DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用的制作方法

技术特征：
1.dkk-3基因甲基化诊断试剂体系，其特征在于：用亚硫酸氢盐处理基因组dna，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行pcr，通过电泳检测msp扩增产物，如果用针对处理后甲基化dna链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化，反之，说明被检测的位点不存在甲基化；用亚硫酸氢盐处理基因组dna，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计bsp引物进行pcr，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对pcr产物进行测序就可以判断cpg位点是否发生甲基化，将pcr产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率；在非cpg岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的dna双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的cpg岛，若这些cpg岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经pcr扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的gc含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。2.dkk-3基因甲基化诊断试剂体系试剂盒，其特征在于，包括生物体内dna的cpg位点被亚硫酸氢盐修饰后，其gc比例发生改变，基于亚硫酸氢盐修饰，dna的甲基化检测方法包括msp、bsp、hrm和dna甲基化芯片，用亚硫酸氢盐修饰基因组dna，所有未发生甲基化的胞嘧啶(c)被转化为尿嘧啶(u)，而甲基化的胞嘧啶则不变，从而导致基因组dna碱基比例发生改变。3.dkk-3基因甲基化诊断试剂体系的应用，其特征在于，包括以下步骤：s1：基因组dna的提取及浓度测定，设计引物时要求所扩增的片段中必须含有一个或一个以上的cpg岛，以保证检测可以正常进行；s2：基因组dna进行化学修饰，主要采用亚硫酸氢钠修饰，注意温度和时问的掌握，修饰后的dna单链比较脆弱，操作应轻柔，避免剧烈振荡，增加亚硫酸氢钠的浓度，同时适当减少基因组dna的量可防止假阳性的出现；s3：以修饰后的基因组dna为模板，分别用甲基化引物和非甲基化引物进行pcr扩增，可选用热启动酶或者采用降落pcr等方法提高pcr扩增的特异性；s4：将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳以判断结果。

技术总结
本发明公开了DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用，涉及基因甲基化技术领域。DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用，DKK-3基因甲基化诊断试剂体系，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR，通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化，反之，说明被检测的位点不存在甲基化，该DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用，敏感性高，待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡也可检测。适用于各种样本类型。转化效率高，在3小时内完成富含GC的DNA的完全转化。DNA的完全转化。


技术研发人员：李琼英
受保护的技术使用者：深圳市赛尔生物技术有限公司
技术研发日：2021.09.29
技术公布日：2022/3/25