一种鉴别长吻鮠遗传性别的分子标记及应用的制作方法

一种鉴别长吻鮠遗传性别的分子标记及应用
1.技术领域
2.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴别长吻鮠遗传性别的分子标记及应用。
3.技术背景
4.硬骨鱼类具有多样、复杂的性别决定机制，鱼类的性别决定分为遗传性别决定（genetic sex determination, gsd）和环境性别决定（eenvironmental sex determination, esd），gsd主要是通过异型性染色体进行判断，如雄性异型配子xx/xy型和雌性异型配子zw/zz型。然而，绝大多数的鱼类的性染色体还不能通过目前的细胞遗传学分析进行鉴定。因此，研究者通过开发性别特异分子标记鉴定鱼类遗传性别，目前已获得超过30种鱼类的性别特异dna标记，这些标记包括扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，aflp）、随机扩增多态性dna（random amplification polymorphism dna，rapd）、微卫星标记 (simple sequence repeat，ssr)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)和苷酸序列的插入/缺失长度多态性（insertion-deletion, indel）等。
5.长吻鮠(leiocassis longirostris)又名鮰鱼，属鲶形目(siloriformes)、鲿科(bagridae)、鮠属(leiocassis)，因其吻部较一般鱼长，故名长吻鮠。长吻鮠肉质细嫩、口感爽滑、且肌间刺少、营养丰富，民间素有“不食江团，不知鱼味”之说，其鳔十分肥厚，干制成“鱼肚”是享誉中外的珍肴。长吻鮠是我国名贵淡水经济鱼类之一，多分布于我国长江干流、通江湖泊和各大支流的下流水域。长吻鮠具有显著的雌雄生长二态性，雄鱼生长速度显著快于雌鱼，进行全雄化养殖可以在不增加养殖量的前提下大幅度提高产量，开发其单性育种与单性养殖技术具有重要的产业意义。但在其性腺发育成熟之前，长吻鮠的雌鱼和雄鱼外部形态完全没有区别，无法用肉眼识别雌雄个体；通过细胞遗传学手段没有发现异型性染色体，也无法通过性染色体鉴定其遗传性别；这极大地限制了全雄化育种技术的发展。因此，急需开发一种鉴别长吻鮠遗传性别的分子标记用于标记辅助育种。
6.

技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种快速精准鉴定长吻鮠性别的分子标记，进而加快长吻鮠全雄化育种进程。
8.本发明的另一目的在于提供上述鉴定长吻鮠性别的检测方法。
9.本发明的又一目的在于提供上述鉴定长吻鮠性别的检测试剂盒。
10.本发明目的是通过如下技术方案实现的：一种鉴别长吻鮠遗传性别的分子标记，其特征在于：所述分子标记为长吻鮠第7号
染色体第1130404位碱基处的一段长32bp的插入/缺失的核苷酸序列，为seq id no.1所示，雌性个体具有seq id no.1序列，雄性个体缺失seq id no.1序列。
11.进一步的，用于检测上述分子标记的特异性引物为：前引物f1，核苷酸序列为seq id no.2所示，后引物r1，核苷酸序列为seq id no.3所示。
12.上述一种利用分子标记鉴别长吻鮠遗传性别的检测方法，其特征在于：（1）提取待测基因组dna；（2）以待测基因组dna为模板，采用上述特异性引物进行pcr扩增，pcr反应体系为：10 x buffer (mg
free) 1 μl，25 mm mgcl
2 1μl，dntp mix (10 mm each) 1.6μl，正向、反向引物 (10 mm) 各1μl，模板 dna 1μl, taqdna聚合酶 (5u/μl) 0.2 μl，ddh2o 13.2μl；pcr反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s, 50 ℃退火30 s, 72 ℃ 延伸45 s左右，循环30次; 72 ℃延伸10 min；（3）根据电泳图对长吻鮠的遗传性别进行判断，仅存在410bp特异性片段的个体为雌性长吻鮠，有410 bp 和378 bp两条片段的个体为雄性长吻鮠；一种用于鉴别长吻鮠遗传性别的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括如下引物，前引物为f1，核苷酸序列为seq id no.2所示，后引物为r1，核苷酸序列为seq id no.3所示。
13.本发明具有如下有益效果：本发明可以在长吻鮠胚胎、仔稚鱼、幼鱼及成鱼时期简便、快速、稳定地鉴别遗传性别。将该indel分子标记应用于生产实践可以有效鉴定不同发育阶段长吻鮠的性别，有助于长吻鮠单性育种技术的开发，实现长吻鮠的全雄养殖，能在不增加养殖量的前提下大幅度提高产量，从而增加长吻鮠养殖的经济收益。
14.附图说明
15.图1 长吻鮠10个雄性和10雌性个体dna检测电泳图；图2 长吻鮠雄性特异分子标记在20个个体中的验证电泳图。
16.具体实施方式
17.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
18.1、引物设计通过对长吻鮠基因组重测序，并对雌性和雄性染色体序列进行比对，在第7号染色体上发现一段长32bp的多态性的插入/缺失，此插入/缺失位于第1130404-1130436位碱基处，核苷酸序列为seq id no.1所示，雌性个体具有seq id no.1序列，雄性个体缺失seq id no.1序列。在上述indel位点两侧设计引物，前引物为f1，核苷酸序列为seq id no.2所示，后引物为r1，核苷酸序列为seq id no.3所示。
19.2、dna提取使用上海生工ezup柱式动物基因组dna抽提试剂盒提取待测长吻鮠的基因组dna，提取完成的dna采用琼脂糖凝胶电泳验证是否提取成功，结果如图1所示。供试的10条雌性
长吻鮠和10条雄性长吻鮠均来自四川省农业科学院水产研究所眉山市青神县岷江中游珍稀鱼类保护基地。
20.3、pcr扩增验证供试长吻鮠性别以上述10条雌性长吻鮠和10条雄性长吻鮠的基因组dna为模板，使用上述引物对进行pcr扩增获得pcr扩增产物。
21.pcr反应体系为：10 x buffer (mg
free) 1 μl，25 mm mgcl
2 1μl，dntp mix (10 mm each) 1.6μl，正向、反向引物 (10 mm) 各1μl，模板 dna 1μl, taqdna聚合酶 (5u/μl) 0.2 μl，ddh2o 13.2μl。pcr反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s, 50 ℃退火30 s, 72 ℃ 延伸45 s左右，循环30次; 72 ℃延伸10 min。
22.对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，仅存在410bp特异性片段的个体为雌性长吻鮠，有410 bp 和378 bp两条片段的个体具有seq id no.1序列的缺失，为雄性长吻鮠，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
23.通过pcr扩增对供试的20条长吻鮠的性别进行验证，准确率为100%，说明该分子标记能够准确高效的对长吻鮠的遗传性别进行鉴定，为实现长吻鮠的全雄养殖提供了有效途径。