一种用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针及其制备和使用方法与流程

1.本发明属于铜离子检测的荧光分子探针的制备及应用技术领域，具体涉及一种用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针及其制备和使用方法。


背景技术：

2.铜是一种必需的微量元素，是人体第三丰富的微量元素(铁和锌之后)。异常的铜代谢可能会阻碍血浆铜蓝蛋白(cp)的合成，广泛沉积在器官和组织中如肝脏和大脑，导致肝硬化和肝豆状核变性。铜也会影响铁的代谢和造血功能，从而影响中枢神经系统，并影响骨和结缔组织代谢，能量代谢，心血管系统和内分泌系统。一方面，缺乏cu
2
可严重影响儿童的大脑发育，另一方面，当体内cu
2
浓度超过在正常范围内，可以生成高度活性的羟基自由基干扰细胞代谢，导致威尔逊氏病、肌萎缩侧索硬化症、门克斯综合征、阿尔茨海默病和帕金森病等疾病。因此，铜离子的检测对生物科学和医学都有着重大意义。因此，合理设计和合成高效传感器来选择性识别铜离子是超分子化学中的一个重要课题。尽管之前的工作涉及开发各种各样的化学和物理传感器来检测cu
2
，大多数这些方法需要昂贵的设备，涉及耗时和费力的程序只能由训练有素的专业人员执行，这极大地限制了这些cu
2
传感器的实际应用。为了简单、方便和低成本，需要易于制备的cu
2
比色传感器。现有的检测铜离子的探针主要有以香豆素、罗丹明、萘酰亚胺等为荧光团的荧光分子探针，其中罗丹明衍生物荧光探针化合物发表在《传感和驱动器》（sensors and actuators b）2013年第182卷的第273-279页的文章《一种在活细胞识别hg
2
及在水相中比色识别cu
2
的新型荧光探针》（a new probe for fluorescent recognition of hg
2 in living cells and colorimetric detection of cu
2 in aqueous solution）上，其结构式如a 式所示：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
b香豆素衍生物荧光探针是发表在《无机化学学报》（inorganica chimica acta）2021年第519卷的120280-120287页上的文章《一种可高灵敏度和选择性地检测cu
2
和s
2-的比色型“on-off-on”色酮衍生物荧光探针》(a chromone derivative as a colorimetric and
ꢀ“
on-off-on
”ꢀ
fluorescent probe for highly sensitive and selective detection of cu
2 and s
2-)上，其结构式如b式所示。
3.上述两种识别cu
2
的探针识别铜离子后波长不变，只是表现为荧光的增强或淬灭，这种信号易受ph值、浓度、共存的竞争离子的干扰，导致在识别过程检测数据不准确，且识
别cu
2
的灵敏度也相对较低。


技术实现要素：

4.本发明是要解决现有的识别cu
2
的荧光探针易受到ph影响、共存金属离子干扰、水溶性差、灵敏度低和选择性差的问题，而提供一种用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针及其制备和使用方法。
5.本发明的用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针为n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺，其结构式为：。
[0006]
上述的用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针的制备方法是采用n-丁基-4-羟基-3-甲酰基-1,8-萘酰亚胺和2-羟基-1-萘腙缩合而成，其反应式如下：其具体制备步骤为：1）、按n-丁基-4-羟基-3-甲酰基-1,8-萘酰亚胺与2-羟基-1-萘腙的摩尔比为1:（1~2），将n-丁基-4-羟基-3-甲酰基-1,8-萘酰亚胺与2-羟基-1-萘腙加入到酸性溶剂中，回流反应7~8 h，趁热抽滤，得到反应混合物；2）、将反应混合物利用二甲基亚砜和无水乙醇的混合溶剂重结晶，冷却后析出大量固体；过滤，收集滤饼，得到n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺，即为用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针。
[0007]
上述的用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针的使用方法按以下步骤进行：1）、将用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针溶解于二甲基亚砜与hepes缓冲溶液的混合液中，得到荧光分子探针溶液；其中hepes缓冲溶液混合液的ph = 7.4，混合液中二甲基亚砜与hepes缓冲溶液的体积比为1：9，混合液中荧光分子探针的浓度为10 μ mol/l；
2）、取荧光分子探针溶液，向其中加入待测样品，混合均匀，得到样品溶液；3）、用荧光光谱仪测试荧光分子探针溶液在发射波长为595 nm时的荧光强度b1，再测试样品溶液在发射波长为595 nm时的荧光强度b2，如果b2≤10�，则可判定样品中含有cu
2
。
[0008]
本发明的这种含有萘酰亚胺荧光基团的cu
2
的荧光探针可实现在水环境体系中对cu
2
的选择性识别功能，不受水溶液中其他共存金属离子的影响，具有较强的抗干扰能力。该荧光分子探针在识别cu
2
之后在ph值为4~11范围内都显示荧光淬灭现象，该荧光分子探针识别响应非常迅速，能够在70秒内完成在水体系环境中的cu
2
。
[0009]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该荧光分子探针的制备所需原料简单易得，成本低；反应条件温和，产物分离提纯过程简单，收率高，产率高达70~79%。本发明的荧光探针可应用在水体系中cu
2
的检测，具有极高的应用价值。
附图说明
[0010]
图1是实施例1中荧光分子探针在dmso/hepes缓冲溶液 (v/v = 1/9，ph = 7.4) 体系中的紫外光谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。
[0011]
图2是实施例1中荧光分子探针在dmso/hepes缓冲溶液 (v/v = 1/9，ph = 7.4) 体系中的荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
[0012]
图3是实施例1中荧光分子探针在dmso/hepes缓冲溶液 (v/v = 1/9，ph = 7.4)体系中加入20 μ mol/l浓度的金属阳离子 (cr
3
, ag

, co
2
, cu
2
, hg
2
, k

, ni
2
, cd
2
, pb
2
, ba
2
, mg
2
, al
3
, ca
2
, zn
2
, fe
3
,na

) 后荧光发射光谱变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
[0013]
图4是实施例1中荧光分子探针在dmso/hepes缓冲溶液(v/v = 1/9，ph = 7.4)体系中加入400 μ mol/l浓度的cu
2
与400 μ mol/l浓度的不同共存金属离子后的荧光发射光谱变化情况，横坐标为金属离子，纵坐标为荧光强度。
[0014]
图5是实施例1中荧光分子探针在dmso/hepes缓冲溶液(v/v = 1/9，ph = 7.4)体系中，荧光发射光谱随cu
2
浓度(0-2当量) 增加的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
[0015]
图6是实施例1中荧光分子探针的荧光强度随cu
2
的浓度变化曲线图。
[0016]
图7是实施例1中荧光分子探针检测cu
2
最低检测限的测定曲线图。
[0017]
图8是实施例1中荧光分子探针在dmso/hepes缓冲溶液(v/v = 1/9)体系中，加入20μ mol/l浓度的cu
2
前后在不同ph值 (ph值从3-12) 条件下的荧光发射光谱变化情况，横坐标为ph值，纵坐标为荧光强度。
[0018]
图9是实施例1中荧光分子探针在dmso/hepes缓冲溶液(v/v = 1/9，ph = 7.4)体系中，加入cu
2
后荧光发射光谱随时间响应的变化情况，横坐标为测试时间，纵坐标为荧光强度。
具体实施方式
[0019]
具体实施方式一：本实施方式的用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针为n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺，其结构式为：
。
[0020]
具体实施方式二：具体实施方式一所述的用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针的制备方法如下：1）、按n-丁基-4-羟基-3-甲酰基-1,8-萘酰亚胺与2-羟基-1-萘腙的摩尔比为1:（1~2），将n-丁基-4-羟基-3-甲酰基-1,8-萘酰亚胺与2-羟基-1-萘腙加入到酸性溶剂中，回流反应7~8h，趁热抽滤，得到反应混合物；2）、将反应混合物利用二甲基亚砜和无水乙醇的混合溶剂重结晶，冷却后析出大量固体；过滤，收集滤饼，得到n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺，即为用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针。
[0021]
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一中的酸性溶剂为冰醋酸、浓硫酸或浓盐酸；其它与具体实施方式二相同。
[0022]
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二至三之一不同的是步骤三中二甲基亚砜和无水乙醇的体积比是1：（4~8）；其它与具体实施方式二至三之一相同。
[0023]
具体实施方式五：具体实施方式一所述的用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针的使用方法按以下步骤进行：1）、将用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针溶解于二甲基亚砜与hepes缓冲溶液的混合液中，得到荧光分子探针溶液；其中hepes缓冲溶液混合液的ph = 7.4，混合液中二甲基亚砜与hepes缓冲溶液的体积比为1：9，混合液中荧光分子探针的浓度为10 μ mol/l；2）、取荧光分子探针溶液，向其中加入待测样品，混合均匀，得到样品溶液；3）、用荧光光谱仪测试荧光分子探针溶液在发射波长为595nm时的荧光强度b1，再测试样品溶液在发射波长为595 nm时的荧光强度b2，如果b2≤10�，则可判定样品中含有cu
2
。
[0024]
hepes缓冲溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液。
[0025]
用以下实施例验证本发明的有益效果：实施例1：本实施例的用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针的制备方法如下：1）、将297mg (1 mmol) n-丁基-4-羟基-3-甲酰基-1,8-萘酰亚胺与186mg (1 mmol) l-组氨酸加入到15 ml冰醋酸中，回流反应7~8 h，趁热抽滤，得到反应混合物；2）、将滤饼用二甲基亚砜和无水乙醇混合溶剂重结晶，得到n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺，即为用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针。经计算产率为73%。
[0026]
本实施例制备的用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针的红外光谱、质谱及在氘取代的dmso溶剂中的1h nmr谱数据如下： 1
h nmr (400 mhz, cdcl3) δ 9.69 (s, 1h), 8.99 (s, 1h), 8.77 (d, j=8.4. hz, 1h), 8.69 (m, 1h), 8.58 (s, 1h), 8.17 (m, 1h), 7.93 (d, j=9.2 hz, 1h), 7.81 (m, 2h), 7.63-7.60 (m, 1h), 7.45 (m, 1h), 7.27 (m, 1h), 7.25(m, 1h),4.20-4.17 (t, j=7.8hz, 3h), 1.77 (m, 2h), 1.51 (m, 2h), 1.01-0.97 (t, j=7.6 hz, 3h). ft-ms, m/z: 466.39974(m h

); anal. calcd for c
28h23
n3o4: c, 72.24; h, 4.98;n, 9.03.found: 72.30; h, 4.95；n, 8.99.从以上数据可以得到本实施例制备的用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针的结构式如下：，其化学名称为：n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺。
[0027]
将本实施例制备的荧光分子探针进行紫外光谱检测，方法如下：按n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺的浓度为10 μ mol/l ，将n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺加入到dmso/hepes缓冲 (v/v = 1/9，ph = 7.4) 溶液中，1min后检测其紫外吸收光谱，得到的紫外吸收光谱图如图1所示，由图1可知，本实施例制备的荧光分子探针的紫外最大吸收波长在442 nm。（注：dmso /hepes缓冲 (v/v = 1/9，ph = 7.4)溶液是指dmso与hepes缓冲溶液的混合液，其中hepes缓冲溶液ph = 7.4，混合液中dmso与hepes缓冲溶液的体积比为1：9）将本实施例制备的荧光分子探针的进行荧光发射光谱测试，方法如下：按n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺的浓度为10 μ mol/l ，将荧光分子探针加入到dmso/hepes缓冲(v/v = 1/9，ph = 7.4)溶液中，2min后检测其荧光发射光谱，荧光发射光谱图如图2所示。由图2可知，本实施例制备的荧光分子探针在595 nm处具有发射峰，荧光强度较强。
[0028]
测试本实施例制备的荧光分子探针与不同金属离子作用后的荧光发射光谱，具体方法如下：按n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺的浓度为10 μ mol/l，n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺加入到dmso/hepes缓冲 (v/v = 1/9，ph = 7.4)溶液中，再按金属离子的浓度为20 μ mol/l加入一种金属离子，2 min后溶液的荧光发射光谱，其中金属离子分别为cr
3
, ag

, co
2
, cu
2
, hg
2
, k

, ni
2
, cd
2
, pb
2
, ba
2
, mg
2
, al
3
, ca
2
, zn
2
, fe
3
,na

，得到的荧光发射光谱图如图3所示，由图3可知，加入不同的金属离子之后，特征发射峰没有明显的变化。当加入cu
2
时，荧光
强度淬灭到原来的1/2。因此，荧光分子探针n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺对cu
2
有良好的选择性识别能力。
[0029]
将本实施例制备的荧光分子探针进行抗金属离子干扰测试，方法如下：按n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺的浓度为10 μ mol/l ，将n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺加入到dmso/hepes缓冲 (v/v = 1/9，ph = 7.4)溶液中，再分别加入20 μ mol/l的常见金属离子 (cr
3
, ag

, co
2
, cu
2
, hg
2
, k

, ni
2
, cd
2
, pb
2
, ba
2
, mg
2
, al
3
, ca
2
, zn
2
, fe
3
,na

)，2 min后检测溶液的荧光发射光谱变化，取荧光强度峰值进行比较 (如图4所示)。由图4可以看出，其他常见金属离子 (cr
3
, ag

, co
2
, cu
2
, hg
2
, k

, ni
2
, cd
2
, pb
2
, ba
2
, mg
2
, al
3
, ca
2
, zn
2
, na

) 与cu
2
的同时存在，cu
2
依然能够使荧光分子探针的荧光强度发生淬灭，淬灭强度与不存在干扰金属离子时相当，即荧光分子探针cu
2
的选择性识别不受其他共存金属离子的干扰。
[0030]
检测本实施例制备的荧光分子探针对cu
2
选择性的灵敏度，具体方法如下：按n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺的浓度为10μmol/l ，将n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺加入到dmso/hepes缓冲(v/v = 1/9，ph = 7.4)溶液中，加入0.01~2当量的cu
2
，测试出的荧光图谱变化情况 (如图5所示)；由图5可以看出，随着cu
2
的量的不断增加，595nm处的发射峰的强度不断减小，且波长也发生蓝移，当cu
2
的浓度等于荧光分子探针的浓度时，荧光不再继续淬灭，波长蓝移至525nm。图6是荧光强度随cu
2
的浓度变化曲线图，从图6中也可以形象看出，荧光强度随cu
2
的量的增加，荧光强度不断减小，并且幅度逐渐变缓，当达到1当量时，荧光强度几乎不再变化，且荧光强度随cu
2
浓度变化呈很好的线性关系。
[0031]
图7是本实施例的荧光分子探针检测cu
2
最低检测限的测定曲线图。横坐标为cu
2
浓度的对数值，纵坐标y=f
0-f，其中f0为cu
2
浓度为0时的荧光强度，f为加入不同浓度cu
2
的荧光强度，线性拟合方程为y = 1.3564
ꢀ×
105x 52318，r
2 = 0.9997，计算得出最低检测限为9.28nm。
[0032]
测试ph值对本实施例制备的荧光分子探针的影响，即检测荧光分子探针在不同ph值条件下加入cu
2
前后荧光变化情况，具体如下：按n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺的浓度为10 μ mol/l将n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺加入dmso/hepes缓冲(v/v = 1/9，ph = 7.4)溶液中，分别测定3
–
12之间不同ph值条件下的荧光发射光谱。同样测定加入20 μ mol/l的cu
2
之后不同ph值条件的的荧光发射光谱光谱，结果如图8所示。由图8可以看出，荧光分子探针在加入cu
2
后，荧光分子探针的荧光强度明显减弱，荧光淬灭明显，荧光强度几乎不随ph值变化而变化。这说明本实施例中的荧光分子探针对cu
2
识别在ph值3-12时具有稳定的荧光强度，受ph值变化较小。
[0033]
测试本实施例制备的荧光分子探针对cu
2
响应时间，具体方法如下：按n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺的浓度为10 μmol/ln-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺加入到dmso/hepes缓冲 (v/v = 1:9，ph = 7.4) 溶液中，在体系中加入20 μmol/l的cu
2
，在不同的时间条件下 (10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120s) 测试其荧光发射光谱。取荧光发射光谱中的最大值得到探针对cu
2
的相应时间变化曲线，如图9所示。从图9中可以看到，在加入cu
2
后，40s之内荧光分子探针与cu
2
即可以完成络合，荧光发射强度不再猝灭。说明此探针对cu
2
的响应非常迅速，70s之
7.81 (m, 2h), 7.63-7.60 (m, 1h), 7.45 (m, 1h), 7.27 (m, 1h), 7.25(m, 1h),4.20-4.17 (t, j=7.8hz, 3h), 1.77 (m, 2h), 1.51 (m, 2h), 1.01-0.97 (t, j=7.6 hz, 3h). ft-ms, m/z: 466.39974(m h

); anal. calcd for c
28h23
n3o4: c, 72.24; h, 4.98;n, 9.03.found: 72.30; h, 4.95；n, 8.99.从以上数据可以得到本实施例制备的用于铜离子检测的萘酰亚胺类荧光分子探针的结构式如下：，其化学名称为：n-丁基-1-羟基-2-[（2-羟基萘亚甲基）亚联氨甲基]萘酰亚胺。