)阳性对照抗体的表达载体构建
[0294]
使用专利申请us 2016/0176963a1中公开的人源化抗体22g2(本文简称22g2)作为阳性对照抗体。参照us 2016/0176963a1中公开的方法制备22g2。22g2的氨基酸序列如下所示：
[0295]
22g2重链可变区氨基酸序列：seq id no:71；
[0296]
22g2轻链可变区氨基酸序列：seq id no:72；
[0297]
对22g2抗体所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化，将其重链基因片段克隆到含有igg4轻链恒定区的真核表达质粒phr上，获得22g2的重链真核表达质粒phr-22g2-hg4，其轻链表达质粒为phr-22g2-hk。
[0298]
2、抗原蛋白及阳性对照抗体的表达与纯化
[0299]
1)抗原蛋白的稳转细胞株的构建
[0300]
合成编码tigit蛋白全长的基因片段，氨基酸序列设计如seq id no:73所示，然后克隆到真核表达质粒ptarget上，获得其表达质粒ptarget-tigit。
[0301]
将真核表达质粒ptarget-tigit在160v电压，15msec的方形脉冲下以电转的方式转染到cho-k1细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所)，置37℃，5％co2的培养箱中培养。24h后采用含500μg/ml g418的培养基加压培养。16天后采用facs检测pool阳性率，将电转质粒后的细胞铺板(1x106个/ml的细胞密度，100ul/孔)，采用pe mouse anti-human tigit抗体(bd，556046)与细胞孵育，以流式细胞仪(bd，facsjazz)读取585nm波长下mean值，使用graphpad生成进行数据分析。将阳性细胞株进行亚克隆，挑选出克隆化的cho-k1细胞株，该细胞株高水平表达tigit分子，命名为htigit-cho-k1。
[0302]
2)配体蛋白的稳转细胞株的构建
[0303]
合成编码cd155蛋白全长的基因片段，氨基酸序列设计如seq id no:74所示，然后克隆到真核表达质粒ptarget上，获得其表达质粒ptarget-cd155。
[0304]
将真核表达质粒ptarget-cd155在160v电压，15msec的方形脉冲下以电转的方式转染到cho-k1细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所)，置37℃，5％co2的培养箱中培养。24h后采用含500μg/ml g418的培养基加压培养。16天后采用facs检测pool阳性率，将电转质粒后的细胞铺板(1x106个/ml的细胞密度，100ul/孔)，采用pe mouse anti-human cd155抗体(bd，556046)与细胞孵育，以流式细胞仪(bd，facsjazz)读取585nm波长下mean值，使用graphpad生成进行数据分析。将阳性细胞株进行亚克隆，挑选出克隆化的cho-k1细胞株，该
细胞株高水平表达cd155分子，命名为hcd155-cho-k1。
[0305]
3)标签蛋白及阳性对照抗体的表达
[0306]
在1l细胞培养瓶中接种密度为0.5 x 106个细胞/ml的293f细胞，加入新鲜的预热的freestyle 293表达培养基，使接种后总体积达到250ml，置37℃，8％co2，加湿的co2培养箱中培养过夜。取8.5ml freestyle 293表达培养基，加入1mg/ml的pei溶液500ul，混合均匀，取250μg待转染质粒加入8.5ml freestyle 293表达培养基中，混合均匀，其中标签抗原蛋白质粒phr-tigit-hfc、phr-tigit-his、pcdna3.1( )-tpa-tigit-migg1-fc分别转染；标签配体蛋白质粒phr-cd155-hfc、phr-cd155-his、pcdna3.1( )-tpa-cd155-migg1-fc分别转染；阳性对照抗体22g2重链质粒phr-22g2-hg4和轻链质粒phr-22g2-hk共同转染。将pei与freestyle 293表达培养基的混合溶液加入到质粒中，混合均匀，然后加入细胞培养物中，置37℃，8％co2，加湿的co2培养箱中培养。在细胞转染后第1天和第3天对细胞进行补料，每瓶加入2.5ml的谷氨酰胺(母液浓度为200mm)和5ml的葡萄糖(母液浓度为180g/l)。当细胞细胞活力降至65％～75％时，收集细胞上清。将细胞培养物1500rpm离心5min，收集上清，再8000rpm离心20min，收集上清。
[0307]
4)亲和层析柱纯化
[0308]
利用akta(ge，akta pure-150)根据蛋白性质采用不同的亲和层析柱进行纯化(不同蛋白适配的亲和层析柱见表5)，具体纯化步骤如下：
[0309]
表5不同蛋白适配的亲和层析柱
[0310][0311]
清洗：超纯水清洗设备及管路2min，流速10ml/min，后用0.1m naoh清洗层析系统；
[0312]
接柱：将层析柱接入层析设备，并用超纯水冲洗5min；后0.1m naoh冲洗30min，保留时间5min；
[0313]
平衡：20mm pb 0.15m nacl，ph 7.2平衡5个cv(柱体积)；
[0314]
上样：将细胞表达上清上样，保留时间5min；
[0315]
后平衡：20mm pb 0.15m nacl，ph 7.2平衡5个cv；
[0316]
洗脱：50mm醋酸，ph＝3.4洗脱，保留时间5min。uv280至50mau左右时开始收集，降至50mau左右时停止收集。用1m tris-hcl，ph 9.0将样品ph调节至7.0；
[0317]
再平衡：20mm pb 0.15m nacl，ph 7.2平衡3个cv，保留时间5min；
[0318]
在线清洗：0.1m naoh清洗30min，保留时间5min；
[0319]
清洗保存：纯化水清洗10min，后20％乙醇2个cv。
[0320]
实施例4抗tigit单克隆抗体的制备
[0321]
1、杂交瘤单克隆的制备
[0322]
(1)动物免疫
[0323]
采用购买的不同标签的tigit抗原蛋白(tigit-his(sino biological，10917-h08h)、tigit-hfc(r&d,7898-tg)、tigit-mfc(acro biosystems,cat.no.tit-h5253))与佐剂共同免疫的方法免疫c57、sjl品系的实验小鼠，首次免疫使用50μg抗原，后期使用25μg抗原免疫；采用不同标签的tigit抗原蛋白与佐剂共同免疫的方法免疫sd品系的实验大鼠，首次抗原使用100μg抗原，后期使用50μg抗原免疫。
[0324]
免疫佐剂可以是quick antibody-mouse5w(北京博奥龙免疫技术有限公司，北京)或titer max(sigma)与cpg(金斯瑞生物科技有限合成)/alum(thermo)佐剂间隔。将不同标签的tigit抗原蛋白样品逐滴加入到佐剂溶液中，边滴加边涡旋以充分混合，佐剂使用剂量参考说明书进行。混合均匀形成油包水的乳状后免疫小鼠及大鼠。
[0325]
高水平表达tigit分析的细胞系如htigit-cho-k1也用来免疫大鼠，使之产生抗体。用胰蛋白酶消化处理正在培养的实施例1中获得的htigit-cho-k1阳性单细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用pbs重悬细胞沉淀，取样用细胞计数仪计数，剩余样品1000rpm离心5min，弃上清，用pbs重悬细胞沉淀，计入适量的pbs以获得1
×
108个细胞/ml的细胞悬液。实验组小鼠每只免疫1
×
107个细胞。
[0326]
免疫方案如表6、表7所示：
[0327]
表6小鼠免疫方案
[0328][0329]
表7大鼠免疫方案
[0330][0331]
*i.m.肌内注射；s.c.皮下注射；i.p.腹腔注射。
[0332]
(2)杂交瘤融合
[0333]
脾细胞的获取和制备：将加强免疫后的小/大鼠处死后浸泡75％的酒精中。解剖取出脾脏，用研磨棒研磨后，经细胞筛网过滤后制备成单细胞悬液。将脾细胞悬液2000rpm离
region sequencing as a method for hybridoma cell-line authentication,2008,78:1071
–
1078)，进行dna测序获得序列，测序结果见表8。
[0343]
表8抗tigit鼠源单克隆抗体序列
[0344][0345]
实施例5抗tigit嵌合抗体的构建
[0346]
将纯化后(纯化步骤参见实施例3)的鼠抗轻链与重链可变区基因片段分别与线性化的含有人抗体轻链或重链恒定区的真核表达质粒共转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，将混合液均匀涂布于含有相应抗生素的琼脂平板表面，于37℃恒温培养箱过夜培养后分别挑取若干单菌落进行dna测序；将测序正确的嵌合抗体分别标记为shs006-17chi、shs006-23chi。
[0347]
将测序正确的阳性克隆接种于含有相应抗生素的2
×
yt液体培养基中，于37℃振荡培养12小时以上，然后收集菌体进行质粒提取，从而获得嵌合抗体轻链与重链表达质粒，使用核酸定量分析仪检测质粒的浓度与纯度。
[0348]
将嵌合抗体转染hek293e细胞，表达纯化获得大量抗体，进行纯度检测、活性分析及亲和力的检测。
[0349]
嵌合抗体测序结果见表9。
[0350]
表9抗tigit嵌合抗体序列
[0351][0352]
实施例6抗tigit人源化抗体的构建及生产
[0353]
根据嵌合抗体的活性分析、亲和力kd值等结果选择shs006-17chi、shs006-23chi进行人源化抗体改造。
[0354]
抗体的人源化改造，首先是通过与免疫基因数据库(imgt)中的小鼠抗体序列进行比对，确认shs006-17chi、shs006-23chi抗体可变区的鼠源种系，经过同源比对，shs006-17chi、shs006-23chi抗体的重链可变区序列的fr区分别与小鼠抗体种系基因ighv2-26*01以及ighv3-7*01最为相似；抗体轻链可变区的fr序列则分别与小鼠抗体igkv2-28*01以及igkv1-39*01最为相似。以shs006-17chi/shs006-23chi抗体框架区序列fr1-fr3作为模板，在人框架区库中寻找3d结构相似但是免疫原性较低的全人框架替代shs006-17chi/shs006-23chi的fr1-fr3序列，重链/轻链全长序列进行3d建模并和原抗体重链/轻链序列
进行结构比对分析，综合考虑抗原性和3d结构相似度，并将在结构模拟中显示对抗体结构稳定起到关键作用的的氨基酸位点回突变为鼠源性氨基酸残基。最终选择shs006-17chi的5条人源化重链可变区(参见seq id no:79、80、81、82、83)和4条人源化轻链可变区(参见seq id no:84、85、86、87)及shs006-23chi的5条人源化重链可变区(参见seq id no:88、89、90、91、92)和5条人源化轻链可变区(参见seq id no:93、94、95、96、97)进行下一步优化。shs006-17chi/shs006-23chi人源化抗体非cdr区序列均达到95％以上人源化。
[0355]
将以上设计好的人源化抗体轻链与重链可变区氨基酸序列反转录成相对应的核苷酸序列，并生成相邻片段之间含有互补序列的寡核苷酸片段，通过overlap pcr将寡核苷酸片段退火后连接起来，再利用特异性引物(5’端含有用于与真核表达载体发生同源重组的同源臂序列)扩增出完整的轻链与重链可变区核苷酸片段；将纯化后的轻链可变区核苷酸片段与线性化的含有igg4轻链恒定区的真核表达质粒共转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，将纯化后的重链可变区核苷酸片段与含s228p/l235e突变的igg4重链恒定区的真核表达质粒共转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，分别将转化质粒的感受态细胞均匀涂布于含有相应抗生素的琼脂平板表面，于37℃恒温培养箱过夜培养后分别挑取若干单菌落进行dna测序。
[0356]
将测序正确的阳性克隆接种于含有相应抗生素的2
×
yt液体培养基中，于37℃振荡培养12小时以上，然后收集菌体进行质粒提取，从而获得人源化抗体轻链与重链表达质粒，使用核酸定量分析仪检测质粒的浓度与纯度。
[0357]
将质粒转染hek293e细胞，表达纯化获得大量抗体，进行纯度检测、活性分析及亲和力的检测。
[0358]
挑选纯度、活性和亲和力均较好的人源化抗体，标记为shs006-t-hu17-31、shs006-t-hu23-53，序列见表10。
[0359]
表10抗tigit人源化抗体序列
[0360][0361]
实施例7抗tigit抗体细胞功能测定
[0362]
采用荧光素酶报告基因系统(购于bps bioscience公司，美国)对本发明的抗tigit抗体进行细胞功能测定，使用抗体22g2作为对照。
[0363]
实验步骤如下：
[0364]
①
靶细胞准备：将cd155/tcr activator-cho细胞以2.5x 104cells/ml的密度铺板(检测孔及ntc)，100ul/孔，细胞培养板放入于37℃、5％co2培养箱中培养过夜；
[0365]
②
效应细胞准备：取tigit/nfat-reporter-jurkat细胞，用分析培养基洗一遍，调整密度至4x 105cells/ml；
[0366]
③
抗体与效应细胞孵育：将按梯度稀释好的本发明抗tigit抗体与效应细胞(v:v
＝1:1，各60μl)于37℃孵育30min；
[0367]
④
与靶细胞孵育：去除靶细胞培养板中的培养基，加入tigit/nfat-reporter-jurkat细胞和抗体复合物，100μl/孔，bg孔加入100ul分析培养基，将细胞培养板放入培养箱孵育5-6个小时；
[0368]
⑤
检测：水浴融化试剂a及试剂b，在避光的条件下，用试剂a将试剂b稀释，体积比100:1，混匀，在每孔中加入100ul一步法荧光素酶试剂，室温轻微晃动15-30min，使用荧光酶标仪检测。
[0369]
根据每个样品的吸光度与抗体浓度关系绘图，以展示抗体在不同浓度下诱导荧光素酶的表达相对空白对照组的倍数，并对数据计算其top值及ec50值。top值及ec50值的结果如表11所示。
[0370]
表11抗tigit抗体诱导的荧光素酶表达
[0371][0372]
实验结果显示本发明的抗tigit抗体诱导荧光素酶表达的ec50值显著低于对照抗体22g2。这表明本发明的抗tigit抗体能够更有效地通过阻断tigit-cd155的结合来活化t细胞，在活化t细胞进而杀伤肿瘤方面表现出显著优于22g2的功能。
[0373]
实施例8抗tigit抗体与人tigit结合活性测定(elisa)
[0374]
采用elisa分析抗体的结合活性。将人tigit-his蛋白(1μg/孔，sino biological，10917-h08h)包被到96孔酶标板，37℃孵育2h。用1
×
pbst清洗3次后用5％的脱脂牛奶4℃封闭过夜。用1
×
pbst清洗3次后，本发明提供的抗tigit抗体作为一抗从2μg/ml开始，5倍梯度稀释加入酶标板，共8个浓度，浓度分别为2000ng/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.64ng/ml、0.128ng/ml、0ng/ml，37℃孵育1.5h；用1
×
pbst清洗5次后，二抗使用anti-human igg hrp(jackson，109-035-003，1:10000)，37℃孵育40min。用1xpbst清洗5次后，加入显色液tmb，终止后利用酶标仪(thermo，multiskan fc)读取od450值。使用graphpad生成ec50，结果如表12所示。
[0375]
表12抗tigit抗体与人tigit结合活性
[0376][0377]
实验结果显示本发明的抗tigit抗体shs006-17chi、shs006-t-hu17-31、shs006-23chi、shs006-t-hu23-53均具有较好的与人tigit结合能力。
[0378]
实施例9抗tigit抗体与细胞表面tigit结合活性测定(facs)
[0379]
采用facs分析抗体的结合活性。htigit-cho-k1细胞以每孔1x105个细胞的方式铺细胞板，置于37℃，5％co2的条件下过夜培养；第二天用cell stanining buffer洗涤2遍；
本发明提供的抗tigit抗体作为一抗从2μg/ml开始，梯度稀释加入细胞板，共8个浓度，浓度分别为2000ng/ml、400ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、4ng/ml、0.8ng/ml、0.16ng/ml，阳性对照抗体为22g2，37℃孵育1h；cell stanining buffer洗涤2遍；二抗使用pe anti-human igg fc(biolegend，409304，1.2ul/孔)，4℃避光孵育30min；cell stanining buffer洗涤2遍后利用流式细胞仪(aceabio，novocyte)测定585nm波长下mean值。使用graphpad生成ec50，结果如表13所示。
[0380]
表13抗tigit抗体与细胞表面tigit结合活性
[0381][0382][0383]
实验结果显示，本发明的人源化抗tigit抗体shs006-t-hu23-53、shs006-t-hu17-31均可与细胞表面tigit结合，且结合能力优于抗体22g2。
[0384]
实施例10抗tigit抗体与人tigit蛋白的亲和力测定
[0385]
利用fortebio octet对实施例1、2中制得的人源化抗tigit抗体结合抗原tigit-his的亲和力进行测定。将所述人源化抗tigit抗体用sd缓冲液(pbst 0.02％tween20 0.1％bsa)稀释到浓度5μg/ml，抗原tigit-his用sd缓冲液4倍浓度梯度稀释，使其浓度为1μg/ml、0.25μg/ml、0.0625μg/ml、0μg/ml，选用sa传感器固化该抗原，按fortebio octet red96的操作规程进行亲和力测定，具体参数及实验结果如表14所示。
[0386]
表14与人tigit蛋白的亲和力测定
[0387][0388]
实验结果显示，本发明的人源化抗tigit抗体shs006-t-hu17-31、shs006-t-hu23-53与人tigit蛋白具有较高的亲和力。
[0389]
实施例11 elisa检测阻断tigit与cd155的结合活性
[0390]
采用elisa分析抗体的阻断活性。将人cd155-hfc蛋白(1μg/孔)包被到96孔酶标板，37℃孵育2h。用1
×
pbst清洗3次后用5％的脱脂牛奶4℃封闭过夜。用1
×
pbst清洗3次后，本发明提供的抗tigit抗体与tigit-mfc混合作为一抗，其中抗tigit抗体从5μg/ml开始，梯度稀释加入酶标板，共8个浓度，浓度分别为5000ng/ml、1667ng/ml、556ng/ml、278ng/ml、139ng/ml、46ng/ml、15ng/ml、0ng/ml，阳性对照抗体为22g2，tigit-mfc浓度恒定为1μg/ml，37℃孵育2h；用1
×
pbst清洗5次后，二抗使用goat anti mouse igg-hrp antibody
(abcam，ab6789，1:10000)，37℃孵育40min。用1xpbst清洗5次后，加入显色液tmb，终止后利用酶标仪(thermo，multiskan fc)读取od450值。使用graphpad生成ic50，结果如表15所示。
[0391]
表15抗tigit抗体阻断tigit与cd155的结合活性
[0392][0393]
实验结果显示本发明的人源化抗tigit抗体shs006-t-hu23-53、shs006-t-hu17-31均具有阻断人tigit与cd155结合的能力，且阻断能力优于抗体22g2。
[0394]
实施例12 facs检测阻断tigit与cd155的结合活性
[0395]
采用facs检测本发明提供的抗tigit抗体阻断tigit结合到细胞表面cd155的能力。hcd155-cho-k1阳性细胞株作为cd155提供者，在梯度稀释的抗tigit抗体存在的情况下，观察tigit-mfc与cd155-cho-k1的结合能力。二抗使用pe goat anti mouse igg(biolegend，405307，1.2ul/孔)来监测tigit-mfc的变化。22g2作为阻断tigit结合到细胞表面cd155的阳性对照。流式细胞仪(aceabio，novocyte)读取585nm波长下mean值，使用graphpad生成ic50，结果如表16所示。
[0396]
表16抗tigit抗体阻断tigit与cd155的结合活性
[0397][0398]
实验结果显示本发明的人源化抗tigit抗体shs006-t-hu17-31、shs006-t-hu23-53均具有阻断人tigit与cd155结合的能力，且阻断能力优于抗体22g2。
[0399]
实施例13抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体表达载体的构建及蛋白表达纯化
[0400]
1.抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体的表达载体构建
[0401]
本发明所用抗pd-l1抗体是通过用人pd-l1-his蛋白免疫小鼠后筛选得到的小鼠单克隆抗体pl-7(重链可变区序列为seq id no:37，轻链可变区序列为seq id no:41)、pl-16(重链可变区序列为seq id no:39，轻链可变区序列为seq id no:43)，将其人源化后筛选获得人源化单克隆抗体hupl7-21(重链可变区序列seq id no:50，轻链可变区序列seq id no:54)、hupl7-43(重链可变区序列seq id no:52，轻链可变区序列seq id no:56)、hupl16-42(重链可变区序列seq id no:61，轻链可变区序列seq id no:64)。
[0402]
本发明所用抗tigit抗体是通过用人tigit-his蛋白免疫小鼠后筛选得到的小鼠单克隆抗体t-23(重链可变区序列为seq id no:76，轻链可变区序列为seq id no:78)，将其人源化后筛选获得人源化单克隆抗体hut23-53(重链可变区序列为seq id no:99，轻链可变区序列为seq id no:101)。
[0403]
本发明利用上述抗pd-l1和抗tigit的人源化抗体的可变区序列，构建了涉及两种结构的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体。这两种结构分别是以scfab为元件构成的非对称结构(如本实施例中双特异性抗体hupl721-t2353-scfab)及以scfv为元件构成的对称结构(如本实施例中双特异性抗体hupl721-t2353-scfv)。其中scfab结构的双特异性抗体如图1所示，具体为该双特异性抗体是由两条分别抗pd-l1和抗tigit的抗体单链通过异源二聚化而形成；区别于天然igg抗体，该双特异性抗体中抗pd-l1或抗tigit抗体的轻链都通过额外添加的柔性连接肽连接至抗体重链n端，该连接肽包含甘氨酸(g)和丝氨酸(s)残基，包含ggggs重复序列，优选包含8个ggggs的重复序列；此外，为促进异源二聚体的形成，在上述s228p或s228p/l235e突变的基础上，在抗tigit抗体单链的ch3 domain再增加s354c/t366w突变，在抗pd-l1抗体单链的ch3 domain再增加y349c/t366s/l368a/y407v突变。scfv结构的双特异性抗体如图2所示，具体为将tigit抗体的scfv重链通过一段柔性连接肽连接至完整的抗pd-l1抗体重链c端，该连接肽包含甘氨酸(g)和丝氨酸(s)残基，包含ggggs重复序列，优选包含8个ggggs的重复序列。此外，在上述的两种结构双特异性抗体中，均可在重链可变区vh44位和轻链可变区vl100位同时引入半胱氨酸突变，使得其形成vh44-vl100的二硫键，以增加抗体结构的稳定性。
[0404]
本发明的非对称结构双特异性抗体序列示意结构:
[0405]
肽链1：
[0406][0407]
肽链2：
[0408][0409]
本发明的对称结构双特异性抗体序列示意结构:
[0410]
肽链1：
[0411][0412]
肽链2：
[0413][0414]
其中igg4ch/ks表示igg4恒定区(s228p、y349c、t366s、l368a、y407v突变)，igg4ch/hs表示igg4恒定区(s228p、s354c、t366w突变)，igg4ch/pe表示igg4恒定区(s228p、l235e突变)。
[0415]
根据上述非对称结构形式，利用抗pd-l1抗体hupl7-21和抗tigit抗体hut23-53的可变区序列，构建双特异性抗体hupl721-t2353-scfab的表达载体scfab-t2353-knob-phr(序列为seq id no:102所示)和hupl721-scfab-hole-phr(序列为seq id no:103所示)；
[0416]
根据上述对称结构形式，利用抗pd-l1抗体hupl7-21和抗tigit抗体hut23-53的可变区序列，构建双特异性抗体hupl721-t2353-scfv的表达载体pl721-t2353-scfv-hc-phr
(序列为seq id no:104所示)和hupl721-vl1-phr(序列为seq id no:105所示)；
[0417]
根据上述非对称结构形式，利用抗pd-l1抗体hupl7-43和抗tigit抗体hut23-53的可变区序列，构建双特异性抗体hupl743-t2353-scfab的表达载体scfab-t2353-knob-phr(序列为seq id no:102所示)和hupl743-scfab-hole-phr(序列为seq id no:106所示)；
[0418]
根据上述对称结构形式，利用抗pd-l1抗体hupl7-43和抗tigit抗体hut23-53的可变区序列，构建双特异性抗体hupl743-t2353-scfv的表达载体pl743-t2353-scfv-hc-phr(序列为seq id no:107所示)和hupl743-vl3-phr(序列为seq id no:108所示)；
[0419]
根据上述非对称结构形式，利用抗pd-l1抗体hupl16-42和抗tigit抗体hut23-53的可变区序列，构建双特异性抗体hupl1642-t2353-scfab的表达载体scfab-t2353-knob-phr(序列为seq id no:102所示)和hupl1642-scfab-hole-phr(序列为seq id no:109所示)；
[0420]
根据上述对称结构形式，利用抗pd-l1抗体hupl16-42和抗tigit抗体hut23-53的可变区序列，构建双特异性抗体hupl1642-t2353-scfv的表达载体pl1642-t2353-scfv-hc-phr(序列为seq id no:110所示)和hupl1642-vl2-phr(序列为seq id no:111所示)；
[0421]
2.抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体的表达和纯化
[0422]
1)抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体的表达
[0423]
在1l细胞培养瓶中接种密度为1.0
×
106个/ml的hek293e细胞，加入新鲜的预热的freestyle 293表达培养基，使接种后总体积达到250ml，置37℃，8％co2，加湿的co2培养箱中培养过夜。取8ml freestyle 293表达培养基，加入1mg/ml的pei溶液500ul，混合均匀，取250μg待转染的表达载体加入8.0ml freestyle 293表达培养基中，混合均匀，其中双特异性抗体按照两载体比为1:1共同转染。将pei与freestyle 293表达培养基的混合溶液加入到质粒中，混合均匀，然后加入细胞培养物中，置37℃，8％co2，加湿的co2培养箱中培养。在细胞转染后第1天和第3天对细胞进行补料，每瓶加入2.5ml的谷氨酰胺(母液浓度为200mm)、每250ml加入12.5ml的opm-cho pff05和5ml的葡萄糖(母液浓度为180g/l)。当细胞细胞活力降至65％～75％时，收集细胞上清。将细胞培养物1500rpm离心5min，收集上清，再8000rpm离心20min，收集上清。
[0424]
2)亲和层析柱纯化
[0425]
利用akta(ge，akta pure-150)根据蛋白性质采用不同的亲和层析柱进行纯化(抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体适配的亲和层析柱见表17)，具体纯化步骤如下：
[0426]
表17抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体适配的亲和层析柱
[0427][0428][0429]
清洗：超纯水清洗设备及管路2min，流速10ml/min，后用0.1m naoh清洗层析系统；
[0430]
接柱：将层析柱接入层析设备，并用超纯水冲洗5min；后0.1m naoh冲洗30min，保留时间5min；
[0431]
平衡：20mm pb 0.15m nacl，ph 7.2平衡5个cv(柱体积)；
[0432]
上样：将细胞表达上清上样，保留时间5min；
[0433]
后平衡：20mm pb 0.15m nacl，ph 7.2平衡5个cv；
[0434]
洗脱：50mm醋酸，ph＝3.4洗脱，保留时间5min。uv280至50mau左右时开始收集，降至50mau左右时停止收集。用1m tris-hcl，ph 9.0将样品ph调节至7.0；
[0435]
再平衡：20mm pb 0.15m nacl，ph 7.2平衡3个cv，保留时间5min；
[0436]
在线清洗：0.1m naoh清洗30min，保留时间5min；
[0437]
清洗保存：纯化水清洗10min，然后加入20％乙醇2个cv。
[0438]
纯化获得的抗体hupl721-t2353-scfab/scfv、hupl743-t2353-scfab/scfv、hupl1642-t2353-scfab/scfv经sds-page和sec-hplc鉴定纯度。如若纯度低于95％，则进行进一步精纯，从而获得sec纯度＞95％的双特异性抗体分子用于后续实验。
[0439]
实施例14抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体与人pd-l1蛋白结合活性的测定
[0440]
采用facs法分析抗体的结合活性。hpd-l1-cho-k1细胞以每孔1.5
×
105个细胞的方式铺细胞板；本发明提供的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体作为一抗从10μg/ml开始，梯度稀释加入细胞板，共8个浓度，浓度分别为10000ng/ml、2000ng/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.64ng/ml、0.128ng/ml，4℃孵育1.5h；稀释液(pbs 2％fbs)洗涤2遍；二抗使用pe anti-human igg fc(abcam，ab98596，0.8ul/孔)，4℃避光孵育60min；稀释液洗涤2遍后利用流式细胞仪(aceabio，novocyte)测定585nm波长下mean值。数据处理时将质量浓度换算为摩尔浓度后使用graphpad生成ec50，结果如表18所示。
[0441]
表18抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体与人pd-l1蛋白结合活性
[0442][0443]
实验结果显示本发明提供的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体hupl721-t2353-scfab、hupl1642-t2353-scfv、hupl721-t2353-scfv和hupl743-t2353-scfv均具有较好的与pd-l1结合能力。
[0444]
实施例15抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体与人tigit结合活性的测定
[0445]
采用facs法分析抗体的结合活性。htigit-cho-k1细胞以每孔1.5
×
105个细胞的方式铺细胞板；本发明提供的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体作为一抗从2μg/ml开始，梯度稀释加入细胞板，共8个浓度，浓度分别为2000ng/ml、400ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、4ng/ml、0.8ng/ml、0.16ng/ml，4℃孵育1.5h；稀释液(pbs 2％fbs)洗涤2遍；二抗使用pe anti-human igg fc(abcam，ab98596，0.8ul/孔)，4℃避光孵育60min；稀释液洗涤2遍后利用流式细胞仪(aceabio，novocyte)测定585nm波长下mean值。数据处理时将质量浓度换算为摩尔浓度后使用graphpad生成ec50，结果如表19所示。
[0446]
表19抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体与人tigit结合活性
[0447]
[0448]
实验结果显示本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体hupl721-t2353-scfab、hupl721-t2353-scfv均具有较好的与pd-l1结合的能力。
[0449]
实施例16抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体阻断pd-l1与pd-1结合的活性检测
[0450]
采用facs法分析抗体的结合活性。hpd-l1-cho-k1细胞以每孔2.5
×
105个细胞的方式铺细胞板；本发明提供的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体梯度稀释后与终浓度为2μg/ml的pd-1-mfc混合均匀后作为一抗，其中抗体的梯度稀释方法为：从20μg/ml开始，3倍梯度稀释加入细胞板，共8个浓度，浓度分别为20000ng/ml、6666.66ng/ml、2222.22ng/ml、740.74ng/ml、246.9ng/ml、82.3ng/ml、27.4ng/ml、9.14ng/ml，4℃孵育1.5h；稀释液(pbs 2％fbs)洗涤2遍；二抗使用pe anti-mouse igg fc(biolegend，405307，0.8ul/孔)，4℃避光孵育60min；稀释液洗涤2遍后利用流式细胞仪(aceabio，novocyte)测定585nm波长下mean值。数据处理时将质量浓度换算为摩尔浓度后使用graphpad生成ic50，结果如表20所示。
[0451]
表20抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体阻断pd-l1与pd-1结合的活性
[0452][0453]
实验结果显示本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体hupl721-t2353-scfab、hupl721-t2353-scfv均具有阻断pd-l1与pd-1结合的能力。
[0454]
实施例17抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体阻断tigit与cd155结合的活性检测
[0455]
采用facs法分析抗体的阻断活性。htigit-cho-k1细胞以每孔2.5
×
105个细胞的方式铺细胞板；本发明提供的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体梯度稀释后与终浓度为0.4μg/ml的tigit-mfc混合均匀后作为一抗，其中抗体的梯度稀释方法为：从20μg/ml开始，梯度稀释加入细胞板，共8个浓度，浓度分别为20000ng/ml、4000ng/ml、800ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、33.33ng/ml、11.11ng/ml，4℃孵育1.5h；稀释液(pbs 2％fbs)洗涤2遍；二抗使用pe anti-mouse igg fc(biolegend，405307，0.8ul/孔)，4℃避光孵育60min；稀释液洗涤2遍后利用流式细胞仪(aceabio，novocyte)测定585nm波长下mean值。数据处理时将质量浓度换算为摩尔浓度后使用graphpad生成ic50，结果如表21所示。
[0456]
表21抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体阻断tigit与cd155结合的活性
[0457][0458]
实验结果显示本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体hupl721-t2353-scfab、hupl721-t2353-scfv、hupl1642-t2353-scfab和hupl1642-t2353-scfv均具有较好的阻断tigti与cd155结合的能力。
[0459]
实施例18抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体的亲和力检测
[0460]
利用fortebio octet对实施例15中制得的人源化抗tigit/抗pd-l1抗体结合抗原
pd-l1-his和tigit-his的亲和力分别进行测定。先将抗体hupl721-t2353-scfab/scfv、hupl743-t2353-scfab/scfv、hupl1642-t2353-scfab/scfv稀释到67nm，选用ahc传感器固化上述抗体，将pd-l1-his用sd缓冲液(0.02％tween20 0.1％bsa溶液)梯度稀释到2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml，tigit-his用sd缓冲液梯度稀释到0.5μg/ml、0.1μg/ml、0.02μg/ml，按fortebio octet red96的操作规程进行亲和力测定，具体参数及实验结果如表22、表23所示。
[0461]
表22抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体与人pd-l1蛋白的亲和力测定
[0462][0463]
表23抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体与人tigit蛋白的亲和力测定
[0464][0465][0466]
实验结果显示，本发明的抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体hupl1642-t2353-scfab、hupl1642-t2353-scfv、hupl721-t2353-scfab和hupl721-t2353-scfv具有较好的与人pd-l1蛋白的亲和力以及与人tigit蛋白的亲和力。
[0467]
实施例19抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体的体外药效检测
[0468]
采用seb(金黄色葡萄球菌肠毒素b)两次刺激pbmc(外周血单核细胞)的方法来检测本发明的双特异性抗体的体外药效。
[0469]
按所需细胞量复苏pbmc，加到8-9ml的imdm完全培养基中，1200rpm离心10min，弃上清；用适量培养基重悬，用血球计数板计数，加入到6孔板中，同时加入终浓度为100ng/ml的seb溶液，孵育48h；48h后，1200rpm离心10min，弃上清，使用imdm完全培养基洗涤1-2次，
用适量培养基重悬，用血球计数板计数，并重悬为1m/ml，100μl/孔加入96孔板中；按4倍浓度(即80μg/ml)，50μl/孔，用imdm完全培养基配制对照igg4(isotype)，做好标记，涡旋；将抗体溶液加入对应孔中，对照组加入50μl/孔的培养基，96孔板置于37℃孵箱中，细胞和抗体孵育1h；1h后，按4倍浓度(400ng/ml)，50μl/孔用量，用imdm完全培养基配制seb溶液，加入对应孔中；96孔板置于37℃，5％co2孵箱中孵育48h后，离心去除上清收集无细胞上清150μl，按一定比例稀释后，按照hifn-γ(r&d system cat：dy285b)elisa检测试剂盒说明书检测上清中ifn-γ的浓度。结果如表24所示。
[0470]
表24本发明抗体对ifn-γ释放的影响
[0471][0472][0473]
实验结果显示，本发明的抗体具有较好的促ifn-γ释放能力。抗体hupl16-42和hupl7-21与抗体hut23-53联用效果优于抗体单用。双特异性抗体hupl721-2353促ifn-γ释放具有剂量依赖性。hupl721-t2353-scfv在一半摩尔数的情况下依然优于联用组[对于单抗联用组20μg/ml 20μg/ml、scfab双抗组40μg/ml和scfv双抗组26.8μg/ml，这三组浓度是针对tigit和pd-l1两种抗原结合臂的数量均相等的浓度(称“等臂”浓度)；相对于单抗联用组20μg/ml 20μg/ml，scfab双抗组20μg/ml和scfv双抗组13.4μg/ml的浓度相当于是结合臂数量减半的浓度；从摩尔数的角度来说，单抗联用组20μg/ml 20μg/ml中两种分子的总摩尔数与scfab双抗组40μg/ml的摩尔数相等，scfv双抗组26.8ul/ml摩尔数仅为联用组20μg/ml 20μg/ml和scfab双抗组40μg/ml的一半]。
[0474]
实施例20抗pd-l1/抗tigit双特异性抗体对小鼠体内移植瘤生长抑制的检测(raji-pbmc-nsg模型)
[0475]
本发明利用nsg小鼠(购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，中国)、raji-pd-l1肿瘤细胞(购自宜明昂科生物医药技术有限公司，中国)建立肿瘤移植模型——raji-pbmc-nsg模型，研究本发明的抗体在raji-hpd-l1淋巴瘤皮下移植模型中的抗肿瘤作用。抗
pd-l1阳性对照抗体为atezolizumab(sino biological，cat:68049-h001)。表25为测试药物在raji-pbmc-nsg肿瘤模型中的抗肿瘤作用实验设计方案。
[0476]
表25raji-pbmc-nsg模型测试药物实验设计方案
[0477][0478]
*：n是指每组小鼠的数量；i.p.：腹腔注射；biw指每周给药2次。
[0479]
各组的肿瘤抑制率(tgi
tv
)％如表26所示。
[0480]
表26各抗体对raji-pbmc-nsg模型小鼠肿瘤体积的影响
[0481][0482]
本发明的抗体hupl7-21、hupl721-t2353-scfab体内抑瘤效果显著优于atezolizumab。
[0483]
实施例21抗pd-l1/抗tigit双特异性抗体对小鼠体内移植瘤生长抑制的检测(mc38-hpd-l1结肠癌模型)
[0484]
采用b-hpd-l1/htigit双人源化小鼠(购于北京百奥赛图基因生物技术有限公司，中国)mc38-hpd-l1结肠癌(细胞购于舜冉上海生物科技有限公司，中国)的动物模型进行药效实验。将pbs重悬的mc38-hpd-l1结肠癌细胞以5
×
105个/0.1ml浓度，0.1ml/只体积接种于b-hpd-l1/htigit人源化小鼠的右侧皮下。当平均肿瘤体积达到98mm3时，根据小鼠肿瘤体积和体重选择合适的小鼠入组，平均分配到6个实验组中，每组8只，分组当天开始给药，具体给药方案见表27。
[0485]
表27 b-hpd-l1/htigit双人源化小鼠mc38-hpd-l1结肠癌动物模型实验给药方案
[0486][0487]
注：pbs：生理盐水对照组；
[0488]
a：给药体积依实验动物体重按10μl/g计算；
[0489]
b：biw指每周给药2次。
[0490]
记录结果并计算肿瘤抑制率(tgi
tv
)。
[0491]
在实验终点(即分组给药第24天)，atezolizumab在3mg/kg剂量下的抑瘤率为35.3％；hupl721-t2353-scfab在3.14mg/kg和6.27mg/kg剂量下的抑瘤率分别为30.6％和50.7％。实验结果表明抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体hupl721-t2353-scfab对mc38-hpd-l1肿瘤皮下移植瘤生长有明显的抑制作用，且具有剂量依赖性。
[0492]
以上实施例证明本发明提供的抗tigit抗体、抗pd-l1抗体、抗tigit/抗pd-l1双特异性抗体可明显抑制肿瘤增长，具有显著的抗肿瘤作用，提示这些抗体可在制备抗肿瘤药物中应用，具有好的市场前景。
[0493]
尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。