一种急性胰腺炎细胞模型的构建方法和用途与流程

1.本发明属于细胞模型领域，具体涉及一种急性胰腺炎细胞模型的构建方法和用途。


背景技术：

2.急性胰腺炎(acute pancreatitis，ap)是由多种病因导致胰腺组织自身消化所致的胰腺水肿、出血及坏死等炎性损伤。临床主要表现为急性、持续的中上腹疼痛，伴有恶心、呕吐等，血淀粉酶或脂肪酶升高超过正常值上限的3倍，同时伴有典型影像学改变，重症患者炎症波及全身，常常合并局部或全身并发症，预后较差。胰腺炎特征性的表现包括高淀粉酶血症，消化酶在腺泡内异常活化(如胰蛋白酶原变为胰蛋白酶)，腺泡细胞中大空泡的积聚，促炎介质的释放(如关键转录因子nf-k b)导致炎症细胞侵入胰腺和全身炎症反应，进而引起凋亡和坏死，最终引起腺泡细胞的死亡。目前普遍认为急性胰腺炎开始于胰腺腺泡细胞，胰腺腺泡细胞坏死能够诱发强烈的炎症反应，进而导致急性胰腺炎。
3.急性胰腺炎是一种发病率和死亡率很高的可导致死亡的疾病，它的病理机制尚不明确，目前尚无特殊或有效的治疗方法。为了进一步研究急性胰腺炎的发展机制，并开发出有效治疗急性胰腺炎的药物，构建急性胰腺炎体外模型具有重要意义。
4.雨蛙素(caerulein)，又名雨蛙肽，是澳大利亚产的蛙hylacaerulea的皮肤提取物。它是一种胆囊收缩素类似物，作用于胰腺腺泡细胞可引起大量消化酶和胰液的分泌，从而导致急性水肿性胰腺炎。文献(中国现代医学杂志，2014年6月，第24卷第18期)报道了应用雨蛙肽刺激大鼠胰腺腺泡细胞ar42j细胞24小时来构建急性胰腺炎体外细胞模型的方法。但是，该方法采用的刺激物雨蛙素价格昂贵，难以获得，增加了构建急性胰腺炎细胞模型的成本；此外，该方法需要处理24小时，时间较长，增加了构建急性胰腺炎细胞模型的时间。因此，开发出一种成本更低、时间更短的构建急性胰腺炎细胞模型的新方法具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种急性胰腺炎细胞模型的构建方法和用途。
6.本发明提供了葡萄糖在构建急性胰腺炎细胞模型中的用途。
7.本发明还提供了葡萄糖与脂肪酸联用在构建急性胰腺炎细胞模型中的用途。
8.进一步地，所述脂肪酸为棕榈酸、油酸中的一种或两种。
9.本发明还提供了一种急性胰腺炎细胞模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：将胰腺腺泡细胞与葡萄糖共同孵育，得到急性胰腺炎细胞模型。
10.本发明还提供了另一种急性胰腺炎细胞模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：将胰腺腺泡细胞与葡萄糖和脂肪酸共同孵育，得到急性胰腺炎细胞模型。
11.进一步地，所述脂肪酸为棕榈酸、油酸中的一种或两种。
12.进一步地，所述脂肪酸为棕榈酸和油酸；其中，棕榈酸的浓度为150～250μm，优选
为200μm，油酸的浓度为150～250μm，优选为200μm。
13.进一步地，所述共同孵育的温度为室温，时间为30min以上；
14.所述葡萄糖的浓度20mm以上；
15.所述胰腺腺泡细胞为动物胰腺腺泡细胞。
16.进一步地，所述共同孵育的时间为12小时以上；
17.所述葡萄糖的浓度25～100mm；
18.所述胰腺腺泡细胞为小鼠胰腺腺泡细胞。
19.本发明还提供了上述方法构建的急性胰腺炎细胞模型在筛选预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的用途。
20.本发明首次发现葡萄糖处理能够显著增加胰腺腺泡细胞坏死数量，显著降低半最大效应时间，成功构建急性胰腺炎细胞模型。本发明首次发现葡萄糖联合脂肪酸处理能够进一步增加诱导胰腺腺泡细胞坏死程度，成功构建急性胰腺炎细胞模型。
21.本发明的建模方法采用的原料易得，价格便宜，降低了建模成本；本发明的建模方法在较短的时间内就能成功构建急性胰腺炎细胞模型，缩短了建模时间。本发明的建模方法方便快捷，容易操作，成本较低，具有良好的可重复性。
22.本发明构建的急性胰腺炎细胞模型不仅可以用于急性胰腺炎治疗药物的筛选，还能够为急性胰腺炎的发生发展机制提供良好的平台。
23.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
24.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
25.图1葡萄糖处理胰腺腺泡细胞后的多功能荧光酶标仪测试结果：
26.(a)25mm葡萄糖处理荧光时间变化图；(b)50mm葡萄糖处理荧光时间变化图；(c)100mm葡萄糖处理荧光时间变化图；(d)25、50、100mm葡萄糖处理荧光时间变化图；(e)半最大效应(half-maximal response，hmr)时间统计结果。图中，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。图2葡萄糖联合脂肪酸处理胰腺腺泡细胞后的多功能荧光酶标仪测试结果：(a)荧光时间变化图；(b)半最大效应(half-maximal response，hmr)时间统计结果。图中，**表示p《0.01，***表示p《0.001。
27.图3葡萄糖联合脂肪酸处理胰腺腺泡细胞后的荧光显微镜法测试结果：
28.(a)细胞荧光染色代表图；(b)细胞坏死比率结果。图中，***表示p《0.001。
具体实施方式
29.本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
30.实施例1：构建糖脂代谢紊乱病相关急性胰腺炎细胞模型的方法
31.一、实验方法
32.1、实验动物
33.spf级雄性c57bl/6j小鼠(7-8周)购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证：scxk(京)2020-0004。于四川大学华西医院实验动物中心动物房分笼饲养，每5只一笼，恒温(25
±
2℃)且照明控制(12h白天/黑夜循环)，自由摄食、饮水，适应性喂养1周后正式开始实验。本实验由四川大学华西医院实验动物中心伦理委员会审核通过，所有的动物实验及相关操作均按照学校和国家标准执行。
34.2、新鲜分离小鼠胰腺腺泡细胞
35.提前配制4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)溶液和胶原酶溶液。将小鼠颈椎脱臼处死后，消毒腹部，开腹迅速取出胰腺组织。将37℃预热好的胶原酶溶液沿主胰管注入胰腺组织至各小叶充盈透亮。将注射充盈的胰腺组织及胶原酶一起37℃水浴消化17min。消化结束后，吸出胰腺组织至适量hepes溶液，进行吹打。吹打后静置沉淀，将上清不断转移至70μm细胞筛过滤。重复以上吹打、静置、过滤步骤至胰腺组织基本消化，无法吹下细胞为止。将所得细胞悬液260g室温离心2min后，倒去上清；重复一次再加入4-6ml hepes溶液重悬混匀后即得小鼠胰腺腺泡细胞。取少量小鼠胰腺腺泡细胞重悬液于玻片上，在4
×
、10
×
视野下分别观察细胞形态(圆润透亮为细胞状态好；胰腺腺泡细胞易成团，3-4个细胞成团时细胞密度适宜)。
36.3、细胞处理
37.3.1葡萄糖处理：用不同浓度葡萄糖(hg，25、50、100mm)的hepes溶液在室温下孵育新鲜分离胰腺腺泡细胞(细胞密度为5-10
×
106个/ml)，以相同浓度甘露醇(25、50、100mm)的hepes溶液为渗透压对照组。使用多功能荧光酶标仪法实时检测孵育12小时内的细胞坏死情况。
38.3.2葡萄糖联合脂肪酸处理：用不同浓度葡萄糖(25、50mm)联合脂肪酸(棕榈酸：pa,200μm；油酸：oa,200μm)在室温下孵育新鲜分离胰腺腺泡细胞(细胞密度为5-10
×
106个/ml)，以不添加任何刺激物作为空白组。使用多功能荧光酶标仪法实时检测孵育12小时内的细胞坏死情况，使用荧光显微镜法检测孵育30min后的细胞坏死情况。
39.其中，使用多功能荧光酶标仪法实时检测细胞坏死情况的方法如下：
40.采用坏死细胞荧光探针碘化丙啶(propidium iodide，pi)标记细胞并使用多功能酶标仪检测其荧光随时间的变化。简单来说，向分离新鲜小鼠胰腺腺泡细胞中加入6ml含pi探针的hepes溶液，pi终浓度为1.5μmol/l，注意避光。20min后，将细胞悬液转移至黑色透明平底96孔板，采用多功能荧光酶标仪测定荧光变化，设置激发光为535nm，发射光为617nm，读数间隔为120s每次。首先记录20min以内的荧光值(即前10个点)，记为基线；再按照预先计算好的浓度加入刺激物，记录各时间点的荧光值；记基线荧光值的平均值为f0，各时间点荧光值为f，时间荧光曲线图以f/f0表示。每次实验各组均有4个复孔，相同的实验均独立重复3次以上，计算多次实验的平均值和标准误绘制时间荧光曲线图。计算半最大效应(half-maximal response，hmr)时间，hmr＝最大死亡效应时间/2。
41.使用荧光显微镜法检测细胞坏死情况的方法如下：
42.将新鲜分离好的腺泡细胞平均分为空白组(ctrl)、模型组(hg pa oa)，每组1ml反应体系。模型组给予葡萄糖(25mm)联合脂肪酸(棕榈酸，pa,200μm；油酸，oa,200μm)室温孵育30min。孵育结束后，260g室温离心2min，加入0.5ml hepes溶液重悬，再分别加入pi(终浓度为0.25μmol/l)和hoechest33342核酸染色剂(终浓度为50μg/ml)充分混匀。取20μl细胞
溶液置于载玻片上，盖上盖玻片静止后，于正置荧光显微镜下拍照。采用hoechest33342染色(蓝色荧光)计数总细胞，pi染色(红色荧光)计数坏死细胞，用坏死细胞数量除以细胞总数再取百分数，即为坏死比率。每次实验独立重复三次。
43.二、实验结果
44.1、葡萄糖处理对胰腺腺泡细胞坏死的影响
45.多功能荧光酶标仪测试结果如图1所示，可以看出，与对照组相比，葡萄糖处理后的胰腺腺泡细胞坏死数量显著增加，hmr时间显著降低。
46.此外，胰腺腺泡细胞坏死数量随葡萄糖浓度的增加而增加，hmr时间随葡萄糖浓度的增加而降低，表明胰腺腺泡细胞的坏死程度随葡萄糖浓度的增加而增加。
47.上述实验结果表明，本发明用葡萄糖处理的方法能够诱导胰腺腺泡细胞坏死，成功构建糖脂代谢紊乱病相关急性胰腺炎细胞模型。
48.2、葡萄糖联合脂肪酸处理对胰腺腺泡细胞坏死的影响
49.多功能荧光酶标仪检测结果如图2所示，可以看出，与空白照组相比，葡萄糖联合脂肪酸处理30min后的胰腺腺泡细胞坏死数量就显著增加，并且随着处理时间的延长，葡萄糖联合脂肪酸处理组的胰腺腺泡细胞坏死数量越来越多。与空白照组相比，葡萄糖联合脂肪酸处理后的胰腺腺泡细胞坏死数量显著增加，hmr时间显著降低。
50.此外，葡萄糖联合脂肪酸处理能够诱导胰腺腺泡细胞坏死，并且，与葡萄糖(25mm)联合脂肪酸(棕榈酸，200μm；油酸，200μm)组相比，葡萄糖(50mm)联合脂肪酸(棕榈酸，200μm；油酸，200μm)组诱导胰腺腺泡细胞坏死的作用更佳；与葡萄糖(25mm)联合脂肪酸(棕榈酸，200μm；油酸，200μm)组相比，葡萄糖(50mm)联合脂肪酸(棕榈酸，200μm；油酸，200μm)组的hmr时间显著降低，表明胰腺腺泡细胞的坏死程度随联合处理药物中葡萄糖浓度的增加而增加。
51.结合图1和图2的数据还可以看出，与单独采用葡萄糖处理相比，葡萄糖联合脂肪酸处理能够进一步降低hmr时间，提高胰腺腺泡细胞的坏死程度。
52.荧光显微镜法检测结果如图3所示，可以看出，与空白组相比，葡萄糖(25mm)联合脂肪酸(棕榈酸，200μm；油酸，200μm)处理30min后能够显著提高胰腺腺泡细胞坏死比率，与多功能荧光酶标仪检测结果一致。
53.上述实验结果表明，本发明葡萄糖联合脂肪酸(棕榈酸和油酸)处理的方法能够诱导诱导胰腺腺泡细胞坏死，成功构建糖脂代谢紊乱病相关急性胰腺炎细胞模型。
54.综上，本发明提供了一种急性胰腺炎细胞模型的构建方法和用途。本发明首次发现葡萄糖处理能够显著增加胰腺腺泡细胞坏死数量，显著降低半最大效应时间，成功构建急性胰腺炎细胞模型。本发明首次发现葡萄糖联合脂肪酸处理能够进一步增加诱导胰腺腺泡细胞坏死程度，成功构建急性胰腺炎细胞模型。本发明采用的原料易得，价格便宜，降低了建模成本；本发明在较短的时间内就能成功构建急性胰腺炎细胞模型，缩短了建模时间。本发明的建模方法方便快捷，容易操作，成本较低，具有良好的可重复性。本发明构建的急性胰腺炎细胞模型不仅可以用于急性胰腺炎治疗药物的筛选，还能够为急性胰腺炎的发生发展机制提供良好的平台，应用前景广阔。