一种含氨基酸复合液用于荔枝离体再生的产品及方法与应用与流程

1.本发明涉及一种含氨基酸复合液用于荔枝离体再生的产品及方法与应用，具体涉及一种含氨基酸复合液用于荔枝离体再生的产品，一种荔枝离体再生的方法和用于荔枝离体再生的产品的应用。


背景技术：

2.荔枝(litchi chinensis sonn.)是我国重要的经济作物之一，在热区农业生产中占有重要地位。目前荔枝离体再生的方法主要是通过体胚发生途径获得再生植株，但荔枝体胚发生途径普遍存在体胚发生效率低、畸形胚诱导率高、萌发成苗难、基因型依赖等问题。因此，建立稳定高效的荔枝体胚再生途径仍是当前研究的热点之一。
3.氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是生物体不可缺少的营养物质之一，与生命活动有着密切的关系。氨基酸可作为有机氮源，促进植物的生长，也可作为功能性物质对机体生命活动产生调节作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种含氨基酸复合液用于荔枝离体再生的产品及方法与应用。
5.本发明荔枝愈伤组织增殖及体胚发生过程中，不同种类氨基酸含量不同，通过添加含不同浓度外源氨基酸的复合液，改变培养基中的碳源，有效促进愈伤组织增殖、改善愈伤组织状态，提高体胚发生效率，为荔枝及其他木本植物离体再生研究提供理论依据和技术支持。
6.本发明提供的一种荔枝离体再生的方法，包括下述步骤：
7.1)以荔枝花药为外植体，在愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，得到胚性愈伤组织；
8.2)将所述胚性愈伤组织在含有氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基中进行增殖培养，得到增殖愈伤组织；
9.所述含有氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基包括愈伤组织增殖培养基和氨基酸复合液amo1；
10.3)将步骤1)中所述胚性愈伤组织和/或步骤2)中所述增殖愈伤组织在含有氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基中进行体胚诱导培养，得到体胚；
11.所述含有氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基包括体胚诱导培养基和氨基酸复合液amo2；
12.4)将所述体胚在成熟培养基中进行成熟培养，得到成熟体胚；
13.5)将所述成熟体胚在萌发培养基中进行萌发培养，得到再生荔枝植株。
14.上述的方法中，所述氨基酸复合液为含21种不同浓度的氨基酸，所述氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、苏氨
酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和赖氨酸。
15.上述的方法中，所述含有氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基中氨基酸复合液amo1的含量可为1～15ml/l，具体可为1、2、3、4、5、10、15ml/l。
16.上述的方法中，所述含有所述氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基中氨基酸复合液amo2的含量可为1～15ml/l，具体可为1、5、10、15ml/l。
17.上述的方法中，所述含有氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基中，所述氨基酸复合液amo1由如下含量的氨基酸组成：
18.所述天冬氨酸的含量为4～65mg/l；
19.所述谷氨酸的含量为9.5～150mg/l；
20.所述天冬酰胺的含量为2～45mg/l；
21.所述丝氨酸的含量为4～75mg/l；
22.所述谷氨酰胺的含量为20～330mg/l；
23.所述甘氨酸的含量为1～25mg/l；
24.所述组氨酸的含量为2～45mg/l；
25.所述γ-氨基丁酸的含量为40～660mg/l；
26.所述精氨酸的含量为25～400mg/l；
27.所述苏氨酸的含量为3～55mg/l；
28.所述丙氨酸的含量为25～405mg/l；
29.所述脯氨酸的含量为10～225mg/l；
30.所述酪氨酸的含量为2～35mg/l；
31.所述缬氨酸的含量为5～85mg/l；
32.所述甲硫氨酸的含量为0.5～15mg/l；
33.所述胱氨酸的含量为1.5～30mg/l；
34.所述异亮氨酸的含量为5.5～90mg/l；
35.所述亮氨酸的含量为10～170mg/l；
36.所述苯丙氨酸的含量为6～100mg/l；
37.所述色氨酸的含量为1～25mg/l；
38.所述赖氨酸的含量为3～55mg/l。
39.本发明中，所述含有氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基中，所述氨基酸复合液amo1具体由如下含量的氨基酸组成：
40.所述天冬氨酸的含量为4～65mg/l(例如4.19、20.97、41.95、62.92mg/l)；
41.所述谷氨酸的含量为9.5～150mg/l(例如9.85、49.26、98.25、147.78mg/l)；
42.所述天冬酰胺的含量为2～45mg/l(例如2.77、13.84、27.68、41.52mg/l)；
43.所述丝氨酸的含量为4～75mg/l(例如4.78、23.89、47.79、71.68mg/l)；
44.所述谷氨酰胺的含量为20～330mg/l(例如21.77、108.87、217.75、326.62mg/l)；
45.所述甘氨酸的含量为1～25mg/l(例如1.40、6.99、13.99、20.98mg/l)；
46.所述组氨酸的含量为2～45mg/l(例如2.69、13.45、26.89、40.34mg/l)；
47.所述γ-氨基丁酸的含量为40～660mg/l(例如43.53、217.66、435.31、652.97mg/
l)；
48.所述精氨酸的含量为25～400mg/l(例如25.37、126.83、253.66、380.49mg/l)；
49.所述苏氨酸的含量为3～55mg/l(例如3.56、17.78、35.57、53.35mg/l)；
50.所述丙氨酸的含量为25～405mg/l(例如26.72、133.61、267.21、400.82mg/l)；
51.所述脯氨酸的含量为10～225mg/l(例如14.80、74.02、148.03、222.05mg/l)；
52.所述酪氨酸的含量为2～35mg/l(例如2.23、11.14、22.28、33.42mg/l)；
53.所述缬氨酸的含量为5～85mg/l(例如5.35、26.74、53.49、80.23mg/l)；
54.所述甲硫氨酸的含量为0.5～15mg/l(例如0.8、4.01、8.02、12.04mg/l)；
55.所述胱氨酸的含量为1.5～30mg/l(例如1.69、8.43、16.85、25.28mg/l)；
56.所述异亮氨酸的含量为5.5～90mg/l(例如5.91、29.53、59.06、88.59mg/l)；
57.所述亮氨酸的含量为10～170mg/l(例如11.06、55.30、110.61、165.91mg/l)；
58.所述苯丙氨酸的含量为6～100mg/l(例如6.61、33.07、66.15、99.22mg/l)；
59.所述色氨酸的含量为1～25mg/l(例如1.39、6.94、13.87、20.81mg/l)；
60.所述赖氨酸的含量为3～55mg/l(例如3.53、17.66、35.32、52.98mg/l)。
61.上述的方法中，所述含有所述氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基中，所述氨基酸复合液amo2由如下含量的氨基酸组成：
62.天冬氨酸的含量为3～50mg/l；
63.所述谷氨酸的含量为6～105mg/l；
64.所述天冬酰胺的含量为2～35mg/l；
65.所述丝氨酸的含量为3～60mg/l；
66.所述谷氨酰胺的含量为20～360mg/l；
67.所述甘氨酸的含量为1～20mg/l；
68.所述组氨酸的含量为3～60mg/l；
69.所述γ-氨基丁酸的含量为40～670mg/l；
70.所述精氨酸的含量为30～450mg/l；
71.所述苏氨酸的含量为3～50mg/l；
72.所述丙氨酸的含量为20～350mg/l；
73.所述脯氨酸的含量为10～185mg/l；
74.所述酪氨酸的含量为1.5～30mg/l；
75.所述缬氨酸的含量为8～135mg/l；
76.所述甲硫氨酸的含量为0.5～9mg/l；
77.所述胱氨酸的含量为1～25mg/l；
78.所述异亮氨酸的含量为4～65mg/l；
79.所述亮氨酸的含量为10～215mg/l；
80.所述苯丙氨酸的含量为5.5～85mg/l；
81.所述色氨酸的含量为1.5～25mg/l；
82.所述赖氨酸的含量为4.5～75mg/l。
83.本发明中，所述含有所述氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基中，所述氨基酸复合液amo2具体由如下含量的氨基酸组成：
84.所述天冬氨酸的含量为3～50mg/l(例如3.11、15.56、31.13、46.69mg/l)；所述谷氨酸的含量为6～105mg/l(例如6.79、33.94、67.87、101.81mg/l)；所述天冬酰胺的含量为2～35mg/l(例如2.14、10.70、21.39、32.09mg/l)；所述丝氨酸的含量为3～60mg/l(例如3.74、18.71、37.42、56.13mg/l)；所述谷氨酰胺的含量为20～360mg/l(例如23.96、119.78、239.56、359.33mg/l)；所述甘氨酸的含量为1～20mg/l(例如1.19、5.96、11.93、17.89mg/l)；所述组氨酸的含量为3～60mg/l(例如3.81、19.06、38.11、57.17mg/l)；所述γ-氨基丁酸的含量为40～670mg/l(例如44.35、221.77、443.54、665.31mg/l)；所述精氨酸的含量为30～450mg/l(例如29.98、149.90、299.79、449.69mg/l)；所述苏氨酸的含量为3～50mg/l(例如3.06、15.30、30.60、45.90mg/l)；所述丙氨酸的含量为20～350mg/l(例如22.64、113.19、236.38、339.56mg/l)；所述脯氨酸的含量为10～185mg/l(例如12.15、60.76、121.51、182.27mg/l)；所述酪氨酸的含量为1.5～30mg/l(例如1.70、8.50、16.99、25.49mg/l)；所述缬氨酸的含量为8～135mg/l(例如8.83、44.17、88.34、132.50mg/l)；所述甲硫氨酸的含量为0.5～9mg/l(例如0.59、2.93、5.85、8.78mg/l)；所述胱氨酸的含量为1～25mg/l(例如1.37、6.85、13.69、20.54mg/l)；所述异亮氨酸的含量为4～65mg/l(例如4.20、20.01、42.03、63.04mg/l)；所述亮氨酸的含量为10～215mg/l(例如14.24、71.18、142.36、213.54mg/l)；所述苯丙氨酸的含量为5.5～85mg/l(例如5.66、28.30、56.60、84.90mg/l)；所述色氨酸的含量为1.5～25mg/l(例如1.56、7.78、15.56、23.33mg/l)；所述赖氨酸的含量为4.5～75mg/l(例如4.94、24.68、49.36、74.04mg/l)。
85.上述的方法中，所述愈伤组织诱导培养基包括2,4-d(中文名称为2,4-二氯苯氧乙酸)、6-ba(中文名称为6-苄氨基嘌呤)和naa(中文名称为α-萘乙酸)中的至少一种；
86.所述含有氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基还包括2,4-d；
87.所述含有氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基还包括zt(中文名称为玉米素)、naa、肌醇、lh(中文名称为水解乳蛋白)和椰汁中的至少一种；
88.所述成熟培养基包括iaa(中文名称为吲哚-3-乙酸)、aba(中文名称为脱落酸)和椰汁中至少一种；
89.所述萌发培养基包括ga3(中文名称为赤霉素)。
90.上述的方法中，所述愈伤组织诱导培养基中包括如下含量的组分中的至少一种：
91.所述2,4-d的含量可为0.5～3mg/l；所述6-ba的含量可为0.1～1mg/l；所述naa的含量可为0.1～1mg/l；
92.所述含有氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基中，所述2,4-d的含量可为0.5～2mg/l；
93.所述含有氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基中包括如下含量的组分中的至少一种：所述naa的含量可为3～7mg/l；所述zt的含量可为0.1～1mg/l；所述肌醇的含量可为0.05～0.2mg/l；所述lh的含量可为0.3～0.5mg/l；所述椰汁的含量可为50～100ml/l；
94.所述成熟培养基中包括如下含量的组分中的至少一种：所述iaa的含量为0.1～1mg/l；所述aba的含量为0.5～2mg/l；所述椰汁的含量为50～100ml/l；
95.所述萌发培养基中，所述ga3的含量为0.5～2mg/l。
96.本发明中，所述愈伤组织诱导培养基中具体由如下含量的组分组成：ms 3mg/l2,4-d 0.5mg/l 6-ba 0.5mg/l naa 0.4g/l lh 30g/l糖 7g/l琼脂。
97.上述的方法中，步骤1)中还包括将所述胚性愈伤组织进行继代保存培养的步骤；
98.所述继代保存培养的方法包括如下步骤：将所述胚性愈伤组织在继代保存培养基i和继代保存培养基ii上交替培养，每隔20～35天继代一次；
99.所述继代保存培养基i包括2,4-d，含量为0.5～2mg/l；
100.所述继代保存培养基ii包括2,4-d、kt(中文名称为激动素)和agno3，所述2,4-d的含量为0.5～2mg/l，所述kt的含量为0.5～2mg/l，所述agno3的含量为3～7mg/l。
101.上述的方法中，步骤1)中，所述愈伤组织诱导培养条件为23～27℃暗培养45～60天。
102.上述的方法中，步骤2)中，所述愈伤组织继代培养条件为23-27℃暗培养20～35天。
103.上述的方法中，步骤3)中，所述体胚诱导培养条件为23-27℃暗培养30～45天。
104.上述的方法中，步骤4)中，所述成熟培养条件为23～27℃黑暗培养50～65天。
105.上述的方法中，步骤5)中，所述萌发培养条件为23～27℃光照培养30～40天，光照强度为2000～5000lux，光照时间为15～17小时/天。
106.上述的方法中，所述继代保存培养条件为23～27℃，暗培养。
107.上述的方法中，所述继代保存培养的次数为45-55次。
108.上述任一所述培养基均在灭菌处理后进行使用。
109.本发明还提供了用于荔枝离体再生的产品，包括所述的愈伤组织诱导培养基、所述含有氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基、所述含有氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基、所述成熟培养基、所述萌发培养基、所述继代保存培养基i和所述继代保存培养基ii中的至少一种。
110.本发明中，所述继代保存培养基i和所述继代保存培养基ii的制备参照赖钟雄(赖钟雄.龙眼生物技术研究.福建科学技术出版社，2003.6)中方法，均为先调ph5.8，然后高压灭菌。
111.本发明进一步提供了如下a1)-a4)任一种应用：
112.a1)所述用于荔枝离体再生的产品在荔枝离体再生培养中的应用；
113.a2)所述用于荔枝离体再生的产品在制备荔枝离体再生培养的产品中的应用；
114.a3)所述的含有氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基在提高荔枝愈伤组织增殖率中的应用
115.a4)所述的含有氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基在提高荔枝体胚诱导率中的应用；。
116.本发明上述的方法或上述的成套培养基或上述的应用中，所述荔枝品种为妃子笑。
117.本发明具有以下优点：
118.1、本发明提供荔枝离体再生的方法通过添加氨基酸复合液优化了愈伤组织增殖培养基和体胚诱导培养基的组分，特别是氨基酸种类及含量，从而优化体胚质量，提高体胚诱导率，促进体胚萌发。
119.2、本发明提供荔枝离体再生的方法从愈伤组织诱导、增殖培养，经体胚诱导途径，发育成完整离体再生植株的方法，提高了荔枝愈伤组织增殖率、体胚诱导率及萌发率，建立
了高效的荔枝离体再生技术体系，为荔枝品种改良和转基因育种奠定了良好的基础。
附图说明
120.图1为实施例1妃子笑荔枝品种离体再生体系建立过程中用于诱导愈伤组织的花药。
121.图2为实施例1妃子笑荔枝品种离体再生体系建立过程中继代保存培养获得的稳定的胚性愈伤组织系。
122.图3为实施例1妃子笑荔枝品种离体再生体系建立过程中不同氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基上的愈伤组织。
123.图4为实施例1妃子笑荔枝品种离体再生体系建立过程中高频诱导的体胚。
124.图5为实施例1妃子笑荔枝品种离体再生体系建立过程中初始抽茎的体胚。
125.图6为实施例1妃子笑荔枝品种离体再生体系建立过程中的具根茎叶的完整离体再生植株。
具体实施方式
126.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
127.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
128.下述实施例中，采用dps数据处理系统18.10高级版统计软件对数据进行处理，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，实验结果以平均值表示，采用duncan新复极差法检验。
129.下述实施例中涉及的试剂及培养基的来源如下：
130.2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)是上海源聚生物科技有限公司的产品，货号为081223。
131.6-ba(6-苄氨基嘌呤)是上海伯奥生物科技有限公司的产品，货号为090601。
132.naa(α-萘乙酸)是上海伯奥生物科技有限公司的产品，货号为090219。
133.zt(玉米素)是上海源聚生物科技有限公司的产品，批号210301。
134.kt(激动素)是生工生物工程(上海)股份有限公司的产品，货号为c920ba0018。
135.iaa(吲哚-3-乙酸)是生工生物工程(上海)股份有限公司的产品，货号为ca13ba0040。
136.aba(脱落酸)是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为s21f8j29658。
137.ga3(赤霉素)是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为s27s10p98642。
138.椰汁为将新鲜椰子倒出的椰子汁经双层纱布过滤后得到的椰子水。
139.lh(水解乳蛋白)是生工生物工程(上海)股份有限公司的产品，货号为bb07ba0326。
140.肌醇是上海源聚生物科技有限公司的产品，货号为071013。
141.m519(ms培养基)是北京西美杰科技有限公司的产品，货号为aak0519209a。
142.dl-天冬氨酸，广州化学试剂厂，批号cas617-45-8。
143.l-谷氨酸(l( )-glutamic acid)是macklin公司的产品，货号为c12523173。
144.l-asparagine(l-天冬酰胺)是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为h03j10h91918。
145.l-丝氨酸(l-serine)是macklin公司的产品，货号为c12467562。
146.l-glutamine(l-谷氨酰胺)是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为j25j10r93803。
147.glycine(甘氨酸)是国药集团化学试剂有限公司的产品，货号为f20090324。
148.l-histidine(l-组氨酸)，是生工生物工程(上海)股份有限公司的产品，货号为lj0921b0510j。
149.γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)是macklin公司的产品，货号为c12104921。
150.l
–
arginine(l-精氨酸)是国药集团化学试剂有限公司的产品，批号f20060421。
151.l-苏氨酸(l-threonine)是macklin公司的产品，货号为c12225905。
152.l-alanine(l-丙氨酸)是国药集团化学试剂有限公司的产品，货号为f20181214。
153.l-proline(l-脯氨酸)是solarbio公司的产品，货号为p0011。
154.l-tyrosine(l-酪氨酸)，是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为z13a9h67860。
155.l-valine(l-缬氨酸)是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为j05j9r65042。
156.dl
–
methionine(dl-甲硫氨基酸)是国药集团化学试剂有限公司的产品，批号f20081113。
157.l-胱氨酸(l-cystine)是solarbio公司的产品，货号为304c052。
158.l-异亮氨酸(l-isoleucine)是macklin公司的产品，货号为c12201043。
159.l-亮氨酸(l-leucine)是macklin公司的产品，货号为c11863144。
160.l-phenylalanine(l-苯丙氨酸)是国药集团化学试剂有限公司的产品，批号f20110111。
161.l-tryptophan(l-色氨酸)，是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为h31m9h57303。
162.l-lysine(l-赖氨酸)solarbio公司的产品，货号为914h031。
163.下述实施例中，1、愈伤组织诱导培养基的配方，记为l9：ms 3mg/l 2,4-d 0.5mg/l 6-ba 0.5mg/l naa 0.4g/l lh 30g/l蔗糖 7g/l琼脂；
164.2、继代保存培养基i的配方，记为m3：ms 1mg/l 2,4-d 30g/l蔗糖 7g/l琼脂；
165.3、继代保存培养基ii的配方，记为m4：ms 1mg/l 2,4-d 0.5mg/l kt 5mg/l agno3 30g/l蔗糖 7g/l琼脂；
166.4、含有氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基由继代保存培养基i添加不同浓度的氨基酸复合液amo1组成(如表1所示)，具体配方记为am1-7，如下：
167.am1：ms 1mg/l 2,4-d 30g/l蔗糖 7g/l琼脂 1ml/l amo1；
168.am2：ms 1mg/l 2,4-d 30g/l蔗糖 7g/l琼脂 5ml/l amo1；
169.am3：ms 1mg/l 2,4-d 30g/l蔗糖 7g/l琼脂 10ml/l amo1；
170.am4：ms 1mg/l 2,4-d 30g/l蔗糖 7g/l琼脂 15ml/l amo1；
171.am5：ms 1mg/l 2,4-d 30g/l蔗糖 7g/l琼脂 2ml/l amo1；
172.am6：ms 1mg/l 2,4-d 30g/l蔗糖 7g/l琼脂 3ml/l amo1；
173.am7：ms 1mg/l 2,4-d 30g/l蔗糖 7g/l琼脂 4ml/l amo1；
174.5、体胚诱导培养基的配方，记为t7：ms 0.1mg/l naa 5mg/l zt 0.1g/l肌醇
0.4g/l lh 100ml/l椰汁 60g/l蔗糖 10g/l琼脂；
175.6、含有氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基(其中所含氨基酸复合液amo2如表2所示)，具体记为az1-4，组成分别如下：
176.az1：ms 0.1mg/l naa 5mg/l zt 0.1g/l肌醇 0.4g/l lh 100ml/l椰汁 60g/l蔗糖 10g/l琼脂 1ml/l amo2；
177.az2：ms 0.1mg/l naa 5mg/l zt 0.1g/l肌醇 0.4g/l lh 100ml/l椰汁 60g/l蔗糖 10g/l琼脂 5ml/l amo2；
178.az3：ms 0.1mg/l naa 5mg/l zt 0.1g/l肌醇 0.4g/l lh 100ml/l椰汁 60g/l蔗糖 10g/l琼脂 10ml/l amo2；
179.az4：ms 0.1mg/l naa 5mg/l zt 0.1g/l肌醇 0.4g/l lh 100ml/l椰汁 60g/l蔗糖 10g/l琼脂 15ml/l amo2；
180.7、成熟培养基记为c19，组成具体如下：ms 0.5mg/l iaa 1mg/l aba 100ml/l椰汁 60g/l蔗糖 10g/l琼脂；
181.8、萌发培养基记为r3，组成具体如下：ms 1mg/l ga3 30g/l蔗糖 7g/l琼脂。
182.下述实施例中，选取荔枝品种妃子笑花药为外植体接种在愈伤组织诱导培养基l9上进行暗培养获得胚性愈伤组织；胚性愈伤组织在m3和m4上交替培养，可长期保存胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织接种在m3(对照)或者am1、am2、am3、am4、am5、am6、am7这7种添加不同氨基酸复合液am的培养基上暗培养25天左右，可获得高增殖量的不同胚性愈伤组织；将所获的胚性愈伤组织接种在t7或者az1上暗培养40天左右，可获得较高诱导率的乳白胚(每鲜克愈伤组织诱导乳白胚数达396个)。挑选大小形态相对一致的乳白胚接种至c19上黑暗培养60d左右；将成熟的乳白胚接种于体胚萌发培养基r3上光照培养40天左右，可获得完整离体再生植株。
183.实施例1、一种含氨基酸复合液用于荔枝离体再生的产品及方法
184.含氨基酸复合液用于荔枝离体再生的产品由愈伤组织诱导培养基、含有氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基、含有氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基、成熟培养基、萌发培养基、继代保存培养基i和继代保存培养基ii组成。
185.采用上述产品进行荔枝离体再生的方法，包括如下步骤：
186.一、外植体的制备
187.实验材料：荔枝品种妃子笑露白点期花蕾，2015年3月取自海南省永发镇海南省农业科学院果树所。
188.实验方法：自来水冲洗摘取的花蕾30min，得到预处理过的花蕾；然后在无菌操作台上将预处理过的花蕾用70％(体积分数)的酒精溶液浸泡消毒30s后再放入0.1％(质量分数)的hgcl2溶液中消毒8min，最后用高压灭菌无菌水冲洗5-6次，获得无菌花蕾。用手术刀和尖头镊子将花药从无菌花蕾里轻轻拨出后作为外植体，该外植体用于接种在愈伤组织诱导培养基上进行暗培养。
189.二、愈伤组织诱导与继代保存培养
190.1、愈伤组织诱导培养基的制备
191.愈伤组织诱导培养基为在ms培养基的基础上添加2,4-d、6-ba、naa、lh、蔗糖和琼脂，调节ph5.8，灭菌后得到的固体培养基。愈伤组织诱导培养基中，2,4-d的含量为3mg/l、
6-ba的含量为0.5mg/l、naa的含量为0.5mg/l、lh的含量为0.4g/l、蔗糖的含量为30g/l和琼脂的含量为7g/l。
192.其中，ms培养基为常用培养基，可通过商业途径购买，也可按照以下成分及含量自己配制：ms培养基的溶剂为水，溶质及其含量分别如下：大量元素：1900mg/l硝酸钾(kno3)，1650mg/l硝酸铵(nh4no3)，170mg/l磷酸二氢钾(kh2po4)，370mg/l七水硫酸镁(mgso4·
7h2o)，440mg/l二水氯化钙(cacl2·
2h2o)；微量元素：0.83mg/l碘化钾(ki)，6.2mg/l硼酸(h3bo3)，22.3mg/l四水硫酸锰(mnso4·
4h2o)，8.6mg/l七水硫酸锌(znso4·
7h2o)，0.25mg/l钼酸钠(na2moo4·
2h2o)，0.025mg/l五水硫酸铜(cuso4·
5h2o)，0.025mg/l六水氯化钴(cocl2·
6h2o)；铁盐：37.25mg/l乙二胺四乙酸二钠(na2·
edta)，27.85mg/l七水硫酸亚铁(feso4·
7h2o)；有机成分：100mg/l肌醇，2mg/l甘氨酸，0.1mg/l盐酸硫胺素(vb1)，0.5mg/l盐酸吡哆醇(vb6)，0.5mg/l烟酸(vb3)或烟酰胺(vpp)。
193.2、愈伤组织诱导及继代保存培养
194.将步骤一获得的妃子笑荔枝品种花药(外植体)接种至步骤二的1中制备的愈伤组织诱导培养基上，在温度为(25
±
2)℃条件下暗培养45-60d，诱导并经筛选获得胚性愈伤组织(图1)。
195.挑选淡黄色、松散的胚性愈伤组织接种至继代保存培养基i和继代保存培养基ii上交替培养，培养条件为(25
±
2)℃，黑暗培养，每隔20-35天继代保存一次，经多次继代筛选获得淡黄色、生长旺盛、颗粒细小且松散的胚性愈伤组织(图1)。
196.继代保存培养基i(m3)为在ms培养基的基础上添加2,4-d、蔗糖和琼脂，调节ph5.8，灭菌后得到的固体培养基。继代保存培养基i中，2,4-d含量为1mg/l，蔗糖含量为30g/l，和琼脂含量为7g/l。
197.继代保存培养基ii(m4)为在ms培养基的基础上添加2,4-d、kt、agno3、蔗糖和琼脂，调节ph5.8，灭菌后得到的固体培养基。继代保存培养基ii中，2,4-d含量1mg/l、kt含量0.5mg/l、agno3含量5mg/l、蔗糖含量30g/l和琼脂含量7g/l。
198.三、愈伤组织增殖及体胚诱导培养
199.1、氨基酸复合液amo1对愈伤组织增殖培养及体胚诱导的影响
200.挑选上述经50次继代筛选后的淡黄色、松散的胚性愈伤组织分别接种至含不同氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基(表1)上，培养20d时，获得愈伤组织，统计愈伤组织增殖量，观察愈伤组织生长状态及细胞形态。同时将获得的愈伤组织分别接种至体胚诱导培养基(t7)上，培养45d时统计体胚中的乳白胚诱导数量、状态及萌发率，研究不同氨基酸复合液amo1对愈伤组织增殖及体胚诱导的影响。
201.将不同增殖培养基来源的愈伤组织诱导的乳白胚进行试验，大于0.3cm的乳白胚接种至成熟培养基c19(ms aba1mg/l iaa 0.5mg/l 100ml/l椰汁 60g/l蔗糖 10g/l琼脂)上，在(25
±
2)℃条件下暗培养约60d，待其成熟，获得成熟乳白胚。
202.挑选形态相对一致的成熟乳白胚接种至r3(ms ga
3 1mg/l 30g/l蔗糖 7g/l琼脂)的萌发培养基中培养，在萌发培养基中培养40d后统计体胚萌发率。
203.增殖量统计方法：愈伤组织增殖量＝20d时愈伤组织重量-愈伤组织初始接种量。
204.萌发率统计方法：萌发率＝萌发的体胚个数/接种至萌发培养基中的体胚总数
×
100％。
205.乳白胚诱导数量(乳白胚数)是统计每鲜克愈伤组织诱导乳白胚个数；鲜克是指愈伤组织的鲜重，单位为克。
206.表1所示的愈伤组织增殖培养基以m3培养基为对照、分别添加不同含量的氨基酸复合液amo1(愈伤组织增殖培养基中含量1、2、3、4、5、10、15ml/l)的愈伤组织增殖培养基中含量30g/l蔗糖和愈伤组织增殖培养基中含量7g/l琼脂，调节ph值至5.8，灭菌后得到的固体培养基。
207.体胚诱导培养基(t7)以ms培养基为基本培养基，添加体胚诱导培养基中含量0.1mg/l naa、体胚诱导培养基中含量5mg/l zt、体胚诱导培养基中含量0.1g/l肌醇、体胚诱导培养基中含量0.4g/l lh、体胚诱导培养基中含量100ml/l椰汁、体胚诱导培养基中含量60g/l蔗糖和体胚诱导培养基中含量10g/l琼脂，调节ph值至5.8，灭菌后得到的固体培养基。
208.培养条件如下：在温度为(25
±
2)℃条件下暗培养。
209.表1不同氨基酸复合液种类及浓度
[0210][0211]
表2不同氨基酸复合液amo1对愈伤组织增殖及体胚分化的影响
[0212]
[0213][0214]
表3不同氨基酸复合液amo1对愈伤组织增殖及体胚分化的影响
[0215][0216]
上述结果表明：在不同氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基上培养20d左右可获得高增殖量、不同状态的胚性愈伤组织(图1)。由表2、表3可知，低于5ml/l含量的氨基酸复合液amo1增殖量都较对照(m3)高；愈伤组织与非胚性愈伤颜色状态界限更加明显，胚性愈伤组织淡黄色颗粒状，有较多细胞团，细胞分裂更旺盛。非胚性愈伤组织浅白软塌。
[0217]
经过不同处理增殖的愈伤组织体胚发生效率不同(表2、表3、图1)。氨基酸复合液amo1含量为10ml/l或者15ml/l处理上增殖的愈伤组织的体胚发生效率都降低，甚至全无体胚分化。
[0218]
氨基酸复合液amo1含量低于5ml/l处理上增殖的愈伤组织的体胚发生效率及质量随着氨基酸复合液amo1含量升高而明显提高，体胚状态饱满。当氨基酸复合液amo1含量为4ml/l时，体胚发生数量最多，达374个/鲜克。其次为氨基酸复合液amo1含量为5ml/l时，体胚发生数量达351个/鲜克。
[0219]
因此确定氨基酸复合液amo1含量为4ml/l时的培养基为愈伤组织增殖最佳培养基，即am7培养基(ms 1mg/l 2,4-d 4ml/l氨基酸复合液amo1 30g/l蔗糖 7g/l琼脂)，在ms
培养基的基础上添加2,4-d、氨基酸复合液amo1、蔗糖和琼脂，调节ph5.8，灭菌后得到的固体培养基，am7培养基中，2,4-d的含量为1mg/l，氨基酸复合液amo1的含量为4ml/l，蔗糖的含量为30g/l，琼脂的含量为7g/l)。
[0220]
2、氨基酸复合液amo2对体胚诱导的影响
[0221]
将对照培养基(m3)、氨基酸复合液amo1的愈伤组织增殖培养基(am2及am7)上继代20d的愈伤组织分别接种至含不同氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基(表4)上，培养45d时统计乳白胚状态、诱导数量及萌发率，研究不同氨基酸复合液amo2对体胚诱导的影响。
[0222]
表4所示的含有氨基酸复合液amo2的体胚诱导培养基以ms为基本培养基，添加zt(体胚诱导培养基中含5mg/l)、naa(体胚诱导培养基中含0.1mg/l)、氨基酸复合液amo2(体胚诱导培养基中含1、5、10、15ml/l)、体胚诱导培养基中含0.1g/l肌醇、体胚诱导培养基中含0.4g/l lh、体胚诱导培养基中含100ml/l椰汁、体胚诱导培养基中含60g/l蔗糖和体胚诱导培养基中含10g/l琼脂，调节ph值至5.8，灭菌后得到的固体培养基。
[0223]
培养条件如下：在温度为(25
±
2)℃条件下暗培养。
[0224]
结果如表4所示，结果表明：不同氨基酸复合液amo2对体胚诱导影响差异较大，低浓度氨基酸复合液amo2对体胚诱导起促进作用。当氨基酸复合液amo1及amo2含量分别为1ml/l，乳白胚诱导数量最多，达396个/鲜克，体胚状态饱满，形态明显可见。其次为氨基酸复合液amo1为1ml/l，体胚诱导培养基为对照t7时，乳白胚诱导数量较高，达374个/鲜克，体胚簇生，子叶形态明显可见。因此确定氨基酸复合液am7-az1组合培养基(am7:ms 1mg/l 2,4-d 1ml/l氨基酸复合液amo1 30g/l蔗糖 7g/l琼脂；az1:ms 0.1mg/l naa 5mg/l zt 1ml/l氨基酸复合液amo2 0.1g/l肌醇 0.4g/l lh 100ml/l椰汁 60g/l蔗糖 10g/l琼脂)或者氨基酸复合液am7-t7组合培养基(am7:ms 1mg/l 2,4-d 1ml/l氨基酸复合液amo1 30g/l蔗糖 7g/l琼脂；t7:ms 0.1mg/l naa 5mg/l zt 0.1g/l肌醇 0.4g/l lh 100ml/l椰汁 60g/l蔗糖 10g/l琼脂)为体胚诱导最佳培养基，具体配方如下：在ms培养基的基础上添加naa、zt、氨基酸复合液amo2、肌醇、lh、椰汁、蔗糖和琼脂，调节ph5.8，灭菌后得到的固体培养基。
[0225]
在am7培养基中，2,4-d含量为1mg/l，氨基酸复合液amo1含量为1ml/l，蔗糖含量为30g/l，琼脂含量为7g/l。
[0226]
在t7培养基中，naa含量为0.1mg/l，zt含量为5mg/l，肌醇含量为0.1g/l，lh含量为0.4g/l，椰汁含量为100ml/l，蔗糖含量为60g/l，琼脂含量为10g/l。
[0227]
在az1培养基中，naa含量为0.1mg/l，zt含量为5mg/l，氨基酸复合液amo2含量为1ml/l，肌醇含量为0.1g/l，lh含量为0.4g/l，椰汁含量为100ml/l，蔗糖含量为60g/l，琼脂含量为10g/l。
[0228]
表4不同氨基酸复合液amo2对体胚发生的影响
[0229][0230]
四、体胚成熟及萌发
[0231]
1、将步骤三中由不同增殖培养基来源的愈伤组织诱导的乳白胚和由不同体胚诱导培养基上诱导获得的乳白胚进行试验，大于0.3cm的乳白胚接种至成熟培养基(c19)上，在(25
±
2)℃条件下暗培养约60d，待其成熟，获得成熟乳白胚。
[0232]
所述成熟培养基(c19)是以ms培养基为基础培养基，添加iaa、aba、椰汁、蔗糖、琼脂，调节ph至5.8，灭菌后得到的固体培养基。成熟培养基中，iaa含量0.5mg/l、aba含量1mg/l、椰汁含量100ml/l、蔗糖含量60g/l、琼脂含量10g/l。
[0233]
所述成熟培养的条件为温度23-27℃，黑暗培养，培养时间为50-65d。
[0234]
2、从上述步骤中挑选形态相对一致的成熟乳白胚接种至r3的萌发培养基中培养，得到再生植株(图4和图5)。
[0235]
所述萌发培养基(r3)是以ms培养基为基础培养基，添加ga3、蔗糖和琼脂，调节ph至5.8，灭菌后得到的固体培养基。萌发培养基中，ga3含量1mg/l、蔗糖含量30g/l和琼脂含量7g/l。
[0236]
所述萌发培养的条件为温度(25
±
2)℃，光照培养(光照强度为2000lux，光照时间为16小时/天)，培养时间为30-40天。
[0237]
在萌发培养基中培养40d后统计体胚萌发率。体胚萌发率＝萌发的体胚个数/接种至-萌发培养基中的体胚总数
×
100％。
[0238]
高含量(10ml/l以上)氨基酸复合液am完全抑制愈伤组织增殖，无乳白胚发生，透明胚在光照下逐渐褐变凋亡，无萌发。低含量(5ml/l以下)氨基酸复合液amo1处理增殖的愈伤组织体胚萌发率都升高，体胚都较鲜亮，饱满；茎段嫩绿，根4-7cm，当氨基酸复合液amo1含量为4ml/l，体胚萌发率最高，达19.16％。
[0239]
不同氨基酸复合液amo2体胚诱导培养基上诱导获得的体胚萌发率不同，其中氨基酸复合液am7-az1组合培养基上分化的体胚萌发率最高，为19.99％，体胚抽茎长0.6-1.5cm，根4-7cm；较小的体胚(0.4cm)也能萌发。其次为氨基酸复合液am7-t7组合培养基上
分化的体胚萌发率较高，为19.26％，体胚抽茎约0.8cm，根约4cm。
[0240]
因此确定am7培养基和az1培养基分别为愈伤组织继代增殖最佳培养基及体胚诱导最佳培养基，具体配方分别为ms 1mg/l 2,4-d 1ml/l氨基酸复合液amo1 30g/l蔗糖 7g/l琼脂，ms 0.1mg/l naa 5mg/l zt 1ml/l氨基酸复合液amo2 0.1g/l肌醇 0.4g/l lh 100ml/l椰汁 60g/l蔗糖 10g/l琼脂。
[0241]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、含量和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。