一种pProTM质粒、其构建方法及应用与流程

一种pprotm质粒、其构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及一种pprotm质粒、其构建方法及应用，属于质粒构建技术领域。


背景技术：

2.杀稻瘟菌素抗性基因(bsdr)能够构建在多种载体上，通过杀稻瘟菌素(bsd) 筛选转染bsdr抗性基因阳性细胞，从而筛选到目的细胞，这项技术广泛应用与医学生物研究领域。不过杀稻瘟菌素筛选后会出现部分耐药细胞，达不到精确筛选阳性细胞的目的，影响研究结果的准确性。
3.红色荧光蛋白(mcherry)可以通过对细胞进行标记从而追踪细胞，在生物和医学研究中有广泛的应用。不过，该项技术通常需要使用流式细胞仪，很多实验室可能不具备开展这项实验的条件，而且，使用mcherry在活体动物中进行细胞追踪获得的图像背景信号信噪比高，因此定量检测性能差。
4.萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,简称fluc)可以在活体动物中进行细胞追踪，获得的图像背景信号信噪比低，适用于活体动物定量研究。但缺点是没有药物抗性，不能进行流氏分选从而筛选细胞，另外fluc只有在活细胞内才会产生发光现象，且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
5.综上，如何克服bsd筛选后出现耐药细胞，mcherry需要特定设备和无法在活体动物体内进行精确定量追踪，以及fluc不能筛选细胞的缺点，目前尚未有将bsdr、mcherry和fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一，是提供一种pprotm质粒的构建方法。
7.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种pprotm质粒的构建方法，包括如下步骤：
8.步骤1：构建bsdr-luciferase载体
9.步骤1.1：取blasticidin s抗性基因，进行pcr扩增反应，得到bsdr pcr 扩增产物；将bsdr pcr扩增产物进行酶切，得到bsdr酶切反应液；将bsdr酶切反应液再纯化，得到bsdr酶切产物；
10.步骤1.2：将fluc载体进行酶切，得到fluc载体酶切反应液；将fluc载体酶切反应液再纯化，得到fluc载体酶切产物；
11.步骤1.3：使用t4 dna连接酶，连接步骤1.1得到的bsdr酶切产物和步骤 1.2得到的fluc载体酶切产物，得到质粒bsd-luciferase；
12.步骤1.4：将质粒bsdr-luciferase转化至大肠杆菌dh5
ɑ
感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到bsdr-luciferase载体，其核苷酸序列如seq id no.1 所示；
13.步骤2：构建pprotm质粒
14.步骤2.1：取mcherry载体，进行pcr扩增反应，得到mcherry pcr扩增产物；将
mcherry pcr扩增产物进行酶切，得到mcherry酶切反应液；将mcherry 酶切反应液再纯化，得到mcherry酶切纯化产物；
15.步骤2.2：将步骤1.4得到的bsdr-luciferase载体进行酶切，得到 bsdr-luciferase酶切反应液；将bsdr-luciferase酶切反应液再纯化，得到 bsdr-luciferase酶切纯化产物；
16.步骤2.3：使用t4 dna连接酶，连接步骤2.1得到的mcherry酶切纯化产物和步骤2.2得到的bsdr-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌dh5 ɑ
感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到mcherry-bsd-luciferase载体，即为pprotm质粒，其核苷酸序列如seq id no.2所示；
17.步骤3：验证pprotm质粒是否构建成功
18.将步骤2构建的pprotm质粒转染人肾上皮细胞系293t，验证pprotm质粒是否构建成功。
19.其中，bsdr-luciferase载体的核苷酸序列(seq id no.1)：
20.atggccaagcctttgtctcaagaagaatccaccctcattgaaagagcaacggctacaatcaaca gcatccccatctctgaagactacagcgtcgccagcgcagctctctctagcgacggccgcatcttcact ggtgtcaatgtatatcattttactgggggaccttgtgcagaactcgtggtgctgggcactgctgctgc tgcggcagctggcaacctgacttgtatcgtcgcgatcggaaatgagaacaggggcatcttgagcccct gcggacggtgccgacaggtgcttctcgatctgcatcctgggatcaaagccatagtgaaggacagtgat ggacagccgacggcagttgggattcgtgaattgctgccctctggttatgtgtgggagggcgccaccat ggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggag agcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacat atcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacg atatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccgg tgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattg ctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaatttt gaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagg gatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtg ccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcc taaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttg gcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgttt actacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtt tctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcg ccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctccc ctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgg gctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggta aagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaa agaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaa cgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacact tcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattg gaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgc cggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtgg attacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcg
gaggagttgtgtttgtggacgaagta ccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaaggg cggaaagatcgccgtgtaa。
21.pprotm质粒的核苷酸序列(seq id no.2)：
22.atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgc acatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgag ggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtc ccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagc tgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtg acccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttccc ctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccg aggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgct gaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaa gttggacatcacctctcacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgcc actccaccggcggcatggacgagctgtacaagaagcttatggccaagcctttgtctcaagaagaatcc accctcattgaaagagcaacggctacaatcaacagcatccccatctctgaagactacagcgtcgccag cgcagctctctctagcgacggccgcatcttcactggtgtcaatgtatatcattttactgggggacctt gtgcagaactcgtggtgctgggcactgctgctgctgcggcagctggcaacctgacttgtatcgtcgcg atcggaaatgagaacaggggcatcttgagcccctgcggacggtgccgacaggtgcttctcgatctgca tcctgggatcaaagccatagtgaaggacagtgatggacagccgacggcagttgggattcgtgaattgc tgccctctggttatgtgtgggagggcgccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcg ccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccct ggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcg aaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgta tgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgc gcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtgg tgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaa attattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctca tctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcac tgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgc gtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaag tgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgag tcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagt gcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatc taatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaaga ggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattaca cccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtgga tctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgatta tgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattct ggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaa gtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcg acgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggag cacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaa gttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggt
cttaccggaaaactcgacgcaagaa aaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaa。
23.本发明的原理是：
24.第一点，本发明的步骤1中，mcherry在荧光显微镜下显示明亮的红色，可作为报告基因研究基因表达与调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。
25.第二点，本发明的步骤2中，bsdr基因编码抗稻瘟菌素抗性蛋白，转染细胞后可以抵抗稻瘟菌素的杀死作用，筛选出转染bsdr抗性的细胞。
26.第三点，firefly luciferase(fluc,萤火虫荧光素酶)催化luciferin(萤光素)氧化成oxyluciferin(氧化萤光素)，会发出生物荧光,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
27.综上，本发明通过融合bsdr、mcherry和fluc这三种基因，构建出pprotm 质粒，可以在细胞水平检测红色荧光蛋白，杀稻瘟菌素药物筛选耐药细胞，在活体动物上灵敏检测fluc，满足实验中药物筛选的要求。
28.本发明的pprotm质粒的构建方法的有益效果是：
29.1、现有技术中并未有将bsdr、mcherry和fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。本发明构建得到的pprotm质粒，整合了bsdr、mcherry和fluc 三种基因的优点，一是可以通过bsdr筛选阳性细胞，用于细胞筛选；二是可以通过mcherry鉴定药物筛选阳性细胞，区别药物筛选后的耐药细胞；三是可以通过fluc在活体动物体内追踪该质粒转染的细胞。因此，可以克服bsd筛选后出现耐药细胞，mcherry需要特定设备和不能在活体动物精确定量追踪，以及 fluc不能筛选细胞的缺点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
30.2、本发明的构建方法简单，操作容易，应用领域广泛，适合规模化推广应用，能产生积极效果。
31.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
32.进一步，步骤1.1中，所述bsdr pcr扩增反应的体系为：10xbuffer 5μ l,2mm dntps 5μl,25mm mgso42μl,10pmol/μl的seq id no.3所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的seq id no.4所示的反向引物1.5μl,模板dna 50ng,1.0u/μl的kod plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环。
33.采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将bsdr 进行pcr扩增。
34.其中，bsdr正向引物(seq id no.3)：
35.ggaagcttatggccaagcctttgtctcaag；
36.bsdr反向引物(seq id no.4)：
37.ggccatggtggcgccctcccacacataac。
38.进一步，步骤1.1中，所述bsdr pcr扩增产物进行酶切的反应体系为：10
ꢀ×
cutsmart buffer 5μl，hindⅲ酶1μl，ncoⅰ酶1μl，bsd pcr扩增产物 30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到bsd酶切反应液。
39.采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将bsdrpcr
扩增产物进行酶切。上述hindⅲ酶和ncoⅰ酶均购自neb公司。
40.进一步，步骤1.1中，所述纯化的具体方法是：
41.(1)吸附柱ca2中加入500μl的平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱ca2重新放回收集管中；
42.(2)bsdr酶切反应液凝胶中加入500μl结合液pb，50℃充分混匀，得到混合液；
43.(3)将混合液转入平衡过的吸附柱ca2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液pw进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放回收集管中；
44.(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddh2o溶解，即得到酶切bsdr酶切产物。
45.采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将bsdr酶切反应液或进行纯化。
46.进一步，步骤1.2中，所述fluc载体进行酶切的反应体系为：10
×
cutsmartbuffer 5μl，hindⅲ酶1μl，ncoⅰ酶1μl，fluc载体1μg和余量为h2o，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到fluc载体酶切反应液。
47.采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将fluc 载体进行酶切。
48.进一步，步骤1.2中，所述纯化的具体方法是：
49.(1)吸附柱ca2中加入500μl的平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱ca2重新放回收集管中；
50.(2)fluc酶切反应液凝胶中加入500μl结合液pb，50℃充分混匀，得到混合液；
51.(3)将混合液转入平衡过的吸附柱ca2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液pw进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放回收集管中；
52.(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddh2o溶解，即得到fluc载体酶切产物。
53.采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将fluc载体酶切反应液进行纯化。
54.进一步，步骤2.1中，所述mcherry pcr扩增反应的体系为：10xbuffer 5μl,2mm dntps 5μl,25mm mgso42μl,10pmol/μl的seq id no.5所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的seq id no.6所示的反向引物1.5μl, pcdna3.1-mcherry模板dna 50ng,1.0u/μl的kod plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环。
55.采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将 mcherry载体进行pcr扩增反应。
56.其中，mcherry正向引物(seq id no.5)：
57.tgctagcgccaccatggtgagcaagggcgag；
58.mcherry反向引物(seq id no.6)：
59.aagcttcttgtacagctcgtccatgc。
60.进一步，步骤2.1中，所述mcherry pcr扩增产物进行酶切的反应体系为： 10
×
cutsmart buffer 5μl，hindⅲ酶1μl，nheⅰ酶1μl，mcherry pcr扩增产物30μl和余量为h2o，
总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅 1h,得到mcherry酶切反应液。
61.采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将 mcherry pcr扩增产物进行酶切。
62.进一步，步骤2.1中，所述纯化的具体方法是：
63.(1)吸附柱ca2中加入500μl的平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱ca2重新放回收集管中；
64.(2)mcherry酶切反应液凝胶中加入500μl结合液pb，50℃充分混匀，得到混合液；
65.(3)将混合液转入平衡过的吸附柱ca2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液pw进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放回收集管中；
66.(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddh2o溶解，即得到mcherry酶切产物。
67.采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将mcherry酶切反应液进行纯化。
68.进一步，步骤2.2中，所述bsdr-luciferase载体进行酶切的反应体系为： 10
×
cutsmart buffer 5μl，hindⅲ酶1μl，nheⅰ酶1μl，bsdr-luciferase 载体1μg和余量为h2o，总体系为50μl，将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到bsd-luciferase酶切反应液。
69.采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将 bsdr-luciferase载体进行酶切。
70.进一步，步骤2.2中，所述纯化的具体方法是：
71.(1)吸附柱ca2中加入500μl的平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱ca2重新放回收集管中；
72.(2)bsdr-luciferase酶切反应液凝胶中加入500μl结合液pb，50℃充分混匀，得到混合液；
73.(3)将混合液转入平衡过的吸附柱ca2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液pw进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放回收集管中；
74.(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddh2o溶解，即得到bsdr-luciferase 酶切纯化产物。
75.采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将bsdr-luciferase 酶切反应液进行纯化。
76.进一步，步骤3中，所述转染的具体方法是：
77.在100μl减血清培养基和1μg步骤2得到的pprotm质粒，混匀，得到质粒溶液；
78.在100μl减血清培养基中加入5μl转染试剂lipo2000，混匀，静置5min, 得到lipo2000溶液；
79.将上述质粒溶液轻轻滴入上述lipo2000溶液中，混匀，静置20min，得到转染混合液；
80.将上述转染混合液滴入培养密度为80％的人肾上皮细胞系293t中，24h后，更换新的减血清培养基。
81.采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以将步骤2构建的pprotm 质粒
转染至人肾上皮细胞系293t中。
82.进一步，步骤3中，所述验证pprotm质粒是否构建成功的具体方法是：
83.(1)转染48h后,在荧光显微镜下，如果观察到红色荧光，则初步判断 mcherry构建成功；
84.(2)转染48h后,使用浓度为5μg/ml的bsd筛选3天，若bsd可以杀死未转染细胞，则初步判断bsdr构建成功；
85.(3)在293t细胞中检测到fluc表达，则判断在细胞水平fluc构建成功；
86.同时具备以上三条，则判断pprotm质粒构建成功。
87.本发明的目的之二，是提供上述构建得到的pprotm质粒。
88.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述构建得到的pprotm质粒。
89.上述构建得到的pprotm质粒的有益效果是：
90.上述构建得到的pprotm质粒，其核苷酸序列如seq id no.2所示，整合了 bsdr、mcherry和fluc三种基因的优点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
91.本发明的目的之三，是提供上述构建得到的pprotm质粒的应用。
92.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述构建得到的pprotm质粒在基因功能研究和干细胞分离中的应用。
93.上述构建得到的pprotm质粒的应用的有益效果是：
94.上述构建得到的pprotm质粒，构建在干扰载体或者高表达载体上，可以用于研究基因的功能；构建在启动子下游，可以用于分离和研究干细胞，对生物医学基础研究具有重要意义，适合规模化推广应用。
附图说明
95.图1为本发明实施例构建的pprotm质粒的结构图。
96.图2为pprotm质粒转染293t细胞后的红色荧光图。
97.图3为pprotm质粒转染293t细胞后进行bsd筛选。其中图3a表示pprotm 质粒转染293t细胞培养3天后的细胞，图3b表示pprotm质粒转染293t细胞 bsd筛选3天后的细胞，图3c表示293t细胞bsd培养3天后的细胞。
98.图4为pprotm质粒转染293t细胞bsd筛选的荧光融合图。其中图4a显示荧光镜下的细胞，图4b显示白场镜下的细胞。
99.图5为应用synergy h4全功能酶标仪，检测293t细胞和细胞 fireluciferase生物发光图。
100.图6为应用ivis luminaⅲ活体动物成像仪，检测bsd筛选293t细胞(左侧3个)和293t-pprotm细胞(右侧3个)fireluciferase生物发光图。
具体实施方式
101.以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
102.本实施例的pprotm质粒的构建方法，包括如下步骤：
103.步骤1：构建bsdr-luciferase载体
104.步骤1.1：取bsdr，进行pcr扩增反应，所述pcr扩增反应的体系为： 10xbuffer 5μl,2mm dntps 5μl,25mm mgso42μl,10pmol/μl的seq id no.3 所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的seq id no.4所示的反向引物1.5μl, 模板dna 50ng,1.0u/μl的kod plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次； 68℃延伸10min,4℃，无限循环，得到bsd pcr扩增产物。
105.将bsdr pcr扩增产物进行酶切，所述bsdr pcr扩增产物进行酶切的反应体系为：10
×
cutsmart buffer 5μl，hindⅲ酶1μl，ncoⅰ酶1μl，bsdr pcr 扩增产物30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到bsdr酶切反应液。
106.将bsdr酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
107.(1)吸附柱ca2中加入500μl的平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱ca2重新放回收集管中；
108.(2)bsdr酶切反应液凝胶中加入500μl结合液pb，50℃充分混匀，得到混合液；
109.(3)将混合液转入平衡过的吸附柱ca2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液pw进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放回收集管中；
110.(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddh2o溶解，即得到酶切bsdr酶切产物。
111.步骤1.2：将fluc载体进行酶切，所述fluc载体进行酶切的反应体系为： 10
×
cutsmart buffer 5μl，hindⅲ酶1μl，ncoⅰ酶1μl，fluc载体1μg 和余量为h2o，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到 luciferase载体酶切反应液。
112.将fluc载体酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
113.(1)吸附柱ca2中加入500μl的平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱ca2重新放回收集管中；
114.(2)fluc酶切反应液凝胶中加入500μl结合液pb，50℃充分混匀，得到混合液；
115.(3)将混合液转入平衡过的吸附柱ca2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液pw进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放回收集管中；
116.(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddh2o溶解，即得到fluc载体酶切产物。
117.步骤1.3：使用t4 dna连接酶，连接步骤1.1得到的bsdr酶切产物和步骤 1.2得到的fluc载体酶切产物，得到质粒bsdr-luciferase。
118.步骤1.4：将质粒bsdr-luciferase转化至大肠杆菌dh5
ɑ
感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到bsdr-luciferase载体，其核苷酸序列如seq id no.1 所示。
119.步骤2：构建pprotm质粒
120.步骤2.1：取mcherry载体，进行pcr扩增反应，所述pcr扩增反应的体系为：10xbuffer 5μl,2mm dntps 5μl,25mm mgso42μl,10pmol/μl的seq id no.5 所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的seq id no.6所示的反向引物1.5μ l,pcdna3.1-mcherry模板dna 50ng,1.0u/μl的kod plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环，得到mcherry pcr扩增产物。
121.将mcherry pcr扩增产物进行酶切，所述mcherry pcr扩增产物进行酶切的反应体
系为：10
×
cutsmart buffer 5μl，hindⅲ酶1μl，nheⅰ酶1μl， mcherry pcr扩增产物30μl和余量为h2o，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h,得到mcherry酶切反应液。
122.将mcherry酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
123.(1)吸附柱ca2中加入500μl的平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱ca2重新放回收集管中；
124.(2)mcherry酶切反应液凝胶中加入500μl结合液pb，50℃充分混匀，得到混合液；
125.(3)将混合液转入平衡过的吸附柱ca2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液pw进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放回收集管中；
126.(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddh2o溶解，即得到mcherry酶切产物。
127.步骤2.2：将步骤1.4得到的bsdr-luciferase载体进行酶切，所述 bsdr-luciferase载体进行酶切的反应体系为：10
×
cutsmart buffer 5μl，hind
ꢀⅲ
酶1μl，ncoⅰ酶1μl，bsdr-luciferase载体1μg和余量为h2o，总体系为50μl，将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到bsdr-luciferase酶切反应液。
128.将bsdr-luciferase酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
129.(1)吸附柱ca2中加入500μl的平衡液bl，12000rpm离心1mi，倒掉收集管中的废液，吸附柱ca2重新放回收集管中；
130.(2)bsdr-luciferase酶切反应液凝胶中加入500μl结合液pb，50℃充分混匀，得到混合液；
131.(3)将混合液转入平衡过的吸附柱ca2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液pw进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放回收集管中；
132.(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddh2o溶解，即得到bsdr-luciferase 酶切纯化产物。
133.步骤2.3：使用t4 dna连接酶，连接步骤2.1得到的mcherry酶切纯化产物和步骤2.2得到的bsdr-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌dh5 ɑ
感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到mcherry-bsd-luciferase载体，即为pprotm质粒，其核苷酸序列如seq id no.2所示，其结构图，如图1所示。
134.步骤3：验证pprotm质粒是否构建成功
135.将步骤2构建的pprotm质粒转染人肾上皮细胞系293t，验证pprotm质粒是否构建成功。
136.所述转染的具体方法是：
137.在100μl减血清培养基和1μg步骤2得到的pprotm质粒，混匀，得到质粒溶液；
138.在100μl减血清培养基中加入5μl转染试剂lipo2000，混匀，静置5min, 得到lipo2000溶液；
139.将上述质粒溶液轻轻滴入上述lipo2000溶液中，混匀，静置20min，得到转染混合液；
140.将上述转染混合液滴入培养密度为80％的人肾上皮细胞系293t中，24h后，更换新的减血清培养基。
141.所述验证pprotm质粒是否构建成功的具体方法是：
142.(1)转染48h后,在荧光显微镜下，如果观察到红色荧光，则初步判断 mcherry构建成功；
143.(2)转染48h后,使用浓度为2μg/μl的bsd筛选3天，若bsd可以杀死未转染细胞，则初步判断bsdr构建成功；
144.(3)在293t细胞中检测到luciferase表达，则判断在细胞水平 fireluciferase构建成功；
145.同时具备以上三条，则判断pprotm质粒构建成功。
146.pprotm质粒感染293t细胞后的红色荧光图，如图2所示。结果是pprotm 质粒的感染293t细胞后发红色荧光，可构建在干扰载体/高表达载体或者启动子下游，用于研究基因功能或者分离干细胞。
147.pprotm质粒感染293t细胞后进行bsd筛选，如图3所示。结果是 293t-pprotm培养3天后铺满培养皿(图3a),293t-pprotm经过bsd筛选3天阳性克隆(图3b)；293t细胞经过bsd培养3天全部死亡(图3c)，说明感染 pprotm质粒的293t细胞可以经过bsd筛选并分离出稳定转染的细胞。
148.pprotm质粒感染293t细胞后进行bsd筛选和荧光融合图，如图4所示。白场镜下293t-pprotm经过bsd筛选3天阳性克隆(图4a),荧光显微镜下显示 293t-pprotm经过bsd筛选3天的红色荧光蛋白细胞(图4b),说明经过bsd筛选后的293t-pprotm可以在镜下观察到红色荧光蛋白，克服了bsd筛选后出现耐药细胞，且不需要使用流式细胞仪的结果。
149.应用synergy h4全功能酶标仪检测pprotm转染293t细胞后的 fireluciferase生物发光，如图5所示。结果是bsd筛选后的293t-pprotm细胞fireluciferase生物发光是未转染pprotm的293t细胞约80倍，见表1所示，说明构建的质粒可用于fireluciferase生物发光，可对luciferase进行定量的结果。
150.表1
151.293t293t293t293t-pprotm293t-pprotm293t-pprotm111411814822847
152.应用ivis luminaⅲ活体动物成像仪检测pprotm质粒转染293t细胞后的 fireluciferase生物发光，如图6所示。结果是应用ivis luminaⅲ活体动物成像仪检测到未转染pprotm质粒的293t细胞没有观察到fireluciferase生物发光，bsd筛选后的293t-pprotm细胞fireluciferase生物发光，三个重复组 roi平均值为1
×
106，说明构建的质粒可用于fireluciferase生物发光，可对 luciferase进行定量的结果,见表2所示。
153.表2
154.293t293t293t293t-pprotm293t-pprotm293t-pprotm0003.167
×
1083.053
×
1082.960
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108155.现有技术中并未有将bsdr、mcherry和fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。本发明成功构建得到的pprotm质粒，整合了bsdr、mcherry和fluc 三种基因的优点，一是可以通过bsdr筛选阳性细胞，用于细胞筛选；二是可以通过mcherry鉴定药物筛选阳性细胞，区别药物筛选后的耐药细胞；三是可以通过fluc在活体动物体内追踪该质粒转染的细胞。因此，可以克服bsd筛选后出现耐药细胞，mcherry需要特定设备和不能在活体动物精确定
量追踪，以及 fluc不能筛选细胞的缺点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
156.本实施例还提供上述构建方法构建得到的pprotm质粒。
157.本实施例还提供上述构建方法构建得到的pprotm质粒在基因功能研究和干细胞分离中的应用。
158.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。