罗中链霉菌TRM49605遗传操作体系的构建方法与流程

罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法
技术领域
1.本发明涉及遗传操作体系技术领域。具体地说是罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法。


背景技术：

2.链霉菌可以产生丰富的次级代谢产物而且具有复杂的形态分化过程，在基础研究和工业应用方面都有极大的价值，再加上链霉菌可以产生多种抗细菌、抗真菌、抗肿瘤活性的抗生素，目前链霉菌已成为微生物研究中的重点。罗中链霉菌(streptmyces luozhongensis)trm 49605是由本发明技术人员所在实验室发现的具有我国自主知识产权的链霉菌新种，也是衣霉素(tunicamycin)的产生菌。罗中链霉菌trm 49605接合转移体系的建立及优化是对该链霉菌的调控基因和次级代谢产物合成基因进行研究的必要前提。同时，遗传操作体系的构建也使得有目的地对罗中链霉菌trm 49605进行定向改造基因、提高其基因的表达水平以改造菌种的生产能力、基因重组产生新化合物等成为可能，为实现基因工程菌株的构建和提高链霉菌的抗生素产生能力奠定基础。
3.建立合适高效的遗传操作系统是对菌种进行基因改造的重要前提。属间接合转移以其简便性、高效性的优点广泛应用于链霉菌的基因操作之中。传统链霉菌接合转移主要依靠大肠杆菌(escherichia coli)萌发的性菌毛和链霉菌孢子萌发的菌丝发生接触时进行基因转移。
4.因此对菌株孢子预萌发的状态进行摸索很有必要，除此之外还需要对热激温度和时间、供受体比例、抗生素覆盖时间进行摸索，以确定最佳的接合转移条件。如遗传背景十分清楚的天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)，常规方法为刮取在ms平板上生长5-6天的新鲜孢子，用2
×
yt培养基洗涤次2次，50℃热激10min，迅速冷却至室温。将处理好的供体大肠杆菌et12567(puz8002，pset152)按1:1比例与天蓝色链霉菌孢子悬浮液混合，均匀涂布在ms培养基上，30℃培养15-16h，用1ml含抗生素和萘啶酮酸(作用浓度均为50μg/ml)的无菌水溶液覆盖。30℃继续恒温培养5-7天直至接合子长出。
5.然而罗中链霉菌trm 49605，前期研究发现，罗中链霉菌trm 49605其菌丝发达，但无明显孢子产生。传统的链霉菌接合转移操作并不能适用于不易产孢和难以培养的放线菌。也有报道，对于不产孢子的菌，可采用电转或原生质体转化进行处理，但是方法复杂。
6.目前对于罗中链霉菌trm 49605的接合转移操作还没有成功报道，为方便后续对罗中链霉菌trm 49605进行基因改造，因此有必要对trm 49605的遗传操作体系进行构建。


技术实现要素：

7.为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法，为有目的地对罗中链霉菌trm 49605进行定向改造基因、提高其基因的表达水平以改造菌种的生产能力、基因重组产生新化合物等提供方法。
8.为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
9.罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法，利用在液体培养基中直接获得的罗中链霉菌trm 49605菌丝体为供体细胞，与受体细胞大肠杆菌进行结合转移，得到接合子，再对接合子进行纯化与培养。
10.上述罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法，罗中链霉菌trm 49605菌丝体供体细胞的培养：在甘油管中保存的罗中链霉菌trm 49605菌丝体，直接接种于tsb菌丝体生长培养基培养基。
11.上述罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法，在tsb菌丝体生长培养基中：30℃220rpm/min摇床上培养30h。
12.上述罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法，受体细胞大肠杆菌et12567的培养：挑取大肠杆菌et12567单菌落，接种于5ml的lb大肠杆菌液体液体培养基，加入氯霉素、安普霉素和卡那霉素混合抗生素溶液，进行培养。
13.上述罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法，氯霉素、安普霉素和卡那霉素混合抗生素溶液中：5μl的25mg/ml的氯霉素，2.5μl的50mg/ml的安普霉素和2.5μl的50mg/ml卡那霉素，然后在37℃培养12h。
14.上述罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法，供体细胞与受体细胞结合转移方法：将罗中链霉菌trm 49605菌丝体和大肠杆菌菌体先分别用lb大肠杆菌液体培养基洗涤2遍后重悬菌体，按照供体细胞罗中链霉菌trm 49605菌丝体和受体细胞大肠杆菌的数量比为100:1的比例混合，涂布于高氏一号接合转移培养基平板上，再用萘啶酮酸和安普霉素溶液覆盖，使溶液均匀铺满整个平板，吹干后，置于培养箱中培养。
15.上述罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法，供体细胞罗中链霉菌trm 49605菌丝体和受体细胞大肠杆菌混合后，涂布于高氏一号接合转移培养基平板上置于37℃培养箱中培养约16～20h，再加入抗生素液体覆盖，抗生素液体为1ml的灭菌ddh2o中添加母液浓度为50mg/ml的安普霉素10μl和母液浓度为25mg/ml的萘啶酮酸20μl，使溶液均匀铺满整个平板，吹干后，置于30℃培养箱中培养5-7天。
16.上述罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法，接合子进行纯化与培养：随机挑取接合子，划线于含安普霉素和萘啶酮酸的高氏一号接合转移培养基上，在培养箱中培养，挑取菌丝，接种于tsb菌丝体生长培养基中培养，用于基因组抽取。
17.上述罗中链霉菌trm 49605遗传操作体系的构建方法，划线于高氏一号接合转移培养基上，在30℃培养箱中培养5天，挑取菌丝，接种于tsb菌丝体生长培养基中培养36h，得到纯化后的接合子，用于基因组抽取和pcr验证；含安普霉素和萘啶酮酸的高氏一号接合转移培养基的制备方法为：100ml的tsb菌丝体生长培养基，灭菌后冷却，再往培养基中加入200μl的浓度为25mg/ml的萘啶酮酸和100μl的浓度为50mg/ml的安普霉素，使得萘啶酮酸的终浓度为50μg/ml,安普霉素的终浓度为50μg/ml。
18.本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
19.1、对于罗中链霉菌trm 49605这种不产孢子的放线菌，使用菌丝体进行接合转移。与孢子接合转移相比，菌丝体接合转移摸索条件更少，操作更加简单。大肠杆菌与罗中链霉菌trm 49605的接合转移作为引入dna的一种手段有以下几点优势：方法简单，不依赖于原生质体的形成与再生；可以避开宿主菌的限制性系统障碍；可利用件实现载体高效的从大肠杆菌向链霉菌中转移；用于接合转移的质粒都是穿梭质粒，大肠杆菌中这些质粒能够自
主复制，更加方面表达载体的构建和操作。转化效率相比其他方法来说也有显著提高。该方法可以适用于大多数的放线菌，转化的遗传稳定性比较高。
20.2、一般的可以产生孢子的菌丝体，只能用固体培养基进行培养，即需要在平板上产苞，然后才能收集到大量新鲜的孢子，而直接在液体培养基中不容易产苞，生长后期虽然也会长菌丝体，但是菌丝体比较老，无法进行后续的研究使用。而本技术中的罗中链霉菌trm 49605没有办法产孢子，在液体培养基中可以采集到新鲜、健壮的菌丝体，菌丝体量大且生长速度快。从而实现仅采用液体培养基获得罗中链霉菌trm 49605菌丝体完成接合转移的过程。
21.3、与本技术的罗中链霉菌trm 49605菌丝体接合转移相比，孢子接合转移较为复杂，对孢子的状态较为严苛，不仅需要对产孢固体培养基进行筛选，孢子萌发的状态以及热激温度都需要考虑。而直接菌丝体液体培养接合转移则不同，通过tsb液体培养基将菌丝体培养至对数生长期，即可与供体细菌进行基因转移，便于操作。
22.4、本技术的罗中链霉菌trm 49605菌丝体接合转移的方法，相比于不产孢子的电转、原生质体转化的处理方法，简单方便。原生质体转化：制成原生质体，需要去细胞壁，壁厚的话原生质体不好去掉，过程复杂、效率很低、一批失败率很高、细胞壁过程很复杂；电转：效率不高、长出几个转化子或者假阳性比例高，菌丝体的结果不好。
附图说明
23.图1本发明实施例中罗中链霉菌trm 49605的生长曲线图；
24.图2本发明实施例中供体与受体细胞的比例与接合转移效率的关系图；
25.图3本发明实施例中链霉菌trm 49605接合子pcr验证结果图。
具体实施方式
26.一、实验材料
27.1.1菌株：
28.罗中链霉菌(streptmyces luozhongensis)trm 49605，由塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室和中国典型培养物保藏中心保藏，大肠杆菌(escherichia coli)et12567(puz8002，pset152)为供体菌株；pset152质粒为大肠杆菌-链霉菌穿梭整合型质粒，具有安普霉素抗性基因aac(3)ⅳ及噬菌体φc 31整合酶基因int的整合位点attp。
29.1.2培养基：
30.lb大肠杆菌液体培养基：将黄豆粉20g、甘露醇20g和琼脂20g混合均匀后，加蒸馏水至1000ml,调节其ph至7.2。
31.tsb菌丝体生长培养基：tsb(胰蛋白胨大豆肉汤培养基)30g，水1000ml。
32.高氏一号接合转移培养基：将20.0g可溶性淀粉、0.01g feso4·
7h2o、0.5g k2hpo4，1.0g kno3、0.5g mgso4·
7h2o、16.0g琼脂和1000ml水混匀，调节ph至7.2～7.4。
33.1.3试剂：
34.安普霉素、卡那霉素、氯霉素、硫链丝菌素、氨苄霉素和萘啶酮酸。
35.二、实验方法及结果
36.2.1罗中链霉菌trm 49605抗生素耐受性
37.对于链霉菌而言，不同种之间有很大的差异性，对抗生素的耐受性也不相同。为确定罗中链霉菌trm 49605的抗性标记，选取六种抗生素作为遗传操作的筛选标记。将罗中链霉菌trm 49605活化后，取新鲜菌丝划线于含有不同抗生素的平板上，30℃培养3～5d，观察菌体的生长情况。
38.结果如表1所示。从表1中可以看出，罗中链霉菌trm 49605对安普霉素(apr)、卡那霉素(kana)、硫链丝菌素(thio)和氯霉素(cml)敏感，对氨苄霉素(amp)和萘啶酮酸(nal)不敏感。
39.表1罗中链霉菌trm 49605对不同抗生素的敏感性
[0040][0041]
注：“ ”代表对抗生素敏感，
“‑
代表对抗生素不敏感
[0042]
2.2罗中链霉菌trm 49605生长曲线的测定
[0043]
与菌丝体接合转移相比，孢子接合转移较为复杂，对孢子的状态较为严苛，不仅需要对孢子培养基进行筛选，孢子萌发的状态以及热激温度都需要考虑。而菌丝体接合转移则不同，其依靠的是菌丝与供体接触发生基因转移，因此仅需对菌丝体的生长状态进行摸索即可。
[0044]
甘油保存的菌丝划线至高氏一号接合转移培养基，培养5天后，挑取一环至tsb菌丝体生长培养基，每隔6h取一次样品，测定菌丝体干重。结果如图1所示，选择对数生长中期24～30h的菌丝体用于接合转移。
[0045]
2.3供受体比例对接合转移效率的影响
[0046]
供体细胞(s.luozhongensis)罗中链霉菌与受体细胞大肠杆菌e.coli的比例也是影响接合转移效率的重要因素，在使用菌丝体数量为107(cfu)的条件下，摸索适宜的供体菌数量，按照供受比为109:107(100:1)，108:107(10:1)，107:107(1:1)的比例进行接合转移实验，根据接合效率确定供体菌与受体菌的比例。结果如图2所示，从表中可以看出，当供受比为100:1时，接合转移频率最高。
[0047]
2.4抗生素覆盖时间对接合转移效率的影响
[0048]
按照供体细胞(s.luozhongensis)罗中链霉菌与受体细胞大肠杆菌e.coli供受体比例为108:107，涂布在高氏一号接合转移培养基之后，在培养12h，14h，16h，18h，20h，22h，24h之后，涂布抗生素液体，抗生素液体为1ml的灭菌ddh2o中添加20μl的萘啶酮酸(50mg/ml)和20μl的安普霉素母液(50mg/ml)，根据接合效率确定抗生素覆盖时间。由表2可知，抗生素添加时间为20h时，接合转移频率最高。
[0049]
表2抗生素覆盖时间对接合转移效率的影响
[0050][0051]
2.5罗中链霉菌trm 49605接合转移及接合子验证
[0052]
链霉菌是一个高度分化的菌属，不同菌株之间有很大的差异，适用于一种链霉菌的转化方法不一定适用其它链霉菌，因此需要根据所研究的菌种摸索最适的转化方法。
[0053]
前期研究发现，罗中链霉菌trm 49605气生菌丝发达，但无明显孢子产生。为方便后续对罗中链霉菌trm 49605进行基因改造，因此，有必要对罗中链霉菌trm 49605进行菌丝体接合转移体系的构建。
[0054]
(1)菌丝体培养：罗中链霉菌trm 49605直接接种于50ml tsb菌丝体生长培养基中，30℃下220rpm/min摇床上培养30h。
[0055]
(2)大肠杆菌et12567(puz8002，pset152)培养：挑取大肠杆菌et12567(puz8002，pset152)单菌落，接种于5ml lb大肠杆菌液体液体培养基，加入5μl的25mg/ml的氯霉素，2.5μl的50mg/ml的安普霉素和2.5μl的50mg/ml卡那霉素，37℃培养12h。
[0056]
(3)接合转移：收集罗中链霉菌trm 49605菌丝体和大肠杆菌e.coli后，用lb大肠杆菌液体培养基各洗涤2遍，用适当体积lb大肠杆菌液体培养基重悬菌体，取处理好的大肠杆菌与罗中链霉菌trm 49605菌液各500μl混合均匀，其中罗中链霉菌trm 49605菌丝体和大肠杆菌e.coli数量为100:1，涂布在高氏一号接合转移培养基上。37℃恒温培养16～20h后，再加入抗生素液体覆盖，抗生素液体为1ml灭菌ddh2o中添加母液浓度为50mg/ml的安普霉素10μl和母液浓度为25mg/ml的萘啶酮酸20μl，30℃下继续恒温培养5-7天后检查平板上长出的菌落。
[0057]
2.6接合子的pcr扩增反应验证
[0058]
(1)接合子纯化与培养
[0059]
随机挑取接合转移转子，划线于含安普霉素和萘啶酮酸的高氏一号接合转移培养基上，在30℃培养箱中培养5天，挑取适量菌丝，接种于菌丝体液体培养基中培养约36h，用于基因组抽取。含安普霉素和萘啶酮酸的高氏一号接合转移培养基的制备方法为：100ml的tsb菌丝体生长培养基，灭菌后冷却，再往培养基中加入200μl的浓度为25mg/ml的萘啶酮酸和100μl的浓度为50mg/ml的安普霉素，使得萘啶酮酸的终浓度为50μg/ml,安普霉素的终浓度为50μg/ml。
[0060]
(2)基因组抽提
[0061]
取少量菌丝体，以1
×
te buffer洗涤3遍后，用500ul 1
×
te buffer重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为5mg/ml，37℃孵育45min，加入sds至其终浓度为1％，颠倒混匀后加入rnase至终浓度为10μg/ml，37℃孵育10min，加入蛋白酶k至终浓度为0.2mg/ml，37℃水浴中孵育约30min，加入200μl 5m nacl，颠倒混匀并冷却至室温，加入500μl酚氯仿(苯酚：氯仿：
异戊醇＝25：24：1)，充分颠倒混匀，12000rpm离心10min，取上层水相，加入等体积预冷异丙醇，颠倒混匀，将dna用枪头挑出，用70％的乙醇洗涤两遍，待乙醇挥发后，加入适量水溶解dna，可用于pcr。
[0062]
(3)pcr验证
[0063]
根据安普霉素抗性基因设计1对引物(aprf：5
′
－cttcgcatcccgcctctgg－3
′
和aprr：5
′
－caatacgaatggcgaaaag－3
′
)，扩增片段大小为750bp。pcr检测结果如图3所示，接合转化子及阳性对照pset152质粒均扩增出750bp左右的条带，而野生型链霉菌trm 49605dna未扩增出目的片段，由此证实pset152质粒已成功转入到罗中链霉菌trm 49605中。图3中：1-15为链霉菌trm49605接合子；m表示dna marker；
“‑”
表示野生型；“ ”表示质粒pset152。
[0064]
2.7采用电转、原生质体转化的处理方法
[0065]
(1)采用电转化方法进行遗传转化：
[0066]
通过对最适电压筛选：将等量的菌悬液加入电转化杯，分别设置电击电压1kv，2kv，3kv，均未得到正确的转化子；
[0067]
最适电击时间筛选：将等量的菌悬液加入电转化杯，分别设置电击时间为4s,5s,6s三个梯度，均未得到正确的转化子；
[0068]
电击处理后，将罗中链霉菌trm49605接种在r2ye,rm14,yms,r3,g y,sfm,hi培养基中，筛选最适的恢复培养基，均未得到正确的转化子。
[0069]
(2)采用原生质体转化的方法进行遗传转化：
[0070]
筛选了溶菌酶最适浓度和作用时间，设置10.0mg/ml,20.0mg/ml,30.0mg/ml等多个溶菌酶浓度梯度，酶解加入到10ml溶菌酶溶液中的悬浮菌丝体，37℃水浴保温15min，30min,45min,60min,75min,80min后镜检，发现溶菌酶去除细胞壁的效果不好，均没有发现有原生质体形成。
[0071]
罗中链霉菌trm 49605不产孢子，但是采用电转、原生质体转化的处理方法，却不能得到菌丝体。