一株地衣芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株地衣芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.我国海域广阔，约300万平方公里。海带养殖面积巨大，产量一直居于世界首位，2019年产量160余万吨。如此巨大的产量，如何利用海带成为广受关注的研究内容之一。
3.海带(laminaria japonica)是多年生大型食用藻类，含有丰富的褐藻胶、岩藻糖胶、褐藻淀粉等海带多糖，并含有酸性聚糖类物质、岩藻半乳多糖硫酸酯、大叶藻素、半乳糖醛酸、昆布氨酸、牛磺酸、双歧因子等多种活性成分。海带是一种营养丰富的食用褐藻，含有60多种营养成分。据测定，每100g海带中含8g蛋白质、0.1g脂肪、0.57mg胡萝卜素、0.09mg vb、0.36mg vb1、1.6mg烟酸、1.177mg钙、1.50mg铁，2.16mg磷，还含有丰富的褐藻酸、纤维素、甘露醇以及多种微量元素。海带热量低、蛋白质含量适中、矿物质含量丰富，是一种理想的天然海洋食品。海带酶解干粉是通过多种酶制剂将海带原浆进行降解，充分释放里面的活性成分，然后喷雾干燥处理成干粉。海带酶解干粉里面含有多种氨基酸、维生素、多糖和微量元素，非常适合作为微生物发酵培养基使用。
4.蛋白酶是一种重要的饲料用酶。断奶仔猪由于受断奶应激的影响，内源蛋白酶分泌减少，常常导致对日粮中蛋白的消化率下降，既浪费了饲料，又影响了幼龄动物的生长，更是经常引起腹泻等疾病的发生。因此，在饲料中补充蛋白酶对动物的生长性能具有很好的促进作用。另外，近年来，我国饲料预消化技术发展迅速，其中，蛋白酶就是最常用的一种饲料预消化酶制剂产品。通过体外将动物不易消化的饲料原料用蛋白酶处理成多肽，更容易被动物吸收和利用。
5.蛋白酶在肉制品的加工中也有广泛的应用。肉质细嫩的肉制品更容易被消费者所接受。肉制品经蛋白酶的水解作用会使其中的蛋白质内部发生交联反应，并产生特殊的化学基团，改变蛋白质内部空间结构，使肉制品中的蛋白质化学性质发生改变，从而改变其水溶性、水合性和乳化性等功能特性，从而改善肉制品的质量。木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、无花果蛋白酶等蛋白酶，这些蛋白酶能够通过对肌肉纤维和胶原蛋白进行不同程度的降解，从而实现肉质嫩化。
6.除了饲料工业和食品工业以外，蛋白酶在酿造、皮革、纺织、医药等领域也都有着重要的应用。
7.因此，开发高效蛋白酶生产技术受到高度重视。而普通的蛋白酶生产过程中，需要补充多种微量元素菌种才能生产蛋白酶。


技术实现要素：

8.为解决上述技术问题，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌及其应用。
9.作为本发明的第一个方面，本发明从威海荣成海边的土壤中分离并纯化得到了菌株sdhy-2101。
10.该菌株在牛奶平板筛选培养基中可以产生透明圈。利用分子生物学手段，采用16s rdna基因特异引物对该菌株特异性片段进行扩增，将扩增产物回收并测序，将测序结果进行blast分析，结果发现与菌株sdhy-2101高度同源的菌株为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)，鉴定其为地衣芽孢杆菌种。
11.作为本发明的第二个方面，本发明提供了一种微生物发酵液，由所述地衣芽孢杆菌sdhy-2101菌株发酵而成。
12.作为本发明的第三个方面，本发明提供了一种微生物菌剂，包含所述地衣芽孢杆菌sdhy-2101菌株。
13.作为本发明的第四个方面，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌sdhy-2101的发酵方法，所述地衣芽孢杆菌发酵时采用如下培养基：每升培养基中含葡萄糖5～10g，玉米粉90～110g，豆粕粉25～35g，酵母粉5～10g，海带酶解干粉30g，ph值为7.5～8.0。
14.进一步的，所述培养基中每升培养基含葡萄糖5～10g，玉米粉90～110g，豆粕粉35g，酵母粉10g，海带酶解干粉30g，ph值为8.0。
15.进一步的，所述培养基中每升培养基含葡萄糖5g，玉米粉90g，豆粕粉35g，酵母粉10g，海带酶解干粉30g，ph值为8.0。
16.进一步的，所述地衣芽孢杆菌sdhy-2101的发酵方法包括以下步骤：步骤1)将所述培养基装入摇瓶中，高压灭菌；步骤2)将高压灭菌后的培养基降至室温，接种地衣芽孢杆菌sdhy-2101；步骤3)将接种后的培养基33～50℃震荡培养4～8h，然后降温度至32～35℃，继续培养12～48h。
17.进一步的，所述步骤2)中地衣芽孢杆菌sdhy-2101的接种量为1％，种子液浓度为0.5～1.0x109cfu/ml。
18.进一步的，所述步骤3)中将接种后的培养基37℃震荡培养4～8h，然后降温度至32～35℃，继续培养36h。
19.作为本发明的第五个方面，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌sdhy-2101在蛋白酶生产领域中的应用。
20.本发明中所述葡萄糖购自于国药集团化学试剂有限公司；所述酵母粉购自于安琪酵母公司；所述玉米粉购自于生活超市购买；所述豆粕粉购自于山东九州化工有限公司；所述海带酶解干粉购自于威海市世代海洋科技有限公司。
21.与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
22.(1)本发明中，sdhy-2101菌株发酵液的酶活普遍在发酵36h时的酶活最高，说明36h是地衣芽孢杆菌sdhy-2101摇瓶发酵工艺中的最适宜发酵时间。
23.(2)本发明中，每升培养基中添加葡萄糖5g，玉米粉90g，豆粕粉35g，酵母粉10g，海带酶解干粉30g，sdhy-2101菌株的酶活效果最好，在发酵36h时的酶活甚至达到了18589u。说明每升培养基中含葡萄糖5g，玉米粉90g，豆粕粉35g，酵母粉10g，海带酶解干粉30g的培养基是sdhy-2101菌株摇瓶发酵工艺中的最佳培养基。
24.(3)本发明中，sdhy-2101菌株发酵液在催化温度为37℃时的酶活值和相对催化活性最高。说明37℃的催化温度是sdhy-2101菌株摇瓶发酵工艺中的最适宜催化温度。
25.(4)本发明中，sdhy-2101菌株发酵液在ph值为8.0左右条件下的酶活值和相对催化活性最高。说明8.0是sdhy-2101菌株摇瓶发酵工艺中的最适宜ph值。
26.(5)本发明充分利用海带酶解粉含有丰富微量元素、多糖、蛋白质等营养成分的优点，将其配制成高产蛋白酶培养基，同时结合使用分离筛选得到的地衣芽孢杆菌sdhy-2101菌株，可有效促进蛋白酶的分泌表达，使得蛋白酶摇瓶发酵活力大幅度提高，最高可达18589u，具有很好的应用前景。
27.保藏证明说明：
28.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
29.保藏编号：cgmcc no.24022；
30.保藏日期：2021年12月02日；
31.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
32.分类学命名：地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)。
附图说明
33.图1为实施例1中sdhy-2101菌株在含脱脂牛奶底物平板上的透明圈；
34.图2为实施例2中sdhy-2101菌株16s rdna序列的pcr扩增结果；
35.图3为实施例2中sdhy-2101菌株基于16s rdna序列的系统发育树；
36.图4为实施例5中sdhy-2101菌株发酵液在不同温度下的蛋白酶相对催化活性；
37.图5为实施例5中sdhy-2101菌株发酵液在不同ph值条件下的蛋白酶相对催化活性。
具体实施方式
38.本发明公开了一株高产蛋白酶的地衣芽孢杆菌sdhy-2101菌株及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数来实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，这些都被视为包括在被发明内。本发明所述的地衣芽孢杆菌己经通过较规范的实施例进行了描述，相关人员明显能在不摆脱本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动和适当的变更与组合，来实现和应用本发明技术。
39.下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
40.实施例1高产蛋白酶菌株的筛选
41.称取5g威海荣成海边的土壤样品，溶解于100ml lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l)中，37℃、220r/min振荡培养3h，静置30min，吸取上清液0.1ml，进行梯度稀释，直到10-8
为止。涂布于含有1.5％脱脂牛奶的lb平板(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l、琼脂10g/l)上。37℃培养24h，观察菌落周围是否具透明圈。对于有透明圈的菌株划线接种lb平板培养基，结果如图1所示。37℃培养，待菌落生长清晰后，4℃冰箱保存。
42.实施例2筛选菌株的分子鉴定
43.将实施例1中筛选出的菌株接种于lb培养基，在37℃摇床220rpm摇菌12h以上，取1.5ml培养液，于室温10,000rpm离心5min，收集菌体，弃上清，用试剂盒(omega公司产品)提取基因组dna，进行pcr扩增。
44.扩增体系包括：总基因组dna 1μl(0.5μg)、2xpcr mix 25μl、引物27f和1492r各1μ
l、灭菌水22μl。引物序列分别如seq id no.2和seq id no.3所示。
45.引物27f(seq id no.2)：(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)；
46.引物1492r(seq id no.3)：(5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)。
47.扩增条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，扩增30个循环，1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，获得1条约1500bp扩增条带，结果如图2所示。然后直接送公司测序，测序得到sdhy-2101菌株的16s rna序列如seq idno.1所示。
48.将此细菌的16s rna测序与ncbi中的序列进行比对分析，得到的系统发育树如图3所示。比对可知，此细菌与多种地衣芽孢杆菌的序列一致性都达到99％以上，因此，确定此菌种为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)，命名为sdhy-2101。
49.实施例3地衣芽孢杆菌sdhy-2101摇瓶发酵培养基的配制
50.发酵培养基组分如表1所示。按表1配方配制培养基，500ml三角瓶中培养基装液量为100ml，每瓶内各种成分单独称量，再加入海带酶解粉3.0g。每个编号培养基做3个平行。溶解后，121℃高温灭菌20min，备用。
51.表1 摇瓶发酵培养基组分构成
52.序号葡萄糖(g/l)玉米粉(g/l)豆粕粉(g/l)酵母粉(g/l)ph值15902557.525902558.0359025108.0459035108.05511035108.061011035108.071011035107.58101103557.59101102557.51010902557.5
53.实施例4地衣芽孢杆菌sdhy-2101的摇瓶发酵工艺
54.sdhy-2101菌株的活化：用接种环挑取sdhy-2101单菌落，在lb琼脂平板上划线，于37℃培养箱中培养过夜。然后用接种环挑取sdhy-2101单菌落接种10ml lb液体培养基中，于37℃摇床220r/min培养18h，备用。
55.摇瓶发酵工艺方法步骤：用灭菌水调整种子液浓度为0.5～1.0x109cfu/ml。按照1％接种量接种发酵培养基。37℃、220r/min培养4～8h，然后降低培养温度为32～35℃，继续培养至48h。
56.实施例5地衣芽孢杆菌sdhy-2101发酵上清液蛋白酶活性测定
57.1.不同发酵时间酶活的测定
58.每隔12h，取1ml实施例4中的发酵液，在室温条件下，10,000r/min离心5min，取上清液，测酶活，结果如表2所示。
59.蛋白酶活力单位的定义：在40℃和ph 8.0的条件下，每min水解酪蛋白产生1μg酚类化合物(以酪氨酸等同物表示)的酶量为1个酶活单位，用u表示。
60.表2 不同发酵时间发酵上清液的酶活(u)
61.序号12h24h36h48h13529
±
2586766
±
1368856
±
4435689
±
33423345
±
1784582
±
4336577
±
2756344
±
25834555
±
2766980
±
3357855
±
4127744
±
45545789
±
3668990
±
34518589
±
12215436
±
33055809
±
3267880
±
27916400
±
24013099
±
23464798
±
4447980
±
56415609
±
37012062
±
45576752
±
2699006
±
54614720
±
46611450
±
12384666
±
3737830
±
3779022
±
48811256
±
33396584
±
4099056
±
26614098
±
50513008
±
476105655
±
3777900
±
35810992
±
11013097
±
333
62.通过对不同发酵时间发酵上清液的酶活进行测量分析，发现：随着发酵时间的增加，sdhy-2101菌株发酵液的酶活呈现先上升后降低的趋势，而且普遍在发酵36h时的酶活最高。说明36h时是sdhy-2101菌株的最适宜发酵时间。
63.同时，从表2的实验数据中还可以看出：序号为4～6的培养基效果较好，在发酵36h时的酶活都在15000u以上，尤其是序号为4的培养基效果最好，在发酵36h时的酶活甚至达到了18589u。说明4号培养基，即每升培养基中含葡萄糖5g，玉米粉90g，豆粕粉35g，酵母粉10g，海带酶解干粉30g的培养基，是sdhy-2101菌株高产蛋白酶的最佳培养基。
64.2.最适催化温度的确定：在ph 8.0的条件下，分别在20～70℃测定发酵液的蛋白酶活性，结果如表3所示。同时以最高活性为100％，计算不同温度的相对催化活性，结果如图4所示。
65.表3 不同温度条件下的酶活性(ph8.0时测定)
66.温度(℃)203040506070酶活(u)3933.18884.311246.49896.46410.44494.6
67.注：每个温度设3个平行，取平均值，相对误差不超过8％.
68.由表3可知：随着催化温度的升高，sdhy-2101菌株发酵液的酶活值呈现先上升后降低的趋势，而且在催化温度为40℃左右时的酶活值高达11246.4u。
69.同时由图4可知：随着催化温度的升高，sdhy-2101菌株发酵液的相对催化活性也呈现先上升后降低的趋势，而且在催化温度为37℃时相对催化活性最高，达到了100％。
70.综合可知：37℃左右的催化温度是sdhy-2101菌株在高产蛋白酶方面的最适宜催化温度。
71.3.最适催化ph值的确定：在40℃，分别在ph 3.0～10.0条件下测定发酵液的蛋白酶活性，结果如表4所示。同时以最高活性为100％，计算不同ph值的相对催化活性。每个测定设3个重复，相对误差不超过10％，计算平均值，结果如图5所示。
72.表4 不同ph值下酶的活性(40℃时测定)
73.ph值5.06.07.08.09.010.0酶活(u)8678.011032.312322.014496.511307.39132.8
74.注：每个ph值设3个平行，取平均值，相对误差不超过8％.
75.由表4和图5可知：随着ph值的增加，sdhy-2101菌株发酵液的酶活值以及相对催化活性也都呈现先上升后降低的趋势，而且在ph值为8.0左右的条件下，酶活值最高，达到14496.5u，相对催化活性也最高，达到了100％。说明8.0是sdhy-2101菌株在高产蛋白酶方面的最适宜ph值。
76.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。