一种志贺氏菌多糖表达质粒及其用途的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种志贺氏菌多糖表达质粒及其用途。


背景技术：

2.志贺氏菌属(shigella castellani)是一类革兰阴性短小杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，主要流行于发展中国家，通称痢疾杆菌，耐寒，能在普通琼脂培养基上经过24小时生长，形成直径达2mm大小、半透明的光滑型菌落。
3.本技术人在202010575533.8专利中指出针对细菌性痢疾的疫苗研究从20世纪40、50年代就已经开展，但是目前仍有问题需要解决。现有研究已经发现了一些具有潜力的候选疫苗靶标，其中志贺氏菌的脂多糖(lipopolysaccharide)能够表现较好的保护力，有研究证明志贺氏菌脂多糖与蛋白的复合体能够激发小鼠很高的血清抗体滴度，并且能够表现一定的保护力，临床实验表明，福氏2a(shigellaflexneri 2a)的o抗原多糖能够引起特异的免疫保护，但脂多糖最关键的问题在于进入宿主体内，不能有效的到达宿主免疫系统被免疫系统识别，从而有一定概率导致免疫失败。这一缺陷极大的限制了志贺氏菌疫苗在实际临床中的应用效果，因此开发新的疫苗迫在眉捷，如何开发新的疫苗能够保证高效刺激宿主产生免疫反应，这一问题目前亟待解决。其中如何提高o抗原多糖的表达是首要解决的问题。
4.之前的研究已经表明，志贺氏菌的o抗原多糖合成基因基因簇(16kb)在低拷贝质粒中比在高拷贝质粒中要更稳定，如何通过质粒改造使得o抗原多糖能够在重组表达系统中稳定高效的表达是当前面临的一个技术问题。鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种志贺氏菌多糖表达质粒及其用途，为一种高拷贝的重组表达质粒，进一步的是要构建一种高拷贝的重组表达志贺氏菌多糖o型抗原基因的重组表达质粒。
6.本发明通过以下技术方案予以实现：
7.本发明一方面提供一种志贺氏菌多糖表达质粒的构建方法，该方法以psc101质粒为载体，在将psc101质粒上的复制蛋白repa的第99位亮氨酸突变为赖氨酸，获得所述志贺氏菌多糖表达质粒，所述复制蛋白repa序列如seq id no.1所示。
8.进一步地，所述赖氨酸的密码子采用aag密码子。
9.进一步地，所述志贺氏菌多糖表达质粒还包含编码志贺氏菌多糖o型抗原基因的核苷酸。
10.进一步地，所述志贺氏菌多糖o型抗原基因的核苷酸序列如seq no：2所示。
11.本发明另一方面还提供上述方法构建的志贺氏菌多糖表达质粒。
12.本发明还提供了志贺氏菌多糖表达质粒在重组表达蛋白中的应用。
13.与现有技术相比，本发明基于经典的低拷贝质粒复制子psc101，通过突变改造，获
得了一种新的质粒复制子psc101-repa-l99k。本发明中构建的psc101-repa-l99k-sco重组表达质粒表达能力强，为进一步开发相关疫苗奠定了基础。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
15.图1为志贺氏菌o抗原基因簇上游片段扩增。
16.图2为志贺氏菌o抗原基因簇下游片段扩增。
17.图3为志贺氏菌o抗原基因簇表达质粒的的pcr鉴定结果。
18.图4为志贺氏菌o抗原基因簇表达质粒的脂多糖图谱鉴定结果，其中1：空白对照；2： psc101-repa-l99-sco表达结果；3：psc101-repa-l99k-sco表达结果。
具体实施方式
19.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
20.除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法、试剂均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna 技术及相关领域的常规技术或常规试剂。
21.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
22.实施例1：体外改造构建psc101-repa-l99k复制子
23.1)在已报道的野生型psc101复制子(cohen et al.1973proc natl acad sci us a；cohen et al.1977j bacteriol；vocke c and bastia d.1983proc natl acad sciusa)序列基础上，合成带有该野生型复制子的质粒pgent1(它带有psc101-repa野生型复制子，kan抗性以及lacz的筛选标记)，设计针对repa蛋白l99k位突变的引物，其中，
24.f引物为：gtccactggaaaatnnnaaagcctttaaccaaaagattcctgatt；
25.r引物为：attttccagtggacaaactatgccaagttctcaagcgaaaaatta，在上海生工公司合成该引物。
26.2)利用pcr扩环突变的方法，构建psc101复制子repa蛋白l99k位的突变。其中， pcr的体系为：la taq dna聚合酶：0.5μl；10
×
pcr buffer(mg2 )：2.5μl；dntp：3μl；f 引物：0.25ul；r引物：0.25ul；模板质粒：2ul。pcr程序为：95℃，4min；30个循环的95℃， 30s-》55℃，30s-》72℃，4min；72℃，10min。
27.3)利用dna胶回收试剂盒(天根生物)割胶回收携带repa-l99k突变的pgent1质粒(简称pgent1-l99n)。
28.4)将步骤3获得的pgent1-l99n转化大肠杆菌top10菌株，涂布lb(kan)抗性平板， 37℃过夜培养。同时将野生型的质粒pgent1转化大肠杆菌top10菌株，分别涂布lb(kan) 抗
性平板及lb(amp)抗性平板，37℃过夜培养，作为接下来的实验对照。repa蛋白l99k的序列seq id no.1如下：
29.yqatkvygtlffqfpkvllysptyknlsaeaklayvilkdrleyslhndwvdengni yfifsntelqqilncsepkviktkkeleqanklfqkkmgfdpkmkrnnpnrlylgdlnvsa tdvykreneasqstispatsgtknslarhkmpqslatsgtknslardkvpqslatsgtens lvyqykdletqardnketekfdfstdqyspeiirkqnqdlvrrakdylpesangglflnke gvellglwcrspkqmrrflgiilnakkaverehegtaivlddprcqeminktmrrffnvlr sdskkinnvenylfgamketlvaywnkslmtanggdpdef
30.实施例2:志贺氏菌多糖o型抗原基因制备
31.煮沸裂解法制备志贺氏菌福氏2a的基因组dna模板，挑取单菌落37℃过夜培养。取0.5 ml菌液12000r/min离心3min，弃上清，收集菌体用超纯水洗一次，并重悬。放于沸水中煮 10min，冷却过后12000r/min离心3min，以上清作为模板备用。以其基因组为模板，用lataq聚合酶进行扩增，通过两对引物2a-1f/2a-1r和2a-2f/2a-2r来扩增完整的o抗原基因簇，大小分别约为8000bp，并以载体psc101为模板扩增载体片段，大小约为6000bp，用浓度为0.8％的结晶紫琼脂糖凝胶回收片段，以防片段在紫外光下突变或者降解，回收后备用，结果如图1和图2所示。
32.名称序列2a-1f5’ccgccattctgaaatgggctatatgcaggcgtttgtgaa3’2a-1r5’aatgcatttcttactcgataataac32a-2f5’ctgtgggattaacataccaattcac3’2a-2r5’attgtctcatgagcggtataaccacgactttcgatgttg3’33.扩增体系：
[0034][0035][0036]
反应程序如下：95℃预变性3min；98℃解链10s，55℃退火30s，68℃延伸8min，总共30个循环，72℃保温10min，最终4℃保存。
[0037]
实施例3：psc101-repa-l99k-sco质粒构建
[0038]
用gibson组装试剂盒(neb)，通过在设计引物时在片段中加入overlap片段，从而片段能够通过重叠片段，通过gibson组装酶连接成一个完整的质粒。具体步骤如下：将片段按照相同摩尔数比控制总体积在10微升加好反应体系，体系如下所示：
[0039][0040]
加好体系后在50摄氏度作用1小时，取2微升用电转化的方法将连接物转化入top10 感受态细胞内，涂布于kan平板上，放置与37℃待菌落长出后挑菌用相应引物进行pcr鉴定，pcr鉴定为阳性的菌落再次进行对其表达o抗原的后续鉴定，结果如图3所示。
[0041]
对比例1：psc101-repa-l99-sco质粒构建
[0042]
方法参照实施例3，区别在于设计的引物是针对不同序列(即repa蛋白l99位突变)。
[0043]
实施例4：志贺氏菌o抗原表达鉴定
[0044]
过夜培养5ml pcr鉴定为阳性的包含有psc101-repa-l99k-sco质粒或psc101-repa
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l99-sco的大肠杆菌top10菌株，离心收集菌体，取200μl缓冲液a(组份为：0.5m tris-clph 6.8,10％glycerol,10％sds以及5％beta-mercaptoethanol)重悬菌体，样品充分混匀后在沸水中煮10分钟，待样品冷却后离心15分钟以除去未溶解的杂质，离心完成后，将上清按照1：10(10μl加至90μl)的比例加入缓冲液b(组份为：0.5m tris-cl ph 6.8,10％glycerol, 0.05％bromophenol blue)中，并加入1μl浓度为20mg/ml的蛋白酶k。充分混匀后将样品放置于37℃。一小时过后，将样品取15μl在15％浓度的sds-page胶进行电泳，待胶跑完后，将胶进行银氨染色，若表达志贺氏菌o抗原，则能够看到有条带，若不表达，则top10 的脂多糖结构表现为rough型。
[0045]
染色步骤简要如下：
[0046]
1)固定：将胶放入固定液中固定过夜，之后用超纯水漂洗三次，每次10min；
[0047]
2)敏化：向染色盘中加入敏化液，轻摇10min，之后用超纯水洗三次，每次10min；
[0048]
3)上银：向染色盘中加入银染液，轻摇10min，之后用超纯水洗三次，每次10min；
[0049]
4)显色：向染色盘中加入显色液，轻轻振荡，待显出条带后，立即换超纯水，将胶漂洗至不变色为止，进行照相保存分析。
[0050]
western blot鉴定：将处理好的脂多糖样品通过sds-page胶分离，待电泳完成后，将o 抗原条带通过转印仪转印至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上。待转膜完成，用含有5％脱脂牛奶的tris缓冲液封闭2小时，随即加入特异性针对志贺氏菌福氏2a o抗原的兔抗血清(1：100稀释)放置于室温孵育2小时。孵育完成后，用碱性磷酸酶标记的羊抗兔igg 二抗以1：10000倍稀释进行孵育，两小时后用tbs缓冲液洗三遍。免疫印记条带通过加入 bcip显色液进行显色。反应终止则通过将膜放入超纯水中清洗，则终止反应。结果如图4所示，psc101-repa-l99k-sco能够提高志贺氏菌多o抗原糖的表达。
[0051]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。