一种诱导脐带间充质干细胞分化心肌细胞的方法、培养基及其应用与流程

肌细胞对缺血缺氧环境的耐受能力，且其具有诱导细胞分化的作用，麦冬皂苷d可降低心 肌细胞内线粒体活性氧的含量，进而实现缓解内质网应激而对心肌细胞产生保护作用，麦冬 总皂苷能够提高心肌细胞的活力；在培养液中加入麦冬水煎液，可以诱导huc-mscs分化 成cm，提高诱导huc-mscs分化成心肌细胞的转化效果，并且麦冬是天然的中药，具有促 进胰岛细胞功能恢复、增加肝糖原以及降低血糖的作用，对人体的毒副作用较小，在包括了 麦冬提取物以及无血清培养基的麦冬心肌细胞分化培养液中诱导huc-mscs分化心肌细胞， 没有添加任何动物来源的组组分，化学成分限定，减少血清对细胞的毒性作用和血清源性污 染，且不会在培养液中引入异源抗原，将经过培养的huc-mscs移植入人体内的副作用较 小，可提高huc-mscs进行诱导分化成心肌细胞的培养在临床上的适用性。
11.第二方面，本技术提供的一种麦冬诱导脐带间充质干细胞分化心肌细胞的方法，采用 如下的技术方案：一种麦冬诱导脐带间充质干细胞分化心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：从新鲜的脐带中分离脐带间充质干细胞；s2：对脐带间充质干细胞进行消化传代培养；s3：使用上述任一所述的一种麦冬心肌细胞分化培养液对脐带间充质细胞进行诱导分化。
12.优选的，所述步骤s3中独立地选用p3、p4或p5代脐带间充质干细胞进行诱导分化。
13.优选的，所述步骤s3中选用p5代脐带间充质干细胞进行诱导分化。
14.优选的，所述步骤s3中在细胞融合率在80％-90％时加入麦冬分化培养液进行脐带间 充质干细胞的诱导分化。
15.通过采用上述技术方案，huc-mscs属非终末分化细胞，终生保持未分化或低分化特 征，其分化受到所处微环境的影响；huc-mscs在体外增殖过程中，随着培养代次的增加， 传代间隔逐渐延长，细胞增殖速度逐渐降低，细胞形态发生变化，且处于不同代次的huc
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mscs分化成心肌细胞的潜能不同，因此选择合适代次的huc-mscs进行分化诱导，对于 huc-mscs自体移植的细胞转化率以及效果都有着很大的影响；其中，p3、p4以及p5代的 huc-mscs较稳定，且具有较快的细胞增殖速度，使用上述代次的huc-mscs在麦冬心肌 细胞分化培养液中培养均可分化成心肌细胞，使用p5代的huc-mscs进行诱导分化，具有 较好的分化转化效果；并且细胞融合率在80％-90％的huc-mscs生长状态较好，具有较好 的分化效果。
16.优选的，所述步骤s2中使用tryple对脐带间充质干细胞进行消化传代。
17.通过采用上述技术方案，tryple是一种非动物源性重组酶，用于消化各种粘附状态 下的哺乳动物细胞，具有对细胞作用温和、在室温下保持稳定以及易于使用等优点，步骤 s2中以tryple代替胰蛋白酶进行huc-mscs的消化传代，减少胰蛋白酶提取物中存在的酶 对细胞可能造成的损害，且减少动物源性污染的风险。
18.第三方面，本技术提供的如上述任一所述的一种麦冬诱导脐带间充质干细胞分化心 肌细胞的方法在构建致心律失常性右心室心肌病疾病模型中的应用。
19.第四方面，本技术提供的如上述任一所述的一种麦冬诱导脐带间充质干细胞分化心 肌细胞的方法在缓解心脏病中的应用。
20.综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：
将huc-mscs移植入患有心肌缺血的人的体内后，huc-mscs迁移到受损的心肌组织处， 并分化生成新生的心肌细胞代替已坏死的细胞，促进微循环建立，增加血液灌注，进而实现 对坏死心肌组织的修复。
28.在本技术中提供了一种麦冬心肌细胞分化培养液，麦冬心肌细胞分化培养液包括浓 度为1-3％的麦冬提取物、青霉素和链霉素，且该麦冬心肌细胞分化培养液为无血清培养液。 在体外使用上述麦冬心肌细胞分化培养液对huc-mscs进行培养，接着将传代huc-mscs 移植入患有心肌缺血的人体内，进行huc-mscs自体移植，麦冬水煎液中的甾体皂苷类、 高异黄酮类以及多糖类等物质可以诱导huc-mscs分化成cm，提高了huc-mscs诱导分 化培养转化效果，并且麦冬是天然的中药，对人体的毒副作用较小，在添加了麦冬心肌细胞 分化培养液中进行huc-mscs培养，可减少不良反应的出现。
29.本技术提供的麦冬心肌细胞分化培养液为无血清培养液，且在该培养液中添加了青 霉素和链霉素，该培养液中不含有血清以及其他动物来源组分，化学成分限定，其能够稳定 扩增huc-mscs，且减少了血清所带来的血源性污染等问题，减少血清未知成分对细胞的损 伤；使得对huc-mscs进行诱导分化成心肌细胞的培养的重复性、准确性和稳定性。
30.在本技术中还提供了一种麦冬诱导脐带间充质干细胞分化心肌细胞的方法，在该方 法中使用上述的麦冬心肌细胞分化培养液对p3、p4或p5代的huc-mscs进行诱导分化的 培养，且使用p5代进行诱导分化的效果最佳，具体的操作步骤如下所示：s1：从新鲜的脐带中分离脐带间充质干细胞；s2：对脐带间充质干细胞进行消化传代培养；s3：使用麦冬心肌细胞分化培养液对脐带间充质细胞进行诱导分化。
31.使用上述方法对huc-mscs进行培养，可诱导其分化成cm细胞，提高对huc
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mscs进行诱导分化成心肌细胞的培养过程中的细胞转化率，且具有较少的不良反应，使得 经过该方法培养得到的细胞移植入人体的安全性更高。
32.实施例1：诱导脐带间充质干细胞分化心肌细胞的条件一、心肌细胞分化培养液在本实施例中，发明人使配制含有不同浓度的麦冬提取物的麦冬心肌细胞分化培养液对 huc-mscs进行诱导分化，并使用显微镜对诱导分化后的细胞进行观察，得到的具体结果如 表1所示：表1.心肌细胞跳动情况 麦冬提取物浓度(％)心肌细胞状态0.5无细胞跳动1.0细胞跳动1.5细胞跳动2.0细胞跳动2.5细胞跳动3细胞跳动3.5无细胞跳动4.0无细胞跳动5.0无细胞跳动
7.5无细胞跳动10.0无细胞跳动从表1中我们可以看出，当麦冬心肌细胞分化培养液中麦冬提取物的浓度在1-3％的范围时， 使用该分化培养液可成功诱导出心肌细胞；并且，在后续的实验中发现，当麦冬提取物的浓 度在2.0-2.5％时，诱导培养的效果最好。
33.二、细胞代数体外持续细胞传代对huc-mscs分化成心肌细胞具有一定影响，发明人经过大量的试验， 对不同代次的huc-mscs进行诱导分化培养；发现传代早期的huc-mscs向其他方向分化 的趋势更大，而传代晚期的huc-mscs细胞活力差，容易衰老甚至死亡。
34.在本实施例中采用贴壁法对从新鲜脐带中分离得到的huc-mscs进行消化传代，然 后取p1-p10代的huc-mscs进行诱导培养，并使用显微镜对诱导分化后的细胞进行观察， 得到的具体结果如表2所示：表2.心肌细胞跳动情况 代次心肌细胞状态1细胞无跳动2细胞无跳动3细胞有跳动4细胞有跳动5细胞有跳动6细胞无跳动7细胞无跳动8细胞无跳动9细胞无跳动10细胞无跳动从表2中可以得出，只有p3、p4以及p5代的huc-mscs在上述的麦冬心肌细胞分化培养 液中成功诱导分化成心肌细胞；通过免疫荧光法检测诱导p3、p4、以及p5代的huc-mscs 分化得到的心肌细胞中ctni和cx43蛋白表达，并且通过rt-qpcr法检测心肌细胞中nkx 2.5、gata4和β-mhc mrna的表达情况。
35.1、免疫荧光检测ctni和cx43蛋白表达ctni属于心肌肌钙蛋白一部分，起到调节肌肉收缩的作用，而cx43是心肌细胞缝隙连接 的主要表达蛋白；ctni和cx43均具有心肌特异性，是心肌细胞特异性的表面标记物，通 过对经过麦冬心肌细胞分化培养液体外培养的细胞进行ctni和cx4的检测，可实现对 huc-mscs诱导分化结果的判断。
36.使用上述所述的麦冬诱导脐带间充质干细胞分化心肌细胞的方法对huc-mscs进行 培养，对诱导分化得到的细胞进行检测，具体的操作步骤如下所示：(1)预处理：将细胞用4％多聚甲醛固定，0.1％tritonx-100通透，pbs清洗3次；(2)灭活酶：每张切片滴加2滴3％h2o2－甲醇溶液，室温(15-25℃)封闭10min，pbs 浸洗3次；(3)封闭：滴加即用型山羊血清50～100μl，室温孵育20min；
(4)抗原-抗体反应：滴加一抗ctni和cx43(1∶50稀释)50-100μl，37℃，湿盒孵育2 h，pbs浸洗3次；(5)一抗、二抗反应：滴加kflour647/tritc(1：100稀释)二抗50-100μl，37℃，避光 孵育1h；(6)pbs浸洗3次；(7)复染:每张片子滴加配制dapi染液50-100μl，室温避光放置5min；(8)封片:用防萃灭封片胶封片；(9)观察:高倍镜下观察细胞中蛋白的表达情况，取3个高表达区域拍照保存。
37.免疫荧光法检测结果如图1和图2所示。图1为免疫荧光法检测ctni蛋白表达的实 验结果，蓝色为dapi显示细胞核信号，绿色为ctni蛋白信号；p4代和p5代的huc
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mscs均检测到绿色荧光信号，而p3代细胞中并未检测到绿色荧光信号，使用p3代huc
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mscs诱导分化得到的细胞并未表达ctni蛋白，而使用p4代和p5代huc-mscs诱导分化 得到的细胞表达了ctni蛋白，且p5代细胞荧光信号最强，其ctni蛋白表达量较高；图2 为免疫荧光法检测cx43蛋白表达的实验结果，蓝色为dapi显示细胞核信号，绿色为 cx43蛋白信号；p3、p4和p5代huc-mscs均检测到绿色荧光信号，说明使用p3、p4和 p5代huc-mscs诱导分化得到的细胞表达了cx43蛋白，且p5代细胞荧光信号最强，其 cx43蛋白表达量较高。
38.从图1和图2中可以看出，使用p5代huc-mscs进行诱导分化得到的心肌细胞中的 ctni和cx43表达量最高，具有较佳的诱导效果。
39.2、rt-qpcr法检测nkx2.5、gata-4、β-mhc mrna表达nkx2.5是心脏转录因子，在心脏形态发生、向右环化、房室特化和分割、功能上的成熟以 及工作心肌细胞核传导系统的维持中起重要作用，是心脏发育的早期标记物；gata-4的表 达产物可促进肝细胞向心肌样细胞分化；而在成熟的心肌细胞中mhc基因的表达以β
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mhc为主，因此通过对nkx2.5、gata-4以及β-mhc mrna相对表达量的检测，可实现 对诱导huc-mscs分化心肌细胞的观察。
40.在本实施例中，通过rt-qpcr法检测nkx2.5、gata-4、β-mhc mrna的表达， 具体操作步骤如下所示：(1)trizol法提取组织总rnaⅰ、细胞裂解：收集约1
×
105个细胞，再加预冷的1ml trizol，用组织匀浆器将样本置于冰 盒上进行匀浆，充分研磨，室温放置15min，使其充分裂解；ⅱ、分相：首先加入0.2ml的氯仿，剧烈振荡15s，15-30℃静置5min，接着在4℃、12000
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g下离心15min；ⅲ、沉淀：首先用200μl的枪取无色相至一新的ep管中，接着加入等体积异丙醇颠倒混 匀，在15-30℃下静置10min，最后在4℃、12000
×
g下离心10min，最后倾去上清得到沉 淀；ⅳ、清洗：首先用200μl的枪吸除多余上清，加1ml冰预冷的75％乙醇，旋涡震荡，接 着在4℃、7500
×
g下离心5min，弃洗液，最后在4℃、7500
×
g下离心30s，弃上清；
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、干燥：将离心管转到超净工作台，打开离心管盖子，让残余的液体蒸发；ⅵ、溶解：加约40μl的depc
·
h2o，使沉淀完全溶解，然后置于55-60℃水浴中彻底溶 解10min，接着迅速冰浴5min，稍离心，置于-80℃下保存。
41.(2)rna纯度的测定和rna的定量以相应溶剂为空白对照，取1μl rna溶液检测od260/280、od260/230以及连续波长吸收 峰，计算rna溶液浓度，od260/280应大于1.8且小于2.0，以满足后续rt-qpcr的要求。
42.(3)逆转录实验ⅰ、反应体系配制：在ep管中加入5
×
primescript rt master mix6μl、总rna 10μl， 使用rnase free dh2o补足至30μl；ⅱ、逆转录：在37℃进行逆转录反应15min，并且升温至85℃保持5s使反转录酶失活，逆 转录产物置于4℃下保存。
43.(4)荧光定量pcr扩增实验根据nkx2.5、gata-4以及β-mhc的核苷酸序列，特异性设计得到了3对引物组，对逆转 录得到的rna片段进行荧光定量pcr且在荧光定量pcr扩增中引入一对内标引物，校正 上样过程中存在的误差，保证检测体系的有效性，上述引物组和内标引物的核苷酸序列如表 3所示：表3.引物组和内标引物的核苷酸序列得到的实验结果如图3所示，从图3中可以看出，使用p3、p4和p5代huc-mscs诱导分 化得到的细胞均能表达nkx2.5、gata-4、β-mhc mrna，且使用p5代huc-mscs诱导 分化得到的细胞的表达量最多。
44.综合免疫荧光检测以及rt-qpcr法检测结果分析，对p3、p4和p5代细胞诱导分化， 均能得到心肌样细胞，并且使用p5代huc-mscs诱导分化的细胞转化率最佳。
45.实施例2：麦冬诱导脐带间充质干细胞分化心肌细胞的方法1、从新鲜的脐带中分离脐带间充质干细胞在对huc-mscs进行诱导分化培养之前，首先需要从脐带中分离得到原代细胞，并且对原 代细胞进行传代培养，提高稳定性较高的huc-mscs，具体操作步骤如下所示：(1)无菌取剖宫产新鲜脐带约10cm，生理盐水洗去脐带残留血液，剪成2～3cm的小段， 再次漂洗，纵行剖开脐带，剔除1条脐静脉、两条脐动脉，剥离华通胶。
46.2、对脐带间充质干细胞进行消化传代培养
(1)用眼科剪将华通胶剪碎成1mm2的小组织块，转移至细胞培养瓶中，加入含有青霉素 和链霉素的无血清培养液，于5％co2、37℃的培养箱中静置培养；(2)倒置显微镜每天观察细胞生长情况；(3)1周后首次换液，此后3～4d换液1次；(4)待细胞长至80％～90％融合时用tryple消化传代。
47.3、脐带间充质干细胞的鉴定细胞的特定功能与其表面标志物相关，细胞标志物可以体现细胞的一些基本特征，huc
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mscs属于混杂细胞群，表面抗原具有非专一性，其表达间质细胞、内皮细胞以及表皮细胞 的表面标志物。
48.目前，huc-mscs表面比较肯定存在的标记物有cd73、cd90以及cd105等，表面 呈阴性的为cd19、cd34、cd45、cd14以及hla-dr等；通过流式细胞仪检测细胞表面 标志物，并且设置多组实验组，同时检测多种细胞表面标志物，对huc-mscs传代培养后 的细胞状态进行表征，具体信息如表4所示：表4.流式细胞仪检测细胞表面标志物得到的检测结果如图4所示，经过传代培养的细胞的cd73、cd90和cd105呈阳性，cd14、 cd19、cd34和cd45呈阴性，检测结果显示经过传代培养的huc-mscs高表达间充质干细 胞抗原cd105、cd90、cd73，而不表达造血干细胞抗原cd19、cd34、cd45以及cd14 和白细胞相关抗原hla-dr，并且每种细胞类型的阳性细胞率均高达90％或更高，显示出与 huc-mscs相似的表面抗原表达模式，说明经过传代培养的huc-mscs保持稳定。
49.4、诱导脐带间充质细胞分化心肌细胞huc-mscs是一种能够从脐带中分离出来的多能干细胞，具有多向分化潜力和高度自我更新 能力，在一定条件下可以诱导分化为多种功能性细胞。在本实施例中，使用含有麦冬心肌细 胞分化培养液对huc-mscs进行诱导分化成心肌细胞，具体操作步骤如下所示：(1)将准备好的麦冬经过提取和浓缩制成麦冬水煎液；(2)取无血清培养基和麦冬水煎液配制成麦冬提取物浓度为2％的麦冬心肌细胞分化培养液；(3)取p5代huc-mscs消化制备细胞悬液，计数后，均匀的接种到96孔板内，置于37℃、 5％co2培养箱中培养一定时间；(4)观察细胞生长状态，细胞融合率达80％-90％时吸弃原有培养基，然后使用麦冬心肌细 胞分化培养液进行培养。
50.4.诱导脐带间充质细胞分化心肌细胞结果观察
(1)免疫荧光检测ctni和cx43蛋白表达对经过麦冬心肌细胞分化培养液培养的huc-mscs进行ctni和cx43蛋白表达的检测，同 时设置空白对照组，在空白对照组中使用无血清培养液进行huc-mscs的诱导分化。
51.检测结果如图5和图6所示。在图5中，蓝色为dapi显示细胞核信号，绿色为 ctni蛋白信号，使用心肌细胞分化培养液的huc-mscs发出绿色荧光，其表达ctni蛋白， 且随着时间的增加ctni蛋白的表达量增加，而空白对照组中细胞不表达ctni蛋白；图6中， 蓝色为dapi显示细胞核信号，绿色为cx43蛋白信号，使用麦冬心肌细胞分化培养液的 huc-mscs和空白对照组均发出绿色荧光，说明细胞表达了cx43蛋白，但实验组中绿色荧 光信号较强，使用麦冬心肌细胞分化培养液的huc-mscs中cx43蛋白表达量较高。
52.与空白对照组相比，使用麦冬心肌细胞分化培养液诱导分化huc-mscs得到的细胞 中ctni和cx43的表达量明显增加，且培养时间依赖性；说明麦冬心肌细胞分化培养液具 有促进huc-mscs分化成心肌细胞的作用，使用该麦冬心肌细胞分化培养液进行诱导分化， 可提高对huc-mscs进行诱导分化成心肌细胞的转化效果。
53.(2)rt-qpcr法检测nkx2.5、gata-4、β-mhc mrna表达 对经过麦冬心肌细胞分化培养液培养的huc-mscs进行nkx2.5、gata-4、β-mhc mrna 表达的检测，检测结果如表5所示：表5.nkx 2.5，gata4和gata4 mrna表达情况从表5中可以得出，与空白对照组相比，使用麦冬心肌细胞分化培养液诱导分化huc-mscs 得到的细胞中nkx 2.5、gata4和β-mhc mrna的表达量明显增加，且培养时间依赖性； 说明麦冬心肌细胞分化培养液具有促进huc-mscs分化成心肌细胞的作用，使用该麦冬心 肌细胞分化培养液进行诱导分化，可提高对huc-mscs进行诱导分化成心肌细胞的转化效 果。
54.实施例3：构建致心律失常性右室心肌病疾病模型致心律失常性右室心肌病疾病(arvc)，由又称致心律失常性右室发育不良，以右心室心 肌被进行性纤维脂肪组织所替代为特征，在临床上常表现为右心室扩大、心律失常以及猝死。
55.arvc是一类器质性心肌病，具有家族遗传性，一般为常染色体显性遗传，少数为隐 形遗传，存在复合或双基因杂合性突变。在对arvc分子遗传机制的研究中发现有13个基 因与arvc有关，而大部分基因为桥粒蛋白相关编码基因，包括血小板亲和蛋白pkp基因、 桥粒斑蛋白dsp基因、斑珠蛋白jup基因、桥粒钙黏素蛋白dsc基因以及桥粒芯糖蛋白基 因等，其中，精确化实验模型的建立有助于探究arvc致病机理，且利于阐明基因与疾病 表型之间的关系，使得可根据患者的临床表现及测序结果等进行针对性研究，进而寻找靶向 治疗的方法。
56.精确化实验模型包括转基因动物模型以及ipsc细胞模型。其中，转基因动物模型虽 然是一种有效的具有重复性的体内实验工具，有利于研究这对疾病进行全面认知，但是存在 着目的基因全身性敲除困难以及实验动物与人类相比组织结构存在差异等问题，使得该研究 性具有较大的不确定性。
57.ipsc细胞模型通过干细胞建立不同突变类型的细胞模型，一般可分为3种类型：一 类是对arvc患者的体细胞重编码获得的干细胞进行心肌细胞分化；一类是利用基因编辑 技术进行基因编辑，矫正突变后将其作为对照组进行细胞分化；还有一类是对来源于正常人 的干细胞进行基因编辑，敲入突变基因后，使其定向分化为心肌细胞。在本实施例中，通过 对huc-mscs进行基因编辑，敲入突变基因后，再使用麦冬心肌细胞分化培养液对huc
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mscs进行培养，使其定向分化为心肌细胞。
58.实施例4：中药麦冬诱导分化的msc来源的心肌细胞用于缓解心脏病 huc-mscs是迄今为止在临床上研究最广泛的干细胞，并用作实验性细胞治疗模块，尤其是 在心脏再生和修复中；在最近的研究中发现，huc-mscs经过诱导可分化成心肌样细胞，且 心肌样细胞处于不成熟的阶段，仍具有增殖能力，可继续增殖形成足够数量的心肌细胞。在 本实施例中，使用麦冬心肌细胞分化培养液对huc-mscs进行培养，将分化后的心肌细胞 输送到受损的心脏中，可以缓解因心肌供血减少或中断导致的急性心肌梗死，实现有效挽救 急性心梗患者生命的效果。
59.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员 在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术 的权利要求范围内都受到专利法的保护。