一种检测紫花苜蓿中蓟属植物的引物对及其应用和检测方法与流程

no.2所示。
15.第二方面，本技术提供如前述实施方式的引物对在检测紫花苜蓿草产品中是否含有蓟属植物中的用途。
16.第三方面，本技术提供一种试剂盒，其包括前述实施方式的引物对。
17.在可选的实施方式中，试剂盒还包括mg
2
、dntp、dna聚合酶以及pcr缓冲液。
18.第四方面，本技术提供如前述实施方式的试剂盒在检测紫花苜蓿草产品中是否含有蓟属植物的用途。
19.第五方面，本技术提供一种检测紫花苜蓿草产品中是否含有蓟属植物的方法，包括以下步骤：对紫花苜蓿草产品的dna进行pcr扩增，并检测扩增产物中是否含有蓟属植物的dna片段，若产物中含有蓟属植物的dna片段，则紫花苜蓿草产品中包含蓟属植物；
20.pcr扩增时使用的引物包括前述实施方式的引物对。
21.在可选的实施方式中，紫花苜蓿草产品为紫花苜蓿草颗粒饲料。
22.在可选的实施方式中，pcr扩增体系包括2
×
pcr master、dna模板、引物msc1-f 1、引物msc1-r和ddh2o；
23.其中，2
×
pcr master包括mgcl2、dntp、taq酶和2
×
pcr缓冲液。
24.在可选的实施方式中，每20μl pcr扩增体系中，含有10μl 2
×
pcr master、1μl浓度为50ng/μl的dna模板、1μl浓度为10nm的引物msc1-f、1μl浓度为10nm的引物msc1-r 1μl以及7μl ddh2o；
[0025]2×
pcr master中，mgcl2的浓度为3mmol/l，dntp的浓度为0.2mmol/l，taq酶的浓度为0.1u/μl。
[0026]
在可选的实施方式中，pcr扩增条件包括：
[0027]
步骤a、94℃预变性4min；步骤b、94℃变性30s；步骤c、56℃退火30s；步骤d、72℃延伸20s；步骤b至步骤d循环25-40次；步骤e、72℃延伸10min。
[0028]
在可选的实施方式中，步骤b至步骤d循环30-38次；优选地，步骤b至步骤d循环32-36次。
[0029]
在可选的实施方式中，采用凝胶电泳方法检测扩增产物。
[0030]
在可选的实施方式中，凝胶电泳是于180-220v的电压下进行90-120min，所用的凝胶为浓度为6-10wt％的聚丙烯酰胺凝胶。
[0031]
本技术的有益效果包括：
[0032]
本技术提供的引物对只能特异性地扩增出蓟属植物的dna片段(扩增出的蓟属植物的dna片段的长度为132bp)，不能扩增出紫花苜蓿的dna片段，从而可根据扩增后的扩增产物获知紫花苜蓿样品中是否含有蓟属植物。通过采用上述引物对，经一次扩增待测样品即可分辨出紫花苜蓿草产品中是否含有蓟属植物，且该引物对灵敏度高，有效提高了检测结果的准确度，避免了假阳性或假阴性结果的出现。含上述引物对的试剂盒具有上述引物对所具有的效果，即使待测样品中包含较少的蓟属植物，也可以将蓟属植物检出。相应的检测方法可在1％水平上检测出紫花苜蓿草颗粒饲料中是否包含蓟属植物，可有效解决现有技术中难以通过肉眼分辨的缺陷，具有检测速度快、效率高、通量大、灵敏度和准确性高的特点。
附图说明
[0033]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0034]
图1为本技术实施例4提供的pcr扩增产物电泳图；
[0035]
图2为本技术实施例6提供的pcr扩增产物电泳图。
具体实施方式
[0036]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0037]
下面对本技术提供的检测紫花苜蓿中蓟属植物的引物对及其应用和检测方法进行具体说明。
[0038]
本技术提出检测紫花苜蓿中蓟属植物的引物对，该引物对包括引物msc1-f和引物msc1-r；
[0039]
其中，引物msc1-f的碱基序列如seq id no.1所示，引物msc1-r的碱基序列如seq id no.2所示。
[0040]
需说明的是，本技术提供的引物对只能特异性地扩增出蓟属植物的dna片段(扩增出的蓟属植物的dna片段的长度为132bp)，不能扩增出紫花苜蓿的dna片段，从而可根据扩增后的扩增产物获知紫花苜蓿样品中是否含有蓟属植物。
[0041]
通过采用上述引物对，经一次扩增待测样品即可分辨出紫花苜蓿草产品中是否含有蓟属植物，且该引物对灵敏度高，有效提高了检测结果的准确度，避免了假阳性或假阴性结果的出现。
[0042]
在一些可选的实施方式中，引物msc1-f可经修饰而得，同理地，引物msc1-r也可经修饰而得。需说明的是，引物msc1-f和引物msc1-r二者的修饰相互独立，互不约束。也即，在某些实施方式中，可仅有引物msc1-f经修饰而得；在另一些实施方式中，可仅有引物msc1-r经修饰而得；在另一些实施方式中，引物msc1-f和引物msc1-r均可经修饰而得。
[0043]
可参考地，修饰可以是在引物的5’端和/或3’端添加标记物。也即，可仅在5’端或3’端添加标记物，也可同时在5’端和3’端添加标记物。其中，标记物示例性但非限定性地可包括生物素标记物、荧光标记物或地高辛标记物。其中，若引物使用荧光标记修饰，经荧光标记修饰的引物可用于荧光定量pcr。
[0044]
此外，修饰方式还可以为磷酸化、硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰或脱氧次黄嘌呤修饰等。只要符合分子生物学实验的常规实验原理的修饰方式均可应用于本技术。
[0045]
此外面，本技术还提供了一种试剂盒，其包括上述引物对。通过设置试剂盒，可适用于各种场合，方便检测，提高检测效率。
[0046]
可参考地，该试剂盒还可包括mg
2
、dntp、dna聚合酶以及pcr缓冲液(pcr buffer)。
[0047]
可参考地，mg
2
可由mgcl2提供，dna聚合酶可以为taq酶。试剂盒中所含的mgcl2的
浓度示例性地可以为3mmol/l，dntp的浓度示例性地可以为0.2mmol/l，taq酶的浓度示例性地可以为0.1u/μl。
[0048]
该试剂盒具有上述引物对所具有的效果，即使待测样品中包含较少的蓟属植物，也可以将蓟属植物检出。
[0049]
进一步地，本技术还提供一种检测紫花苜蓿草产品中是否含有蓟属植物的方法，主要包括以下步骤：对紫花苜蓿草产品的dna进行pcr扩增，并检测扩增产物中是否含有蓟属植物的dna片段，若产物中含有蓟属植物的dna片段，则紫花苜蓿草产品中包含蓟属植物。
[0050]
pcr扩增时使用的引物包括前述上述引物对(即引物msc1-f和引物msc1-r)。在此基础上，还可同时含有其他引物对进行复合pcr，以达到同时扩增其他目的片段的目的。但其他引物需对引物msc1-f和引物msc1-r的扩增不会产生不良影响。
[0051]
在可选的实施方式中，上述紫花苜蓿草产品示例性但非限定性地可以为紫花苜蓿草颗粒饲料。
[0052]
上述方法可在1％水平上检测出紫花苜蓿草颗粒饲料中是否包含蓟属植物，可有效解决现有技术中难以通过肉眼分辨的缺陷，具有检测速度快、效率高、通量大、灵敏度和准确性高的特点。
[0053]
作为参考地，上述pcr扩增体系包括2
×
pcr master、dna模板、引物msc1-f 1、引物msc1-r和ddh2o。其中，2
×
pcr master包括mgcl2、dntp、taq酶和2
×
pcr缓冲液。
[0054]
在一些可选的实施方式中，每20μl pcr扩增体系中，可含有10μl2
×
pcr master、1μl浓度为50ng/μl的dna模板、1μl浓度为10nm的引物msc1-f、1μl浓度为10nm的引物msc1-r 1μl以及7μl ddh2o。
[0055]
在2
×
pcr master中，mgcl2的浓度可以为3mmol/l，dntp的浓度可以为0.2mmol/l，taq酶的浓度可以为0.1u/μl。
[0056]
需说明的是，上述pcr扩增体系所含的物质的用量可根据实际情况进行适当调整。
[0057]
本技术中，pcr扩增条件可参照以下方式进行设置：
[0058]
步骤a、94℃预变性4min；步骤b、94℃变性30s；步骤c、56℃退火30s；步骤d、72℃延伸20s；步骤b至步骤d循环25-40次；步骤e、72℃延伸10min。
[0059]
其中，步骤b至步骤d的具体循环次数可以为25次、26次、27次、28次、29次、30次、31次、32次、33次、34次、35次、36次、37次、38次、39次或40次。
[0060]
在一些优选的实施方式中，步骤b至步骤d可循环30-38次，如30次、31次、32次、33次、34次、35次、36次、37次或38次。在一些更优的实施方式中，步骤b至步骤d可循环32-36次，如32次、33次、34次、35次或36次。
[0061]
需说明的是，上述pcr扩增步骤和条件也可根据实际情况进行适当调整。
[0062]
本技术中，检测扩增产物可采用凝胶电泳方法。该方法成本低，速度快，无需额外修改引物。
[0063]
可参考地，上述凝胶电泳可以于180-220v的电压下进行90-120min，所用的凝胶为浓度为6-10wt％的聚丙烯酰胺凝胶。
[0064]
具体的，电压可以为180v、185v、190v、195v、200v、205v、210v、215v或220v等，也可以为180-220v范围内的其它任意值。优选为200v。
[0065]
电泳时间可以为90min、95min、100min、105min、110min、115min或120min等，也可
以为90-120min范围内的其它任意值。优选为100min。
[0066]
凝胶浓度为6wt％、6.5wt％、7wt％、7.5wt％、8wt％、8.5wt％、9wt％、9.5wt％或10wt％等，也可以为6-10wt％范围内的其它任意值。优选为8wt％。
[0067]
通过按上述条件进行凝胶电泳，可获得清晰的条带，以上述优选条件进行凝胶电泳，可获得最清晰的条带。
[0068]
需说明的是，在其它实施方式中，可采用琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳等方法检测pcr扩增的产物，也可以将pcr产物直接测序，或者使用荧光定量pcr或hrm等可以在pcr扩增的同时显示产物的方法。
[0069]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0070]
实施例1
[0071]
本实施例提供了一种检测紫花苜蓿中含有蓟属植物的引物对。
[0072]
该引物对包含引物msc1-f和引物msc1-r，其中，引物msc1-f具有如seq id no.1所示序列，引物msc1-r具有如seq id no.2所示序列。
[0073]
msc1-f(5
′‑3′
)：acacgtaatcacagccgggcg。
[0074]
msc1-r(5
′‑3′
)：ccggggtttgtttaggtgccg。
[0075]
实施例2
[0076]
本实施例提供了一种检测紫花苜蓿草产品中含有蓟属植物的试剂盒。
[0077]
该试剂盒包含如下组分：引物msc1-f和引物msc1-r、2
×
pcr master和ddh2o；
[0078]
其中2
×
pcr master包含3mm mgcl2，0.2mm dntp，0.1u/μl taq酶和2
×
pcr buffer。
[0079]
实施例3
[0080]
本实施例提供了一种检测紫花苜蓿草颗粒饲料中含有蓟属植物的方法。
[0081]
该方法包含如下步骤：
[0082]
a)收集紫花苜蓿草颗粒饲料，提取草产品基因组dna备用；
[0083]
b)使用引物msc1-f和引物msc1-r对步骤a)中提取的基因组dna进行pcr扩增；
[0084]
pcr扩增体系为20μl体系，其中包括2
×
pcr master 10μl，浓度为50ng/μl的dna模板1μl，浓度为10nm的引物msc1-f 1μl，浓度为10nm的引物msc1-r 1μl和ddh2o 7μl；其中，2
×
pcr master包括3mm mgcl2、0.2mm dntp、0.1u/μl taq酶和2
×
pcr buffer；
[0085]
pcr扩增程序为：步骤a、94℃预变性4min；步骤b、94℃变性30s；步骤c、56℃退火30s；步骤d、72℃延伸20s；步骤b至步骤d循环35次；步骤e、72℃延伸10min；
[0086]
c)pcr产物检测：
[0087]
用8wt％的page胶进行检测，100ml体系，53.0ml h2o，26.3ml聚丙烯，20ml 5
×
tbe，700μl 35％过硫酸铵，70μl temed，凝固50min，在竖板电泳仪中，200v电压电泳100min，之后用核酸染料染色，放在凝胶成像仪上照相；
[0088]
若扩增产物中包含蓟属植物dna片段，则待测紫花苜蓿草产品中掺杂有蓟属植物。
[0089]
实施例4
[0090]
本实施例主要用于验证引物msc1-f和引物msc1-r的有效性。
[0091]
提取18份不同种质紫花苜蓿、4份不同种质黄花苜蓿、8份不同种质杂花苜蓿，共31份基因组dna，将其浓度稀释为50ng/μl，用作pcr中dna模板，材料信息如表1所示；
[0092]
提取9份蓟属植物的基因组dna，将其浓度稀释为50ng/μl；用作pcr中dna模板，材料信息如表2所示；
[0093]
表1紫花苜蓿品种参试材料的信息描述
[0094][0095][0096]
注：pi开头的为美国种质资源库编号，cf开头的为我国农业部种质资源库编号。
[0097]
表2蓟属植物品种参试材料的信息描述
[0098][0099]
使用引物msc1-f和引物msc1-r对上述提取的紫花苜蓿基因组dna和蓟属植物基因组dna进行pcr扩增；
[0100]
pcr扩增体系为20μl体系，其中包括2
×
pcr master(上海生工产品编号：sk2082)10μl，浓度为50ng/μl dna模板1μl，浓度为10nm的引物msc1-f 1μl，浓度为10nm的引物msc1-r 1μl和ddh2o 7μl；
[0101]
pcr扩增程序为：步骤a、94℃预变性4min；步骤b、94℃变性30s；步骤c、56℃退火30s；步骤d、72℃延伸20s；步骤b至步骤d循环35次；步骤e、72℃延伸10min；
[0102]
用8wt％的page胶进行检测，100ml体系，53.0ml h2o，26.3ml聚丙烯，20ml 5
×
tbe，700μl 35％过硫酸铵，70μl temed，凝固50min，在竖板电泳仪中，200v电压电泳100min，之后用核酸染料染色，放在凝胶成像仪上照相，结果如图1所示，其中各泳道代表的样品如表1和表2所示，泳道m表示marker；
[0103]
紫花苜蓿1-18泳道表示以紫花苜蓿dna为模板，紫花苜蓿19-22泳道表示以黄花苜蓿dna为模板，紫花苜蓿23-31泳道表示以杂花苜蓿dna为模板；蓟属植物1-9泳道表示以9份不同的蓟属植物dna为模板；泳道“m”表示marker，“ck”表示以ddh2o为模板的负对照组。
[0104]
图1显示以9份蓟属植物基因组dna为模板的电泳条带清晰明亮，与预测的条带大小基本一致；而以31份紫花苜蓿基因组dna为模板时未扩增出条带，因此能够明显的区分出紫花苜蓿和蓟属植物。
[0105]
实施例5
[0106]
本实施例用于验证引物msc1-f和引物msc1-r扩增产物。
[0107]
为进一步验证引物msc1-f和引物msc1-r的有效性，对蓟属植物dna的扩增产物片段进行了测序。其结果显示蓟属植物dna的扩增产物中包含引物msc1-f和引物msc1-r。
[0108]
以50ng/μl蓟属植物基因组dna为模板，采用引物msc1-f和引物msc1-r进行pcr扩增。pcr体系和方法同实施例4。pcr产物经2％琼脂糖中检测，回收长度约130bp的dna片段，连接pgem-t载体后得到重组质粒pgem-t-msc1-蓟属植物，然后将该质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。将含pgem-t-msc1-蓟属植物质粒的大肠杆菌涂于含amp、iptg和x-gal的lb培养基上，37℃过夜培养，挑取3个阳性克隆菌斑，在含amp的lb液体培养基中37℃过夜摇菌培养。菌液检测后与预计条带大小相符，送上海生工生物工程有限公司进行测序，送测3个阳性克隆蓟属植物片段。
[0109]
结果显示，引物msc1-f和引物msc1-r可以很好地扩增出蓟属植物的基因片段。
[0110]
实施例6
[0111]
本实施例主要对紫花苜蓿与蓟属植物基因组不同比例的检验。
[0112]
把紫花苜蓿和蓟属植物的dna分别以100:0、99:1、75:25、50:50、25:75、1:99、0:
100的质量比例混样，然后按照实施例4提供的检测方法进行pcr和电泳，其结果如图2所示，显示引物msc1-f和引物msc1-r能够清晰的区分紫花苜蓿dna中含有1％的蓟属植物dna，因而能够较精准的检测紫花苜蓿草产品的质量。该图中100:0、99:1、75:25、50:50、25:75、1:99和0:100分别表示紫花苜蓿和蓟属植物dna的混样比例，泳道“m”表示marker，“ck”表示以ddh2o为模板的负对照组。
[0113]
综上所述，本技术提供的引物对只能特异性地扩增出蓟属植物的dna片段(扩增出的蓟属植物的dna片段的长度为132bp)，不能扩增出紫花苜蓿的dna片段，从而可根据扩增后的扩增产物获知紫花苜蓿样品中是否含有蓟属植物。通过采用上述引物对，经一次扩增待测样品即可分辨出紫花苜蓿草产品中是否含有蓟属植物，且该引物对灵敏度高，有效提高了检测结果的准确度，避免了假阳性或假阴性结果的出现。含上述引物对的试剂盒具有上述引物对所具有的效果，即使待测样品中包含较少的蓟属植物，也可以将蓟属植物检出。相应的检测方法可在1％水平上检测出紫花苜蓿草颗粒饲料中是否包含蓟属植物，可有效解决现有技术中难以通过肉眼分辨的缺陷，具有检测速度快、效率高、通量大、灵敏度和准确性高的特点。
[0114]
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。