一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂的制作方法

1.本发明属于微生物工程技术和棘皮动物病害防治领域，尤其涉及一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂。


背景技术：

2.刺参（apostichopus japonicus）属于棘皮动物门、海参纲，富含蛋白质、矿物质、维生素等多种天然活性物质，具有极高的滋补和药用价值，目前刺参养殖业已快速发展。“腐皮综合征”是刺参养殖过程中的常见疾病，具有暴发性强、感染速度快、死亡率高等特点。研究发现，灿烂弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌是引起刺参“腐皮综合征”的主要病原菌。由于食品安全、环境保护和抗药性等问题，用于抑制致病性弧菌的抗生素类药物正逐渐被水产养殖业所摈弃。因此，亟需开发绿色无公害的抗生素替代物来抑制致病性弧菌，以提高刺参的免疫机能及抗病能力。
3.沼泽红假单胞菌含有丰富的蛋白质、维生素、微量元素及生理活性物质，能够降解水体中的亚硝酸盐、硫化物等有毒物质，同时释放具有抗病力的酵素，不但能促进有益微生物的增殖，还能抑制许多致病菌的滋生。丁酸梭菌是一类具有内生芽孢结构的厌氧杆菌，是调节肠道微生态平衡的有益菌，其主要代谢产物丁酸是肠道细胞再生和修复的主要营养物质，在肠道内可以阻止致病菌的入侵和定植，纠正肠道菌群紊乱，调整宿主体内的微生态平衡。同时，丁酸梭菌在肠道内可产生维生素、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等物质，对机体具有良好的营养和保健作用。柞树叶和芦荟叶具有天然、营养、毒副作用小等特点。同时，柞树叶和芦荟叶也具有良好的体外抑菌能力，不仅对病原微生物有抑制作用，还可以有效提升机体的抗应激能力和抗病修复能力。
4.然而，迄今为止并没有关于将沼泽红假单胞菌、丁酸梭菌、柞树叶和芦荟叶合理配伍以提高生物效价的养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂。
6.本发明的技术解决方案是：一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂，其特征在于是由沼泽红假单胞菌（rhodopseudomonas palustris）、丁酸梭菌（clostridium butyricum）、柞树叶提取物及芦荟叶提取物混合为饲料添加剂，每克饲料中的添加量为沼泽红假单胞菌105~10
7 cfu、丁酸梭菌105~10
7 cfu、柞树叶提取物1~2 mg、芦荟叶提取物4~8 mg；所述柞树叶提取物和芦荟叶提取物按照如下方法制备：分别将柞树叶与芦荟叶用蒸馏水清洗干净，25 ℃通风阴干；用匀浆机分别将柞树叶与芦荟叶匀浆粉碎，加入体积分数为65~85%的乙醇溶液，料液比为0.05~0.1 g/ml；在工作频率为40 khz，功率为80 w的超声波作用下常温浸提1~2.5 h；将浸提液装入超滤膜装置内，在0.06 mpa压力条件下过滤去掉杂质，经减压浓缩、冷冻干燥得到冻干粉，即柞树叶提取物和芦荟叶提取物。
7.最佳技术方案是每克饲料中添加沼泽红假单胞菌10
6 cfu、丁酸梭菌10
6 cfu、柞树叶提取物1.5 mg、芦荟叶提取物6 mg。
8.所述沼泽红假单胞菌按照如下步骤制备而成：步骤1：将0.1 g活菌数为0.5
×
10
10
~10
10 cfu/g的沼泽红假单胞菌冻干粉菌剂充分溶解于1 ml无菌蒸馏水中，将菌种在固体培养基上划线活化，所述固体培养基组分为胰蛋白胨15.0 g/l，大豆胨5.0 g/l，氯化钠5.0 g/l及琼脂20 g/l，ph7.5~8.0；在光照度为2000~3000 lux，温度为30~35 ℃的条件下于厌氧培养箱中培养至平板出现红色单菌落；步骤2：挑取红色单菌落接种于沼泽红假单胞菌液体培养基中，培养温度为30~35℃，光照强度为2000~3000 lux，于厌氧培养箱中静置培养3~5天，所述液体培养基组分为胰蛋白胨15.0 g/l，大豆胨5.0 g/l及氯化钠5.0 g/l， ph7.5~8.0；步骤3：于6000 rpm离心10 min，收集菌体，用无菌海水重悬菌体。
9.所述固体培养基和液体培养基中还添加有如下组分：氯化镁0.1~0.3 g/l，硫酸亚铁2~5 mg/l，硫酸锌0.5~1.5 mg/l，氯化锰0.1~0.3 mg/l，氯化镍1~4 mg/l及吲哚乙酸0.3~0.8 mg/l。
10.所述丁酸梭菌按照如下步骤制备而成：步骤1：将0.1 g活菌数0.5
×
10
10
~10
10 cfu/g的丁酸梭菌冻干粉菌剂充分溶解于1 ml无菌蒸馏水中，将菌种在强化梭菌琼脂培养基上划线活化，厌氧培养箱37 ℃培养至平板出现圆形单菌落；所述强化梭菌琼脂培养基组分为蛋白胨10 g/l，牛肉粉10 g/l，酵母粉3 g/l，葡萄糖5 g/l，可溶性淀粉1 g/l，氯化钠5 g/l，醋酸钠3 g/l，半胱氨酸盐酸盐0.5 g/l，硫酸锰 0.15 g/l，磷酸氢二钾1.5 g/l，0.25 g/l氯化钙，硫酸镁 0.65 g/l及琼脂15 g/l，ph6.8~7.2；步骤2：挑取单菌落，接种于强化梭菌液体培养基中，静置于厌氧培养箱中37 ℃厌氧培养1~2天；所述强化梭菌液体培养基组分为蛋白胨10 g/l，牛肉粉10 g/l，酵母粉3 g/l，葡萄糖5 g/l，可溶性淀粉1 g/l，氯化钠5 g/l，醋酸钠3 g/l，半胱氨酸盐酸盐0.5 g/l，硫酸锰 0.15 g/l，磷酸氢二钾1.5 g/l，0.25 g/l氯化钙及硫酸镁 0.65 g/l，ph6.8~7.2；步骤3：于6000 rpm离心10 min，收集菌体，用无菌海水重悬菌体。
11.本发明首次将沼泽红假单胞菌、丁酸梭菌、柞树叶提取物和芦荟叶提取物科学配伍制成复合微生态制剂并应用于刺参养殖。沼泽红假单胞菌和丁酸梭菌均属于兼性厌氧菌种，不仅可有效避免菌种之间的相互拮抗作用，反而丁酸梭菌在代谢过程中产生的丁酸可中和碱性物质，作为沼泽红假单胞菌生长的碳源，促进沼泽红假单胞菌的生长，同时沼泽红假单胞菌和丁酸梭菌可促进刺参对柞树叶提取物和芦荟叶提取物的吸收和利用；柞树叶提取物和芦荟叶提取物的有效成分可以抑制丁酸梭菌和沼泽红假单胞菌中的杂菌且可为二者的生长提供碳源，既可提高丁酸梭菌和沼泽红假单胞菌存活率，又可促进丁酸梭菌的丁酸转化率。本发明各个组分的合理配伍可以形成联动效应，不仅可以增加刺参养殖水体含氧量，而且可以使单组分的免疫刺激作用得以提升且靶向性更明显，既能够显著增强刺参机体的免疫应答，更能作用于特定免疫细胞，从而有选择性地诱导机体形成针对特异性抗原的有效免疫应答，增强刺参的非特异性免疫机能和抗病能力，有效抑制致病性弧菌的滋生，具有较高的生物效价。本发明在保证无污染、无残留、无抗药性、无毒副作用的前提下，对提升刺参养殖效果、增加经济效益具有重要意义。
ml无菌蒸馏水中，将菌种在强化梭菌琼脂培养基（rcm）上划线活化，厌氧培养箱37 ℃培养1~2天，即培养至平板出现圆形单菌落；所述强化梭菌琼脂培养基组分为蛋白胨10 g/l，牛肉粉10 g/l，酵母粉3 g/l，葡萄糖5 g/l，可溶性淀粉1 g/l，氯化钠5 g/l，醋酸钠3 g/l，半胱氨酸盐酸盐0.5 g/l，硫酸锰 0.15 g/l，磷酸氢二钾1.5 g/l，0.25 g/l氯化钙，硫酸镁 0.65 g/l及琼脂15 g/l，ph6.8~7.2；步骤2：挑取单菌落，接种于强化梭菌液体培养基中，静置于厌氧培养箱中37 ℃厌氧培养1~2天，即培养至菌种增殖至对数生长期；所述强化梭菌液体培养基组分为蛋白胨10 g/l，牛肉粉10 g/l，酵母粉3 g/l，葡萄糖5 g/l，可溶性淀粉1 g/l，氯化钠5 g/l，醋酸钠3 g/l，半胱氨酸盐酸盐0.5 g/l，硫酸锰 0.15 g/l，磷酸氢二钾1.5 g/l，0.25 g/l氯化钙及硫酸镁 0.65 g/l，ph6.8~7.2；步骤3：于6000 rpm离心10 min，收集菌体，用无菌海水重悬菌体，采用麦氏比浊法调整菌液浓度。
23.实施例2：沼泽红假单胞菌、丁酸梭菌、柞树叶提取物以及芦荟叶提取物的制备过程基本同实施例1。不同之处是沼泽红假单胞菌培养温度为35 ℃，光照强度为3000 lux。柞树叶提取物以及芦荟叶提取物的乙醇浸提溶液体积分数为85%，料液比为0.1 g/ml，浸提时间为2.5 h。每克饲料中添加沼泽红假单胞菌10
7 cfu、丁酸梭菌10
5 cfu、柞树叶提取物2 mg、芦荟叶提取物8 mg；实施例3：沼泽红假单胞菌、丁酸梭菌、柞树叶提取物以及芦荟叶提取物的制备过程基本同实施例1。不同之处是沼泽红假单胞菌培养温度为33 ℃，光照强度为2500 lux。柞树叶提取物以及芦荟叶提取物的乙醇浸提溶液体积分数为75%，料液比为0.07 g/ml，浸提时间为2 h。每克饲料中添加沼泽红假单胞菌10
6 cfu、丁酸梭菌10
6 cfu、柞树叶提取物1.5 mg、芦荟叶提取物6 mg；实施例3中沼泽红假单胞菌和丁酸梭菌的菌落形态如图1所示，沼泽红假单胞细菌（a）为褐红色圆形菌落，菌落边缘整齐光滑，菌落直径为0.3 mm~0 .60 mm；丁酸梭菌（b）为乳白色圆形菌落，菌落表面光滑，有凸起，边缘整齐，菌落直径1 mm~3 mm。
24.实验：以下实验中刺参取自辽宁省海洋水产科学研究院引育种中心，刺参单体质量3.17
±
0.41 g，暂养于四个相同规格水族箱中（100 cm
×
80 cm
×
75 cm），每箱90头。水族箱分别编号a、b、c、d。刺参暂养一周后按照刺参体质量的5%投喂饲料，编号a、b、c的水族箱分别为实施例1、2、3组，对应投喂添加有本发明实施例1~3的复合微生态制剂的饲料，编号d的水族箱为对照组，投喂不添加复合微生态制剂的饲料。
25.饲养实验持续60天，共设3组平行，每个处理3次重复。期间每日投喂1次，投喂时间为下午15:00，饲养期间保持充气，每2天换水一次，海水温度16~18 ℃，ph7.5~8.3，盐度30。溶解氧不低于5 mg/l，氨氮不高于0.5 mg/l。在60天饲养实验结束后，分别用灿烂弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌对刺参进行攻毒实验。所用灿烂弧菌（mccc1a04096）、哈维氏弧菌（mccc1a00232）、副溶血弧菌（mccc1a16298）均购自海洋微生物菌种保藏管理中心。
26.攻毒实验采取浸浴方式，每组取25头刺参，设3组平行，致病弧菌的浸浴浓度为1
×
10
8 cfu/ml。攻毒期间正常投喂饲料，不换水，每天虹吸去除残饵和粪便。记录攻毒后15天内刺参的弧菌发病情况及累积死亡率。在攻毒实验开始前和结束后，分别在各水槽随机选取3头刺参，剖开腹腔获得体腔液。将刺参体腔液合并，4 ℃、3500 rpm离心10 min，取上清液用于测定免疫酶活性。采用南京建成科技有限公司测试盒测定刺参免疫酶活性，具体测定步骤按照试剂盒说明书进行。酶活检测实验重复3次，酶活力大小以比活力的形式表示，单位为u/mg蛋白。攻毒实验结束后，每组随机取3头刺参及3份水样，解剖刺参获得肠组织，用30 mlpbs缓冲液匀浆处理10 min，合并匀浆液。用无菌生理盐水分别将肠组织匀浆液和养殖水样稀释10倍，分别取0.05 ml稀释匀浆液及养殖水样涂布至tcbs弧菌选择性培养基，28 ℃倒置培养，24 h后统计刺参肠道及养殖水体弧菌数目。
27.复合微生态制剂对攻毒刺参免疫酶活性的影响如表1所示，在选定的酶活指标中，酸性磷酸酶（acp）和碱性磷酸酶（akp）是刺参体腔细胞内参与免疫防御活动的重要水解酶。超氧化物歧化酶（sod）是重要的抗氧化酶，可以清除机体内过量的氧自由基，修复受损细胞。溶菌酶（lsz）能切断细菌细胞壁肽聚糖中的糖苷键，引起细胞裂解，消除侵入机体内的致病菌。
28.表1复合微生态制剂对攻毒刺参免疫酶活性的影响从表1可以看出，在攻毒实验进行之前，实施例1~3组中刺参的免疫酶指标均明显高于对照例，表明在饲喂阶段刺参的免疫机能得到提升，复合微生态制剂的益生作用已经体现出来。攻毒实验结束之后，对照例刺参的免疫指标明显下降，表明其免疫酶活力受到致病弧菌感染的抑制，免疫功能遭到破坏。而各实施例组刺参的免疫指标与攻毒前差异不大，表明本发明复合微生态制剂可以提高刺参的磷酸酶响应能力，有效抑制氧化损伤，促进刺参适应病原菌的刺激，提高刺参的免疫机能。
29.各实验组对攻毒灿烂弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌刺参累积死亡率的影响如图2、图3、图4所示。结果表明：不同致病性弧菌攻毒后的首个死亡个体均出现在对照例，而各实施例中刺参的累积死亡率均明显低于对照例。其中，在灿烂弧菌及哈维氏弧菌攻毒后，实施例3中刺参的累积死亡率低于其他实施例。在副溶血弧菌攻毒后，实施例1中刺参的累积
死亡率低于其他实施例。
30.各实验组对攻毒刺参发病情况的影响如图5所示，对照例与各实施例刺参均出现不同程度的“腐皮综合征”典型症状，包括身体萎缩、摇头、排脏、化皮等。而各实施例刺参的体表溃疡面积均小于对照例，对外界刺激的反应能力、附着能力、相对免疫保护率也均高于对照例。
31.各实验组对灿烂弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌的抑制作用如图6、图7、图8所示，各实施例刺参肠道及养殖水体的灿烂弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌数目均明显少于对照例。其中，实施例1中复合微生态制剂对副溶血弧菌的抑制作用高于其他实施例，实施例3中复合微生态制剂对哈维氏弧菌的抑制作用高于其他实施例。
32.综合以上实验结果可以看出，本发明使用剂量小，各组分协同作用、彼此增效，可以广谱抵御多种致病性弧菌的侵袭感染，有效抑制病原菌在刺参肠道及养殖水体中的增殖，显著增强刺参的免疫机能和抗病能力。