用于使神经元细胞兴奋性正常化和治疗德拉韦综合征的中间神经元特异性治疗剂的制作方法

用于使神经元细胞兴奋性正常化和治疗德拉韦综合征的中间神经元特异性治疗剂
1.相关申请的交叉引用
2.本技术为pct国际申请，主张2019年2月5日提交的美国临时专利申请号us 62/801,483、2019年3月25日提交的美国临时专利申请号us 62/823,281和2019年10月17日提交的美国临时专利申请号us62/916,477的优先权和权益。这些临时专利申请的整体内容通过引用并入本文。
3.联邦赞助研究声明
4.本发明在美国国家卫生研究院拨款(拨款号：mh111529)的支持下完成。政府享有本发明的某些权利。


背景技术：

5.兴奋与抑制之间存在微妙的平衡。为确保大脑回路的正常运作和在这些回路内运作的神经元细胞的活动，必须小心地维持该平衡。已显示大脑回路系统内兴奋与抑制平衡的改变、缺陷或破坏会导致众多神经系统、神经遗传或神经退行性疾病和病症。此外，缺乏适当的皮层中间神经元功能与神经发育及神经系统疾病和病症相关。
6.中间神经元功能和活动的异常或畸变可能是偏离中间神经元发育过程(例如，基因突变导致胚胎发育过程中细胞命运特化畸变)或急性损伤(例如，中风、脑震荡)的结果。gaba能神经传递异常和抑制性皮层回路的改变可能会引起和诱发临床特征和症状，例如癫痫发作(seizure)和癫痫(epilepsy)，令患有诸如德拉韦综合征(dravet syndrome,ds)和与认知障碍及早产死亡相关的耐药性小儿癫痫等严重神经系统疾病和病症的患者备受折磨。
7.由于缺乏能够调节gaba能中间神经元或其他皮层神经元活动且具备特异性与敏感性的治疗组合物和方法，医疗界缓解各类型癫痫病例中癫痫发作的能力受到严重阻碍，尤其是局灶性癫痫发作和ds。因此，急需此类组合物和方法来对抗和治疗这些破坏性极强的病症的严重症状以及其他神经精神性疾病。本文中记载的产品、组合物和方法旨在解决和满足这些需求。


技术实现要素：

8.本文特征为病毒性载体，尤其是重组腺相关病毒(raav)载体、病毒颗粒，以及其组合物和方法。raav载体包括(经分子工程改造以包括)至少一种转基因(例如，效应基因诸如经hm3dq改性的毒蕈碱受体(gq-dreadd)等、药理学选择性制动器分子(psam)或治疗性基因如scn1a等)，以及特异性调控多核苷酸序列，其将前述转基因的表达限制到中间神经元(in)细胞，尤其是表达小清蛋白的快速尖峰形成(fast-spiking)gaba能中间神经元(本文简称“pv中间神经元”(pv in))，或大脑皮层神经元细胞。在一个实施方案中，特异性调控多核苷酸序列衍生自基因scn1a附近的增强子序列，并将raav携带的转基因的表达限制到大脑中表达小清蛋白的快速尖峰形成gaba能中间神经元群中。在一个实施方案中，治疗性基
因为scn1a。在一个特定的实施方案中，载体特异性地转导scn1a基因表达不充分或有缺陷的中间神经元细胞，该scn1a基因编码中间神经元细胞尤其是皮层中间神经元细胞内的氯化钠通道nav1.1；而且，载体使scn1a缺乏或有缺陷的中间神经元的兴奋性正常化，从而缓解患有德拉韦综合征的受试者的癫痫发作和发作症状。
9.在本发明的一个方面，合适的病毒性载体，例如慢病毒载体或者尤其是raav载体，用于限制转基因在哺乳动物的表达pv的gaba能中间神经元、或锥体(pyr)神经元、或表达血管活性肠肽(vip)的皮层中间神经元内的表达，并且包括本文所述的增强子元件多核苷酸(本文中又称“调控元件”)。在一个实施方案中，该增强子元件以顺式提供。在一个实施方案中，该调控元件为本文所述的s5e1、s5e2、s5e3、s5e4、s5e5、s5e6、s5e7、s5e8、s5e9或s5e10，尤其是人类e1至e10。在一个实施方案中，该增强子元件为本文所述的e11至e35。在一个实施方案中，该增强子元件为s5e1(e1)。在一个实施方案中，该增强子元件为s5e2(e2)。在一个实施方案中，该增强子元件为s5e3(e3)。在一个实施方案中，该增强子元件为s5e4(e4)。在一个实施方案中，该增强子元件为e5。在一个实施方案中，该增强子元件为e6。在一个实施方案中，该增强子元件为e11。在一个实施方案中，该增强子元件为e14。在一个实施方案中，该增强子元件为e22。在一个实施方案中，该增强子元件为e29。
10.在一方面，包括增强子的该病毒性载体或raav载体促进scn1副本在表达pv的转导中间神经元细胞内的表达，从而处置和治疗ds。在其他实施方案中，包括增强子的该载体或raav载体促进效应基因的表达，诸如gq-dreadd受体，或例如药理学选择性制动器分子(psam)、正交配体门控离子通道(以及其药理学选择性效应子分子(psem))，用于pv-中间神经元活性的化学遗传调节，从而治疗所有类型的癫痫，包括局灶性和药理学顽固性癫痫，以及ds。
11.在一方面，提供了病毒性载体，其包括转基因多核苷酸序列和将该转基因的表达特异性地限制到表达小清蛋白(pv)的脑部中间神经元细胞的增强子多核苷酸序列。
12.在一方面，提供了病毒性载体，其包括与scn1a基因表达特异性地相关的增强子多核苷酸序列以及转基因多核苷酸序列，其中该增强子序列将转基因的表达限制到表达pv的脑部中间神经元细胞。
13.在一方面，合适的病毒性载体，例如慢病毒载体或者尤其是重组腺相关病毒性载体，用于将转基因的表达限制到哺乳动物脑部的表达血管活性肠肽的gabna能皮层中间神经元细胞(vip cin)。在这些皮层中间神经元细胞内以顺式提供如本文描述的增强子元件。在一个实施方案中，该增强子元件为本文所述的s5e6。
14.在一方面，合适的病毒性载体，例如慢病毒载体或者尤其是重组腺相关病毒性载体，用于将转基因的表达限制到哺乳动物脑部的gaba能中间神经元和谷氨酰胺能锥体神经元。这些神经元内以顺式提供如本文所述的增强子元件。在一个实施方案中，前述锥体神经元位于哺乳动物脑部的第5皮层。在一个实施方案中，将转基因表达限制到锥体神经元的前述增强子元件为本文中记载的s5e5。
15.在上述方面的病毒性载体的实施方案中，该转基因为报告基因、编码只能由人工设计的药物激活的人工设计受体(dreadd)的基因、编码药理学选择性制动器分子(psam)的基因，或治疗性基因如scn1a。在一个实施方案中，该转基因为scn1a基因。在一个实施方案中，该转基因为dreadd编码的多核苷酸。在一个实施方案中，该编码dreadd的多核苷酸为编
码gq-dreadd的基因，其由趋化原氯氮平-n4-氧化物(cno)激活。在一个实施方案中，该转基因为编码药理学选择性制动器分子(psam)的基因。在一个实施方案中，被表达的psam特异性地与psem配体相互作用。在一个实施方案中，病毒性载体为重组腺相关病毒(raav)载体。
16.在另一个方面，提供了一种重组腺相关病毒(raav)载体，该raav载体包括scn1a转基因多核苷酸序列或其功能部分，以及将scn1a转基因的表达特异性地限制到脑部中间神经元细胞的增强子多核苷酸序列。
17.在上述方面的病毒性载体或raav载体的实施方案中，由该scn1a转基因编码的nav1.1钠通道在病毒性载体或raav载体转导中间神经元细胞或神经元细胞后，功能性地表达在该中间神经元细胞或神经元细胞内。在上述方面的病毒性载体或raav载体的实施方案中，由该scn1a转基因编码的nav1.1钠通道在病毒性载体或raav载体转导中间神经元或神经元细胞后，功能性地表达在gaba能中间神经元和谷氨酰胺能锥体神经元内。在一个实施方案中，该些中间神经元细胞为gaba能中间神经元细胞。在一个实施方案中，该些中间神经元细胞为位于大脑端脑内的gaba能中间神经元细胞。在一个实施方案中，该些gaba能中间神经元细胞表达小清蛋白(pv)。在一个实施方案中，该些神经元细胞为锥体神经元细胞，例如位于大脑皮层的谷氨酰胺能锥体细胞。在上述任一方面的实施方案中，增强子多核苷酸序列包括小鼠增强子元件e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、e8、e9或e10的多核苷酸序列(分别为seq id no:5-14)，或其直系同源物，如人类直系同源物。在一个实施方案中，增强子多核苷酸序列包括人类增强子元件e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、e8、e9或e10的多核苷酸序列(分别为seq id no:15-24)。在一个实施方案中，病毒性载体或raav载体包括增强子多核苷酸序列，该增强子多核苷酸序列包括核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个或多个长度约为100bp或以上的区域，其与人类增强子元件e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、e8、e9或e10的多核苷酸序列(分别为seq id no:15-24)具有至少75％或以上的序列同一性。在另一个实施方案中，病毒性载体或raav载体包括增强子多核苷酸序列，该增强子多核苷酸序列包括核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个或多个长度约为100bp或以上的区域，其与人类增强子元件e2的多核苷酸序列(seq id no:16)具有至少75％或以上的序列同一性。在另一个实施方案中，病毒性载体或raav载体包括增强子多核苷酸序列，该增强子多核苷酸序列包括核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个或多个长度约为100bp或以上的区域，其与人类增强子元件e5的多核苷酸序列(seq id no:19)具有至少75％或以上的序列同一性。在另一个实施方案中，病毒性载体或raav载体包括增强子多核苷酸序列，该增强子多核苷酸序列包括核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个或多个长度约为100bp或以上的区域，其与人类增强子元件e6的多核苷酸序列(seq id no:20)具有至少75％或以上的序列同一性。在上述方面的一个实施方案中，病毒性载体或raav载体包括增强子多核苷酸序列，该增强子多核苷酸序列包括人类增强子元件e2的多核苷酸序列(seq id no:16)。在上述方面的其他实施方案中，病毒性载体或raav载体包括增强子多核苷酸序列，该增强子多核苷酸序列包括人类增强子元件e5的多核苷酸序列(seq id no:19)或人类增强子元件e6的多核苷酸序列(seq id no:20)。在上述方面的其他实施方案中，病毒性载体或raav载体包括任意一个(或一个或多个)包括人类增强子元件e11至e35的多核苷酸序列(分别为seq id no:25-49)的增强子多核苷酸序列。在一个实施方案中，载体封装长度超过约4.7kb的多核苷酸序列的容量包括通过同源重组或通过受体位点介导的剪接重排多个raav载体。在一个实施方案中，载体将scn1a基因递送至脑部表
no:25-49)具有至少75％或以上序列同一性的增强子多核苷酸序列。在一个实施方案中，该增强子多核苷酸序列为人类e5增强子多核苷酸序列。在一个实施方案中，该增强子多核苷酸序列为人类e6增强子多核苷酸序列。在一个特定的实施方案中，该增强子多核苷酸序列包含一个或多个长度约为100bp或以上的区域，其与人类增强子元件e2(seq id no:16)的多核苷酸序列具有至少75％或以上的序列同一性。在其他实施方案中，该增强子多核苷酸序列包含一个或多个长度约为100bp或以上的区域，其与人类增强子元件e5的多核苷酸序列(seq id no:19)或人类增强子元件e6的多核苷酸序列(seq id no:20)具有至少75％或以上的序列同一性。
27.在一方面，提供了一种递送转基因以抑制或预防有需要的受试者的癫痫发作和/或癫痫的方法，该转基因用于在表达scn1a基因的中间神经元细胞或神经元细胞内进行受限制的表达。该方法包括使细胞接触重组腺相关病毒(raav)载体，所述rvva载体包含scn1a转基因多核苷酸序列或其功能部分以及将scn1a转基因表达特异性地限制到受试者大脑皮层中间神经元或神经元细胞的增强子多核苷酸序列，从而抑制或预防患者的癫痫发作和/或癫痫。
28.在上述任一方面的方法的一个实施方案中，raav载体、病毒颗粒、病毒样颗粒或药物组合物为全身性地施用。在上述任一方面的方法的一个实施方案中，raav载体、病毒颗粒、病毒样颗粒或药物组合物为肠胃外或静脉施用。在上述任一方面的方法的一个实施方案中，raav载体、病毒颗粒或药物组合物为脑内施用。在上述任一方面的方法的一个实施方案中，raav载体、病毒颗粒或药物组合物被当做预防剂施用。在上述任一方面的方法的一个实施方案中，该方法进一步包括向婴幼儿或受试者施用辅助抗癫痫治疗。
29.在另一方面，提供了一种病毒性载体，该病毒性载体包括转基因多核苷酸序列和增强子多核苷酸序列，该增强子多核苷酸序列将该转基因的表达特异性地限制到脑部表达血管活性肠肽的皮层中间神经元细胞(vip cin)。在另一方面，提供了一种病毒性载体，该载体包括与scn1a基因表达特异性地相关的增强子多核苷酸序列以及转基因多核苷酸序列，其中该增强子序列将该转基因的表达限制到脑部表达血管活性肠肽的皮层中间神经元细胞(vip cin)。在一个实施方案中，增强子多核苷酸序列包括核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个或多个长度约为100bp或以上的区域，其与人类增强子元件e6的多核苷酸序列(seq id no:20)具有至少75％或以上的序列同一性。在一个特定的实施方案中，增强子多核苷酸序列为人类增强子元件e6(seq id no:20)。在一个实施方案中，病毒性载体为重组腺相关病毒(raav)载体。在一个实施方案中，转基因为scn1a基因。
30.在另一方面，提供了一种病毒性载体，该病毒性载体包括转基因多核苷酸序列和增强子多核苷酸序列，该增强子多核苷酸序列将该转基因的表达特异性地限制到脑部的锥体神经元。在另一方面，提供了一种病毒性载体，该载体包括与scn1a基因表达特异性地相关的增强子多核苷酸序列以及转基因多核苷酸序列，其中该增强子序列将该转基因的表达限制到脑部锥体神经元。在一个实施方案中，增强子多核苷酸序列包括核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个或多个长度约为100bp或以上的区域，其与人类增强子元件e5的多核苷酸序列(seq id no:19)具有至少75％或以上的序列同一性。在一个特定的实施方案中，增强子多核苷酸序列为人类增强子元件e5(seq id no:19)。在另一个特定的实施方案中，增强子序列将该转基因的表达限制到脑部第五皮层的锥体神经元。在一个实施方案中，病毒性
载体为重组腺相关病毒(raav)载体。在一个实施方案中，转基因为scn1a基因。
31.在一方面，提供了一种病毒性载体，该病毒性载体包括选自seq id no:15-24的增强子多核苷酸序列或其功能部分，其中，该载体特异性地靶向表达scn1a的神经元细胞。在一个实施方案中，这些神经元细胞为小清蛋白皮层中间神经元(pv cin)、锥体(pyr)神经元，或血管活性肠肽皮层中间神经元(vip cin)。
32.在一方面，提供了一种病毒性载体，该病毒性载体包括选自seq id no:25-27的增强子多核苷酸序列或其功能部分，其中，该载体特异性地靶向表达pvalb的细胞。
33.在一方面，提供了一种病毒性载体，该病毒性载体包括选自seq id no:28-31的增强子多核苷酸序列或其功能部分，其中，该载体特异性地靶向表达acan的细胞。
34.在一方面，提供了一种病毒性载体，该病毒性载体包括选自seq id no:32-39的增强子多核苷酸序列或其功能部分，其中，该载体特异性地靶向表达tmem132c的细胞。
35.在一方面，提供了一种病毒性载体，该病毒性载体包括选自seq id no:40或seq id no:41的增强子多核苷酸序列或其功能部分，其中，该载体特异性地靶向表达lrrc38的细胞。
36.在一方面，提供了一种病毒性载体，该病毒性载体包括选自seq id no:42或seq id no:43的增强子多核苷酸序列或其功能部分，其中，该载体特异性地靶向表达inpp5j的细胞。
37.在一方面，提供了一种病毒性载体，该病毒性载体包括选自seq id no:44-47的增强子多核苷酸序列或其功能部分，其中，该载体特异性地靶向表达mef2c的细胞。
38.在一方面，提供了一种病毒性载体，该病毒性载体包括选自seq id no:48或seq id no:49的增强子多核苷酸序列或其功能部分，其中，该载体特异性地靶向表达pthlh的细胞。
39.在一方面，提供了一种病毒性载体，该病毒性载体包括选自seq id no:15-49的增强子多核苷酸序列或其功能部分，其中，该载体特异性地靶向表达小清蛋白的细胞。
40.在上述任一方面的病毒性载体的一个实施方案中，靶细胞为表达小清蛋白的神经元细胞。在上述任一方面的病毒性载体的一个实施方案中，该病毒性载体为慢病毒载体或重组腺相关病毒(raav)载体。
41.在一方面，提供了一种细胞，其包括上述任一方面和实施方案的病毒性载体。
42.在一方面，提供了一种病毒颗粒或病毒样颗粒，该病毒颗粒或病毒样颗粒包括上述任一方面和实施方案的病毒性载体。在一方面，提供了包括病毒颗粒或病毒样颗粒的细胞，该病毒颗粒或病毒样颗粒包括上述任一方面和实施方案的病毒性载体。
43.在一方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包括上述任一方面和实施方案的病毒性载体或病毒颗粒或病毒样颗粒，以及药学可接受的赋形物、载体或稀释剂。
44.在另一方面，提供了一种将转基因的表达限制到受试者的神经元细胞的方法，其中，该方法包括给受试者施用包括至少一个增强子元件多核苷酸和一个转基因多核苷酸的递送载体，其中该增强子元件多核苷酸包括seq id no:15-49的一个序列，该转基因特异性地表达在神经元细胞内。在该方法的一个实施方案中，该转基因为scn1a。在一个实施方案中，该神经元细胞为表达小清蛋白的皮层中间神经元(pv cin)。在一个实施方案中，该增强子元件多核苷酸包括seq id no:15-18或seq id no:21-24所示的一个序列。
45.在上述方法的另一个实施方案中，该神经元细胞为锥体(pyr)细胞。在一个实施方案中，该增强子元件多核苷酸包括seq id no:19所示的序列。
46.在上述方法的另一个实施方案中，该神经元细胞为表达血管活性肠肽的皮层中间神经元(vip cin)。在一个实施方案中，该增强子元件多核苷酸包括seq id no:20所示的序列。
47.在上述方法及其实施方案的一个实施方案中，该递送载体为慢病毒载体或raav。在该方法的一个实施方案中，该递送载体施用于脑部。在该方法的一个实施方案中，该递送载体为局部或全身性地施用。在一个实施方案中，该受试者为哺乳动物。在一个实施方案中，该受试者为人类。
48.在另一方面，提供了一种包括选自seq id no:15-49的人类增强子多核苷酸序列的病毒性载体。在一个实施方案中，该病毒性载体为重组腺相关病毒(raav)载体。在一些实施方案中，病毒颗粒或病毒样颗粒包括上述病毒性载体。在另一个实施方案中，细胞包括上述病毒性载体。在一个实施方案中，细胞包括上述病毒颗粒或病毒样颗粒。在一个实施方案中，药物组合物包括上述病毒性载体，或上述病毒颗粒或病毒样颗粒，以及药学可接受的赋形物、载体或稀释剂。
49.定义
50.除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语均具有文中记载的各方面及实施方案所属领域内技术人员常规理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了所述实施方案中使用的众多术语的一般定义：《微生物与分子生物学词典》((辛格尔顿等编撰，第二版，1994))；《剑桥科学与技术词典》(沃克主编，1988)；《遗传学术语汇编》((里格尔等主编，第五版，施普林格出版社，1991))；以及《柯林斯生物学词典》(哈勒与玛格姆编撰，1991)。除非另有说明，否则本文使用的下列术语具有以下含义。
[0051]“施用”意指给予受试者或向受试者提供或配发组合物、药剂、治疗性产品，例如含有转基因(如效应子或治疗性基因)的病毒性载体等，或使组合物等接触受试者。施用可通过多种方式完成，例如但不限于肠胃外或全身性施用、静脉(iv)(注射)、皮下、鞘内、颅内、肌肉内、皮肤、皮内、吸入、直肠、阴道内、局部、口服、皮下、肌肉内或眼部施用。在一些实施方案中，施用是全身性的，方式包括接种、注射或静脉注射等。
[0052]“试剂”意指肽、多肽、核酸分子或小分子化合物、抗体，或其片段。
[0053]“改变”意指使用标准技术已知方法，例如本文中描述的方法，所能检测到的基因或多肽表达程度或活力的变化(增强或减弱)。本文中使用的改变包括表达程度变化10％、25％、40％或50％以上。
[0054]“改善(ameliorate)”和“改善(amelioration)”意指降低、抑制、减弱、减少、阻止或稳定疾病的发展或进程。
[0055]“类似物”或“衍生物”意指虽不完全相同，但具有类似的功能性或结构性特征的分子。例如，多肽类似物保留了对应的天然存在的多肽的生物学活性，同时具有某些生化改性，以相对于天然存在的多肽增强类似物的功能。此类生化改性可以增强类似物的蛋白酶抗性、膜渗透性或半衰期，而不改变，例如，多核苷酸结合活性。在另一个示例中，多核苷酸类似物保留了对应的天然存在的多核苷酸的生物学活性，同时具有某些改性，以相对于天然存在的多核苷酸增强类似物的功能。此类改性可以提高多核苷酸的dna亲和力、半衰期，
以及/或核酸酶抗性。类似物可能会包含非天然的核苷酸或氨基酸。
[0056]
本文使用的术语“患病风险”若用于神经系统或神经遗传疾病、病症或病状，例如癫痫发作或癫痫，其意指具有神经系统或神经遗传疾病、病症或病状家族史或遗传风险因子基因的患者或个人。
[0057]
本文使用的术语“载体”意指可以通过其施用组合物或药物组合物(如，包括多核苷酸、病毒性载体，或病毒颗粒)的稀释剂、佐剂、赋形剂，或赋形物。药物载体和药学可接受的载体包括无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或生理盐水以及葡萄糖水溶液和甘油水溶液可用作载体，特别是用于可注射溶液。载体可能也包括固体剂型，包括但不限于粘合剂(用于压缩药丸)、助流剂、包封剂、调味剂和着色剂中的一种或多种。合适的药物载体记载于e.w.马丁(e.w.martin)主编的《雷明顿药物科学》(remington’s pharmaceutical sciences)。
[0058]
本文中使用的“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“包含(containing)”以及“具有(having)”等词具备美国专利法中规定的含义，也指其他“包括(includes)”、“包括(including)”之意；“主要由
……
构成(consisting essentially of)”、“主要由
……
构成(consists essentially)”同样也具备美国专利法中规定的含义，且为开放性表达的词组，其范围可超出文中记载的内容，只要未记载的内容不会改变文中所记载内容的基本特征或新颖特征即可，但现有技术实施方案排除在外。
[0059]“dreadd”为“只能由人工设计的药物激活的人工设计受体”(designer receptor exclusively activated by a designer drug)的首字母缩写。dreadd是经过改性的g蛋白偶联受体(gpcr)，可通过使用病毒性载体((其包含编码dreadd的多核苷酸序列))或通过遗传育种施用于或特异性地引入受试者或其细胞，例如，表达小清蛋白的中间神经元。dreadd被称为化学遗传(chemical genetic)或“化学遗传(chemogenetic)”分子，可实现对神经元兴奋和抑制的精准时间控制。dreadd得到表达之后，可被特定的配体(或激动剂)激活，该配体(或激动剂)可通过静脉注射或口服施用。dreadd和其配体被设计为正交，即：他们彼此特异性地结合，不会发生交叉反应。举一个非限制性示例，有五种不同类别的dreadd可供使用：hm3dq使细胞中的钙水平升高，导致爆发性放电；hm4di降低camp和特定钾通道的激活，导致神经元沉默，并抑制突触前神经递质释放；gsd增强camp，导致调制信号发送；和rq(r165l)增强抑制蛋白信号发送，该特定途径已被视为与精神活性药物的机制有关；以及κ-阿片受体dreadd或kord，其减弱或抑制神经元兴奋，并抑制突触前神经递质释放(参阅，例如，kelly rae chi,2015,the scientist；以及s.m.sternson&b.l.roth,2014,ann rev neuroscience,37:387-407)。
[0060]
正交配体门控离子通道，又称药理学选择性制动器分子(psam)和药理学选择性效应分子(psem)，是用作光遗传试剂和用于光遗传方法的其他类型的化学遗传分子，使用方式与dreadd相似。每个psam只能由psem同源合成激动剂激活。举例而言，设计有三个特定的psam/psem工具，每个工具都有不同的离子电导特性，用于控制神经元兴奋性(参阅，例如，shapiro,m.g.等，2012，acs chem.neurosci.,3(8):619-629)。这些化学遗传分子包括阳离子选择性活化剂psam
q79g,q139g-5ht3hc/psem
22s
、阴离子选择性沉默子psam
l141f,y115f-glyr/psem
89s
，以及第三ca
2 -选择性通道psam
q79g,l141s-nachr v13’t/psem
9s
(参阅同上，以及magnus,c.j.等，2011,science,333(6047):1292-1296)。dreadd以及psam-psem都允许暂时
的神经元活性控制，时长从几分钟到几小时皆可(参阅，例如，kelly rae chi,2015,the scientist；以及s.m.sternson&b.l.roth,2014,ann rev neuroscience,37:387-407)。举例而言，不同的psam已经和多种离子通道及psem一起使用来控制神经元，例如，控制神经元内的兴奋和抑制平衡。此类psam-psem配对包括但不限于psam
l141f,y115f-5ht3 hc，由配体psem
89s
激活，其允许阳离子流入细胞并增强兴奋性；psam
l141f,y115f-glyr，由配体psem
89s
激活，其令神经元沉默；以及psam
q79g,l141s-nachr v13，由配体psem
9s
激活，其会增强钙信号发送。因为有两个不同的psem配体，psam-psem也可以在同一种动物(受试者)身上组合使用。
[0061]“检测”指确认待检测分子、化合物或试剂的存在、缺失或数量。
[0062]“疾病”意指对细胞、组织、器官或身体的一部分，例如大脑(包括大脑皮层和脑组织)的正常功能产生不利影响、损害或干扰的任何病状或病症。在一个实施方案中，该疾病为癫痫发作或癫痫。在另一个实施方案中，该疾病为德拉韦综合征。
[0063]“有效量”指与未经治疗的患者相比，改善疾病症状所需的数量。用于实施所述治疗疾病的方法的活性化合物的有效量因施用方式、受试者年龄、体重及总体健康状况而异。主治医师、临床医师或兽医最终将决定合适的数量和剂量方案。此类数量即为“有效”量。在一个实施方案中，有效量指减少、改善、减轻、抑制或稳定神经系统疾病或病症，例如癫痫发作、癫痫和德拉韦综合征的症状或严重程度所需的raav载体的数量，该raav载体包括特异性增强子序列(例如，本文中记载的scn1a特异性增强子，如e1-e10)以及一个或多个插入该序列的转基因序列(例如，scn1a)。在另一个实施方案中，有效量指引发中间神经元，例如gaba能中间神经元或表达小清蛋白的gaba能中间神经元的特异性抑制活性所需的raav载体的数量，该raav载体包括特异性增强子序列(例如，本文中记载的scn1a特异性增强子，如e1-e10)以及一个或多个插入该序列的转基因序列(例如，scn1a)。在一个实施方案中，该增强子为本文中记载的e2，其将转基因(例如，scn1a或效应子，如用于化学遗传调制小清蛋白-中间神经元活性的gq-dreadd或psam)的表达限制到小清蛋白-中间神经元细胞。
[0064]
术语“内源性”在本文中用于描述天然存在于特定生物体(例如人类)或生物体内特定位置(例如器官、组织，或细胞，如人类细胞)的分子(例如多肽、肽、核酸或辅因子)。
[0065]
术语“外源性”在本文中用于描述非天然或非内源性存在于特定生物体(例如人类)或生物体内特定位置(例如器官、组织，或细胞，如人类细胞)的分子(例如多肽、肽、核酸或辅因子)。外源性材料包括从外部来源提供给生物体或从中提取的培养物的材料。
[0066]“调节元件”、“调节序列”、“增强子”、“增强子元件”或“增强子序列”指核酸或多核苷酸序列，或核酸或多核苷酸序列的一个区域，例如dna或rna，其长度约为50至2500个核苷酸，包含被一种或多种结合蛋白，例如转录因子，识别并结合的一个或多个结合位点。一般而言，前述结合蛋白用作活化剂，以提高特定目标基因转录的概率。不受相对于基因启动子的位置、距离和方向影响，增强子可以激活转录。例如，增强子序列可能会位于基因上游、下游、基因编码区内，或与基因隔着多达100万个碱基对。dna结合蛋白或转录因子与增强子的结合通常会改变dna的构象，从而允许在结合至该dna的转录因子之间发生相互作用。
[0067]
增强子被描述为能够结合转录因子组合的dna序列簇，该些dna序列簇随后与中介体复合物或tfidd的组分相互作用，以帮助募集rna聚合酶(rnapii)。为了完成募集，与增强子结合的转录因子环出间插序列并与基因的启动子区域接触，从而允许增强子在不受距离影响的情况下发挥作用。此外，激活真核基因需要解压缩染色质纤维，解压缩由与增强子结
合的转录因子执行，该转录因子可以募集组蛋白修饰酶或atp依赖性染色质重塑复合物，以改变染色质结构并提高dna对其他蛋白质的可达性(增强子功能综述请参阅，例如，ong,c.-t.&corces,v.g.,2011,nat.rev.genetics,12(4):283-293)。
[0068]
如本文所述，筛选出10个毗邻scn1a基因的增强子，这些增强子因具备将转基因(即scn1a)的表达限制到表达小清蛋白的中间神经元细胞(pv细胞)内的能力而获选，多数pv细胞表达scn1a基因。分离的增强子序列，本文中指s5e1(e1)至s5e10(e10)，被发现具有将scn1a的表达限制gaba能中间神经元的能力。举例而言，e2增强子(s5e2)被证明能将转基因的表达靶向并限制到表达小清蛋白的中间神经元，该些中间神经元表达scn1a。令人欣慰的是，大部分表达scn1a的细胞并非表达小清蛋白的中间神经元。在一个实施方案中，本文中描述的增强子允许将转基因(例如：scn1a，或另一个效应基因，如gq-dreadd或psam)的表达限制到小清蛋白-中间神经元，而非将转基因的表达全部限制在表达scn1a的神经元内。再举例而言，分离的e5增强子(s5e5)被证明能将转基因的表达靶向并限制在脑部谷氨酰胺能锥体神经元内。在一些实施方案中，此类增强子为本文中所述的e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、e8、e9或e10。在一个实施方案中，增强子元件与天然存在的环境相分离。此类增强子元件使用在载体内，如病毒性载体，用于递送物质到细胞、组织或身体区域，如大脑。
[0069]“片段”指多肽或核酸分子的一部分。该部分包含所述核酸分子或多肽整体长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。一个片段可能包含10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。
[0070]“功能性表达”指包含于或插入本文所述raav或raav载体的多核苷酸的基因或转基因在感染或转导的细胞中表达，并产生其编码产物，该编码产物在前述细胞中具有功能性和/或活性。在一个实施方案中，该细胞为中间神经元细胞。在一个实施方案中，该细胞为gaba能中间神经元细胞。在一个实施方案中，该细胞为表达小清蛋白的gaba能中间神经元细胞。在一个实施方案中，该细胞为神经元细胞，尤其是谷氨酰胺能锥体中间神经元细胞。在一个实施方案中，该转基因是一种可检测的报告基因，例如d-tomato、chr2、gfp、rfp等。在一个实施方案中，该转基因为只能由人工设计的药物激活的人工设计受体(dreadd)或gq-dreadd。在一个实施方案中，该转基因为psam。在一个实施方案中，该转基因为编码nav1.1钠通道的scn1a。
[0071]“杂交”指互补核碱基之间的氢键键合，可能为沃森-克里克(watson-crick)氢键键合、胡斯坦(hoogsteen)氢键键合或反向胡斯坦氢键键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键进行配对的互补核碱基。
[0072]
术语“中间神经元”指中枢神经系统(cns)中在感觉神经元和运动神经元之间传递脉冲的神经元(神经细胞)或局部回路神经元。一般而言，神经元是特化细胞，其主要功能为传递神经脉冲。神经元具有细胞过程，例如树突和轴突。树突是神经元细胞体中较短的过程，其接收来自其他神经元的输入，并将信号转导至细胞体。轴突是细胞体较长的单一过程，其将信号传递至神经元尖端(又称突触末梢)。三种主要的神经元类型包括感觉神经元、(中枢神经系统的)中间神经元，以及运动神经元。人类脑部有1000亿个中间神经元，负责接收来自感觉神经元的脉冲。中间神经元会解读从其他神经元接收的信息，并将脉冲传递至运动神经元，以在称为“整合”的功能中做出适当反应。
[0073]“分离”、“纯化”或“生物学上纯净”指材料在不同程度上不包含天然状态下通常与
之相伴或相关的组分。“分离”指与原始来源或周围环境存在一定程度的分隔。“纯化”代表比分离更高程度的分隔。“纯化”或“生物学上纯净”的蛋白质或多核苷酸不包含其他材料，纯净程度足以确保杂质不会对蛋白质或多核苷酸的生物学性质产生实质影响，或造成其他不利后果。换言之，利用重组dna技术制造多核苷酸(核酸)、多肽或肽，或利用化学前体或其他化学品化学合成多核苷酸(核酸)、多肽或肽时，若产物实质上不含细胞材料、病毒材料或培养基，则该多核苷酸(核酸)、多肽或肽是纯化的。纯度和均质性通常使用分析化学技术测定，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。术语“纯化”可以表示核酸、蛋白质或肽在电泳凝胶中实质上产生一条谱带。对于可以进行修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可能会产生不同的分离蛋白质，该些分离蛋白质可以单独纯化。
[0074]“分离的多核苷酸”指核酸(例如dna)，其不包含生物体天然存在基因组中基因侧翼的基因，该核酸分子，例如本文中描述的核酸分子，衍生自该生物体。因此，“分离的多核苷酸”包括，例如，结合到载体中的重组dna、结合到自主复制质粒或病毒中的重组dna，或结合到原核生物或真核生物基因组dna中的重组dna，或作为独立于其他序列的单独分子(例如，通过pcr或限制性内切酶消化产生的cdna或基因组或cdna片段)存在的重组dna。此外，“分离的多核苷酸”包括从dna分子转录的rna分子，以及作为编码额外多肽序列的杂合基因的一部分的重组dna。
[0075]“分离的多肽”指已经和天然与之相伴的组分分离的多肽。典型地，按重量计，若多肽至少有60％不含天然与其相关的蛋白质和天然有机分子，则该多肽为分离的多肽。优选地，该重量比例为至少75％，或至少85％，或至少90％，或至少99％。获得分离的多肽的方法有，例如，从天然来源提取、表达编码多肽的重组核酸，或化学合成蛋白质。可使用任何合适的方法测定纯度，例如，柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳，或hplc分析。
[0076]“标记物”是指在与疾病或病症相关的表达、水平或活性方面具有改变的蛋白质或多核苷酸。在一个实施方案中，标记物为scn1a多核苷酸或scn1a多肽。
[0077]
本文中使用的“突变”意指用另一个残基分别取代序列(如核酸或氨基酸序列)中的核苷酸碱基或氨基酸残基，或在序列中删除或插入一个或多个残基。突变在本文中的典型描述方式为：识别原始残基，然后再确定原始残基在序列中的位置和新取代残基的身份。本文提供的各种氨基酸取代(突变)方法均为本领域技术人员所熟知。氨基酸取代方法请参阅，例如，green和sambrook所著的molecular cloning:a laboratory manual((第四版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，2012))。
[0078]
本文中使用的“获得”，例如“获得药剂”，包括合成、采购或其他方式获取药剂。
[0079]“多核苷酸”指编码一个或多个多肽的核酸分子，例如：双链(double-stranded,ds)dna多核苷酸、单链(single-stranded,ss)dna多核苷酸、dsrna多核苷酸或ssrna多核苷酸。术语“多核苷酸”包括正义(即蛋白质编码)dna多核苷酸，其能经过转录形成rna转录物，该转录物随后可在一次或多次选择性rna加工事件(例如，通过rna剪接，或通过5’端帽连接或3’聚腺苷酸尾连接进行内含子切除)后经翻译形成多肽。“多核苷酸”还包括正义rna多核苷酸，其能在一个或多个选择性rna加工事件后经直接翻译产生多肽。本文中使用的多核苷酸可能包含于病毒性载体中，如重组腺相关病毒性载体(raav)。
[0080]
本文使用的“核酸”和“核酸分子”指包括核碱基和酸性部分(例如，核苷、核苷酸，或核苷酸的聚合物)的化合物。聚核酸，例如，包括三个或以上核苷酸的核酸分子，通常为线
性分子，其中，相邻的核苷酸通过磷酸二酯链接相互连接。在一些实施方式中，“核酸”指单独的核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方式中，“核酸”指包括三个或以上单独核苷酸残基的寡核苷酸链。本文使用的术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以互换使用，均指核苷酸的聚合物(例如，至少三个核苷酸的串)。在一些实施方式中，“核酸”包括rna以及单链和/或双链dna。核酸可以是天然存在的，例如，在基因组、转录物、mrna、trna、rrna、sirna、snrna、质粒、粘粒、染色体、染色单体，或其他天然核酸分子的上下文中。另一方面，核酸分子可以是非天然存在的分子，例如，重组dna或rna、人工染色体、工程化基因组，或其片段，或合成的dna、rna、dna/rna杂交体，或包括非天然存在的核苷酸或核苷。此外，“核酸”、“dna”、“rna”和/或类似术语包括核酸类似物，例如具有非磷酸双酯骨架的类似物。核酸可从天然来源中纯化取得，利用重组表达系统制得，以及通过选择性纯化、化学合成等方式获得。适当情况下，例如化学合成的分子，核酸可以包括核苷类似物，例如，具有化学改性的碱基或糖，以及骨架改性的类似物。除非另有说明，否则核酸序列在5’至3’的方向上呈现。在一些实施方式中，核酸是或包括天然核苷(如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(如2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、o(6)-甲基鸟苷，和2-硫代胞苷)；化学修饰碱基；生物修饰碱基(如甲基化碱基)；插层碱基；修饰糖(如2
’‑
氟代核糖、2
’‑
核糖、2
’‑
脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰磷酸酯基团(如硫代磷酸酯和5'-n-亚磷酰胺链接)。
[0081]
本文使用的术语“药学可接受的”指生理上可耐受的分子实体、生物产品或组合物，给患者(如人类患者)施用时通常不会产生过敏或其他不良反应，例如胃部不适、头晕等。
[0082]
本文使用的术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等指降低在受试者身上发生病症或病状的概率，该受试者目前没有，但存在发生病症或病状的风险，或容易或倾向于发生病症或病状。
[0083]
本文使用的术语“假型”指包含一种或多种外来病毒结构蛋白，例如包膜糖蛋白的病毒性载体。假型病毒可以是包膜病毒的包膜糖蛋白或无包膜病毒的衣壳蛋白源自与原始病毒基因组来源和基因组复制装置不同的病毒(d.a.sanders,2002,curr.opin.biotechnol.,13:437-442)。假型病毒的外来病毒包膜蛋白可以用于改变宿主嗜性，或增加或降低病毒颗粒的稳定性。假型病毒性载体的示例包括包含一种或多种包膜糖蛋白的病毒，该一种或多种包膜糖蛋白并非天然存在于野生型病毒的外部。假型病毒性载体可以感染细胞，并表达和产生由多核苷酸编码的蛋白质或分子，例如包含于病毒性载体中的报告基因或效应子蛋白或分子，例如由scn1a基因编码的钠通道nav1.1。
[0084]
本文在蛋白质或核酸上下文中使用的术语“重组”指不存在于自然界(或天然存在的蛋白质或核酸序列中)的蛋白质或核酸，而是人类基因工程的产物，经常或通常经过利用本领域技术人员使用的分子生物学或分子遗传工具或技术制成。例如，在一些实施方案中，重组蛋白或核酸分子包括氨基酸或核苷酸序列。与天然存在的序列相比，该核苷酸序列包括至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个，或至少八个突变。
[0085]“减少”指至少5％、10％、25％、50％、75％，或100％的负性改变。
[0086]“参考”指标准或对照条件。“参考序列”是用作序列对比基础的定义序列。参考序列可以是特定序列的子集或全部，例如全长cdna或基因序列的片段，或是完整的cdna或基因序列。就多肽而言，参考多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约50个氨基酸，或至少约100个氨基酸。就核酸而言，参考核酸序列的长度通常为至少约50个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约75个核苷酸，或约100个核苷酸，或约300个核苷酸，或100或300左右的任意整数，或100至300之间的任意整数。
[0087]“特异性结合”指识别并结合给定的多肽和/或核酸分子，但基本上不会识别并结合样品(如生物样品)中其他分子的核酸分子、多肽或其复合物(例如，结合蛋白，如转录因子及其同源核酸结合区)，或化合物，或分子。
[0088]“受试者”指哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，例如非人类灵长类动物如狨猴，或非人类哺乳动物如牛、马、犬、绵羊或猫科哺乳动物，或绵羊、山羊、美洲驼、骆驼或啮齿动物(大鼠、小鼠)、雪貂、沙鼠、仓鼠或斑马雀。受试者通常是患者，例如人类患者，其因本文中描述的特定疾病或病症(例如：神经精神性、神经系统或神经遗传疾病、病症或病状，如癫痫发作、癫痫或ds)接受治疗。受试者和患者的示例包括因此类疾病或病症接受治疗或有患此类疾病或病症风险的哺乳动物，例如人类。
[0089]
本文提供的范围应理解为该范围内所有数值的简写。例如，1至50的范围应理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50(包括第一和最后一个数值)，所组成群组中的任意数字、数字组合，或子范围。
[0090]
本文使用的术语“治疗有效量”是指在向需要治疗的患者施用后，足以治疗、减轻、减少、诊断、预防和/或延迟疾病、病症和/或病状的一种或多种症状发作的治疗剂的量。在一些情况下，治疗有效量还可以指预防性地(例如，在发展成典型的疾病之前)向具有患疾病或其症状(例如，神经系统、神经退行性或神经遗传疾病或病症)风险的受试者施用的治疗剂的量。在一个实施方案中，该病症为德拉韦综合征(ds)。
[0091]
本文使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等指减轻或改善病症和/或与其相关的症状。应当理解，尽管不排除完全消除的情况，但治疗病症或病状并不要求该病症、病状或与其相关联的症状完全消除。“治疗”可以指治疗性治疗，其目的是预防或减缓(减轻或减少)不良的生理变化或紊乱。有益或良性临床结果包括但不限于症状缓解、疾病程度减轻、疾病状态稳定(即，没有恶化)、疾病进程延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和，以及(部分或彻底)缓解，无论该些结果是否能够被察觉。需要治疗的对象包括已经患有该病状或病症的人，以及易于患有该病状或病症的人，或需要预防该病状或病症的人。
[0092]
本文使用的术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”和“预防性治疗(prophylactic treatment)”等指抑制或阻断受试者的疾病状态或疾病的完全发展，或降低受试者发生疾病、病症或病状的概率，该受试者目前没有，但存在发生疾病、病症或病状的风险，或容易发生疾病、病症或病状。
[0093]
本文使用的术语“载体”指核酸(例如dna载体，如质粒)、rna载体、病毒或其他合适
的复制子(例如病毒性载体)。“载体”进一步指在不破坏载体在宿主细胞中表达、复制和/或整合到宿主细胞中的能力的情况下，可以将外来核酸插入其中的核酸(多核苷酸)分子。已经开发出了多种载体，用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送进原核或真核细胞。载体可以包含包括目标基因(例如转基因，如治疗基因、报告基因，或更具体地，编码nav1.1钠通道的scn1a基因)的多核苷酸序列，以及，例如，能够调控转录、翻译和/或将该些多核苷酸序列整合到细胞基因组中的附加序列元件。载体可以包含引导基因转录的调控序列，例如，启动子，如亚基因组启动子、区域和增强子区域。载体可以包含提高前述基因的翻译速度或增强基因转录产生的mrna的稳定性和核输出多核苷酸序列(增强子序列)。前述序列元件可以包括，例如，5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(ires)，和/或聚腺苷酸化信号位点，以引导表达载体上携带的基因的有效转录。载体，例如本文所述的病毒性载体或raav载体，也可以称为表达载体。
[0094]“转导”指通过病毒或病毒性载体将包含在病毒或病毒性载体中的dna或多核苷酸，例如，一种或多种转基因，引入或转移到细胞的过程，其中，该dna或多核苷酸得到表达。在一个实施方案中，通过病毒性载体，例如本文所述的raav载体，转导到细胞的dna或多核苷酸在细胞中稳定表达。在某些情况下，病毒或病毒性载体据称会感染细胞。
[0095]
本文使用的术语“媒介物”指药物组合物的溶剂、稀释剂或载体组分。
[0096]“病毒颗粒”(又称病毒粒子(virion))指包含核心病毒基因组或遗传物质(rna或dna)，以独立颗粒存在的病毒(感染源)；蛋白质外壳，又称衣壳，其包围并保护遗传物质；以及，在某些情况下，包围衣壳的脂质包膜。病毒颗粒可以指病毒在感染细胞并成为胞内物质前的形式，也可以指感染细胞的病毒的形式。
[0097]“病毒样颗粒(vlp)”指由多种病毒结构蛋白中的一种组成，但缺乏病毒基因组的病毒颗粒。由于缺乏病毒基因组，病毒样颗粒不具感染性，能制成更安全且价格可能更实惠的疫苗或疫苗产品。此外，病毒样颗粒通常可以通过异源表达产生，易于纯化。大多数病毒样颗粒包括至少一种病毒核心蛋白，其驱动颗粒出芽并从宿主细胞释放。
[0098]“实质相同”指与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任意氨基酸序列)或参考核酸序列(例如，本文所述的任意核酸序列)具有至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，此类序列在氨基酸或核酸方面与用于对比(例如，通过指定的对比窗口)的序列具有至少60％的同一性，优选地，至少70％的同一性，更优选地，80％或85％的同一性，以及最优选地，90％、95％或甚至99％的同一性。最佳比对可以通过needleman和wunsch(1970,j.mol.biol.,48:443)的同源比对算法进行。两个肽或多肽序列实质相同的一个指示是一个肽或多肽与针对第二个肽或多肽的特定抗体具有免疫反应，尽管这种交叉反应性并非两个多肽被视为实质相同的条件。因此，肽或多肽与第二肽或多肽的区别若仅为，例如，保守性取代，则两者实质相同。“实质相似”的肽或多肽均具有上述序列，差别在于不同的残基位置可能会因保守性氨基酸变化而相异。保守性取代通常包括但不限于下列组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸，以及本领域技术人员知晓的其他物质。
[0099]
序列同一性通常使用序列分析软件(例如，由威斯康星州麦迪逊市大学大道1710号，邮编53705，威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机小组开发的序列分析软件包、blast、bestfit、gap或pileup/prettybox程序)测定。此类软件通过为各种取代、缺失和/或
其他修饰指定同源程度来匹配相同或相似的序列。保守性取代通常包括下列组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，概率分数落在e-3
和e-100
之间说明序列密切相关。
[0100]“实质相同”一般指多肽或核酸分子与参考氨基酸序列(例如本文所述的任意氨基酸序列)或参考核酸序列(例如本文所述的任意核酸序列)具有至少50％的同一性。在一些实施方案中，此类序列与用于比较的序列在氨基酸或核酸方面具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或以上，或至少99％的同一性。
[0101]
可用于本文所述方法和组合物的多核苷酸或病毒核酸分子包括编码多肽的任意核酸分子或其片段，或编码本文所述病毒性载体组分的任意核酸分子。该些多核苷酸或病毒核酸分子可以编码病毒性载体携带的多肽产物，如重组腺相关病毒(raav)等，以及肽或其片段。此类核酸分子无需与内源序列或病毒性载体核酸序列100％相同，但通常具有实质同一性。与内源序列或病毒性载体序列具有实质同一性的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链或与病毒性载体核酸分子杂交。可用于本文所述方法的核酸分子包括编码本文所述多肽或其片段的任意核酸分子。“杂交”是指在各种严格条件下将核酸分子配对，以在互补的多核苷酸序列(例如本文所述的基因或核酸序列)或其部分之间形成双链分子(参见例如，wahl,g.m.和s.l.berger(1987)methods enzymol.152:399；kimmel,a.r.(1987)methods enzymol.152:507)。
[0102]
例如，严格的盐浓度通常低于约750mm的氯化钠和75mm的柠檬酸三钠，优选地低于约500mm的氯化钠和50mm的柠檬酸三钠，更优选地低于约250mm的氯化钠和25mm的柠檬酸三钠。可以在缺少有机溶剂(例如甲酰胺)的情况下获得低严格度杂交，而高严格度杂交则可以在存在至少约35％甲酰胺，更优选地至少约50％甲酰胺的情况下获得。严格的温度条件通常包括至少30℃，更优选地至少约37℃，以及最优选地至少约42℃的温度。不同的附加参数，例如杂交时间、清洁剂(例如十二烷基硫酸钠(sds))浓度，以及载体dna的包含或排除，为本领域技术人员所熟知。不同的严格程度是根据需要，通过组合这些不同的条件实现的。在一个实施方案中，杂交会在30℃下于750mm氯化钠、75mm柠檬酸三钠和1％sds中发生。在一个更优选的实施方案中，杂交会在37℃下于500mm氯化钠、50mm柠檬酸三钠、1％sds、35％甲酰胺以及100μg/ml变性鲑鱼精子dna(ssdna)中发生。在另一个实施方案中，杂交会在42℃下于250mm氯化钠、25mm柠檬酸三钠、1％sds、50％甲酰胺以及200μg/ml ssdna中发生。这些条件的有用变化对本领域技术人员来说是显而易见的。
[0103]
对于大多数应用，杂交之后的洗涤步骤在严格度方面也有所不同。洗涤严格度条件可以通过盐浓度和温度限定。如上所述，可以通过降低盐浓度或通过升高温度加强洗涤的严格度。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度优选地为小于约30mm氯化钠和3mm柠檬酸三钠，最优选地为小于约15mm氯化钠和1.5mm柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件通常包括至少约25℃，更优选地至少约42℃，甚至更优选地至少约68℃。在一个实施方案中，洗涤步骤将在25℃下，于30mm氯化钠、3mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生。在另一个实施方案中，洗涤步骤将在42℃下，于15mm氯化钠、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生。在又一个实施方案中，洗涤步骤将在68℃下，于15mm氯化钠、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生。这些条件的额外变化对于本领域技术人员是显而易见的。杂交技术为本领域技术人员所熟
知，并且记载于现有资料中，例如：benton和davis(science,196:180,1977)；grunstein和hogness(proc.natl.acad.sci.,usa,72:3961,1975)；ausubel等所著的current protocols in molecular biology(wiley interscience出版社，纽约，2001)；berger和kimmel所著的guide to molecular cloning techniques(1987，academic press出版社，纽约)；以及sambrook等所著的molecular cloning:a laboratory manual(冷泉港实验室出版社，纽约)。
[0104]
如果核酸编码的多肽基本上相同，则在严格条件下彼此不杂交的核酸仍基本上相同。例如，使用遗传密码允许的最大密码子简并性创建核酸副本时，这种情况就会发生。在这种情况下，核酸通常在中等严格度杂交条件下杂交。“中等严格度杂交条件”的非限制性示例包括于37℃下在40％甲酰胺、1m氯化钠和1％sds的缓冲液中杂交，以及于45℃下在1xssc中洗涤。阳性杂交至少两倍于背景。本领域技术人员将容易地意识到可以利用其他可替代的杂交和洗涤条件来提供类似的严格度条件。
[0105]“直系同源物”指生物体内与来自另一生物体的参考蛋白或核酸序列高度相关的多肽或核酸分子。相关性程度可以用参考蛋白在，例如，blast搜索中识别序列的概率来表示。参考序列将随机序列识别为直系同源物的概率极低，小于e-10
、e-20
、e-30
、e-40
、e-50
、e-75
、e-100
。本领域技术人员了解直系同源物可能与参考蛋白或核酸序列在功能上相关。换言之，直系同源物及其参考分子预计在它们各自的生物体(例如小鼠和人类直系同源物)内发挥即使不是等效，也是类似的功能作用。
[0106]
与参考序列比对时，直系同源物无需与参考序列具有特定程度的氨基酸序列同一性。例如，蛋白质同源物可能会在蛋白质的整个长度上具有显著的氨基酸序列同一性，或者，仅在单个功能上重要的结构域上具有显著的氨基酸序列同一性。此类功能上重要的结构域可以通过基因突变或结构-功能分析来定义。可以使用本领域惯用的方法识别直系同源物。可以使用本领域技术人员熟知的方法测定直系同源物的功能作用。例如，使用生物化学、免疫或酶测定法或转化救援对功能进行体内或体外测定。或者，可以在组织培养中进行生物测定；还可以通过基因失活(例如rnai、sirna或基因敲除)或基因过度表达以及其他方法测定功能。
[0107]
本文提供的范围应理解为该范围内所有数值的简写。例如，1至50的范围应理解为包括组1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50(包括第一和最后一个数值)里的任意数值、数值组合或子范围。
[0108]
scnia是指与scnia的标准氨基酸序列的氨基酸序列具有至少约或等于85％，或至少约或等于90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的多肽或蛋白质(钠通道nav1.1)或其片段。该scnia的标准氨基酸序列的氨基酸序列为人类异形体1，omniprot识别号p35498-1(长度为2,009个氨基酸；质量(da)：228,972)，refseq编号：np_001159435.1；np_001189364.1；np_001340877。人类scn1a的多肽(蛋白)序列如下：
[0109]
[0110][0111]
编码钠通道nav1.1的是人类scn1a多核苷酸序列或其片段，该人类scn1a多核苷酸序列或其片段与下述编录号为ncbi ccds 54413.1的scn1a多核苷酸序列(refseq编号：nm_001165963.2；nm_001202435.2；nm_001353948.1)具有至少约或等于85％，或至少约或等于90％、95％、98％、99％或更高的序列同一性。基因组信息源自国际基因组参照协会(genome reference consortium)发布的grch38.p12。genbank编录号：gca_000001405.27(最新)；refseq编录号：gcf_000001405.38(最新)。
[0112]
scn1a核苷酸序列(6030nt)：
[0113]
atggagcaaacagtgcttgtaccaccaggacctgacagcttcaacttcttcaccagagaatctcttgcggctattgaaagacgcattgcagaagaaaaggcaaagaatcccaaaccagacaaaaaagatgacgacgaaaatggcccaaagccaaatagtgacttggaagctggaaagaaccttccatttatttatggagacattcctccagagatggtgtcagagcccctggaggacctggacccctactatatcaataagaaaacttttatagtattgaataaagggaaggccatcttccggttcagtgccacctctgccctgtacattttaactcccttcaatcctcttaggaaaatagctattaagattttggtacattcattattcagcatgctaattatgtgcactattttgacaaactgtgtgtttatgacaatgagtaaccctcctgattggacaaagaatgtagaatacaccttcacaggaatatatacttttgaatcacttataaaaattattgcaaggggattctgtttagaagattttactttccttcgggatccatggaactggctcgatttcactgtcattacatttgcgtacgtcacagagtttgtggacctgggcaatgtctcggcattgagaacattcagagttctccgagcattgaagacgatttcagtcattccaggcctgaaaaccattgtgggagccctgatccagtctgtgaagaagctctcagatgtaatgatcctgactgtgttctgtctgagcgtatttgctctaattgggctgcagctgttcatgggcaacctgaggaataaatgtatacaatggcctcccaccaatgcttccttggaggaacatagtatagaaaagaatataactgtgaattataatggtacacttataaatgaaactgtctttgagtttgactggaagtcatatattcaagattcaagatatcattatttcctggagggttttttagatgcactactatgtggaaatagctctgatgcaggccaatgtccagagggatatatgtgtgtgaaagctggtagaaatcccaattatggctacacaagctttgataccttcagttgggcttttttgtccttgtttcgac
taatgactcaggacttctgggaaaatctttatcaactgacattacgtgctgctgggaaaacgtacatgatattttttgtattggtcattttcttgggctcattctacctaataaatttgatcctggctgtggtggccatggcctacgaggaacagaatcaggccaccttggaagaagcagaacagaaagaggccgaatttcagcagatgattgaacagcttaaaaagcaacaggaggcagctcagcaggcagcaacggcaactgcctcagaacattccagagagcccagtgcagcaggcaggctctcagacagctcatctgaagcctctaagttgagttccaagagtgctaaggaaagaagaaatcggaggaagaaaagaaaacagaaagagcagtctggtggggaagagaaagatgaggatgaattccaaaaatctgaatctgaggacagcatcaggaggaaaggttttcgcttctccattgaagggaaccgattgacatatgaaaagaggtactcctccccacaccagtctttgttgagcatccgtggctccctattttcaccaaggcgaaatagcagaacaagccttttcagctttagagggcgagcaaaggatgtgggatctgagaacgacttcgcagatgatgagcacagcacctttgaggataacgagagccgtagagattccttgtttgtgccccgacgacacggagagagacgcaacagcaacctgagtcagaccagtaggtcatcccggatgctggcagtgtttccagcgaatgggaagatgcacagcactgtggattgcaatggtgtggtttccttggttggtggaccttcagttcctacatcgcctgttggacagcttctgccagaggtgataatagataagccagctactgatgacaatggaacaaccactgaaactgaaatgagaaagagaaggtcaagttctttccacgtttccatggactttctagaagatccttcccaaaggcaacgagcaatgagtatagccagcattctaacaaatacagtagaagaacttgaagaatccaggcagaaatgcccaccctgttggtataaattttccaacatattcttaatctgggactgttctccatattggttaaaagtgaaacatgttgtcaacctggttgtgatggacccatttgttgacctggccatcaccatctgtattgtcttaaatactcttttcatggccatggagcactatccaatgacggaccatttcaataatgtgcttacagtaggaaacttggttttcactgggatctttacagcagaaatgtttctgaaaattattgccatggatccttactattatttccaagaaggctggaatatctttgacggttttattgtgacgcttagcctggtagaacttggactcgccaatgtggaaggattatctgttctccgttcatttcgattgctgcgagttttcaagttggcaaaatcttggccaacgttaaatatgctaataaagatcatcggcaattccgtgggggctctgggaaatttaaccctcgtcttggccatcatcgtcttcatttttgccgtggtcggcatgcagctctttggtaaaagctacaaagattgtgtctgcaagatcgccagtgattgtcaactcccacgctggcacatgaatgacttcttccactccttcctgattgtgttccgcgtgctgtgtggggagtggatagagaccatgtgggactgtatggaggttgctggtcaagccatgtgccttactgtcttcatgatggtcatggtgattggaaacctagtggtcctgaatctctttctggccttgcttctgagctcatttagtgcagacaaccttgcagccactgatgatgataatgaaatgaataatctccaaattgctgtggataggatgcacaaaggagtagcttatgtgaaaagaaaaatatatgaatttattcaacagtccttcattaggaaacaaaagattttagatgaaattaaaccacttgatgatctaaacaacaagaaagacagttgtatgtccaatcatacagcagaaattgggaaagatcttgactatcttaaagatgtaaatggaactacaagtggtataggaactggcagcagtgttgaaaaatacattattgatgaaagtgattacatgtcattcataaacaaccccagtcttactgtgactgtaccaattgctgtaggagaatctgactttgaaaatttaaacacggaagactttagtagtgaatcggatctggaagaaagcaaagagaaactgaatgaaagcagtagctcatcagaaggtagcactgtggacatcggcgcacctgtagaagaacagcccgtagtggaacctgaagaaactcttgaaccagaagcttgtttcactgaaggctgtgtacaaagattcaagtgttgtcaaatcaatgtggaagaaggcagaggaaaacaatggtggaacctgagaaggacgtgtttccgaatagttgaacataactggtttgagaccttcattgttttcatgattctccttagtagtggtgctctggcatttgaagatatatatattgatcagcgaaagacgattaagacgatgttggaatatgctgacaaggttttcacttacattttcattctggaaatgcttctaaaatgggtggcatatggctatcaaacatatttcaccaatgcctggtgttggctggacttcttaattgttgatgtttcattggtcagtttaacagcaaatgccttgggttactcagaacttggagccatcaaatctctcaggacactaagagctctgagacctctaagagccttatctcgatttgaagggatgagggtggttgtgaatgcccttttaggagcaattccatccatcatgaatgtgcttctggtttgtcttatattctggctaattttcagcatcatgggcg
taaatttgtttgctggcaaattctaccactgtattaacaccacaactggtgacaggtttgacatcgaagacgtgaataatcatactgattgcctaaaactaatagaaagaaatgagactgctcgatggaaaaatgtgaaagtaaactttgataatgtaggatttgggtatctctctttgcttcaagttgccacattcaaaggatggatggatataatgtatgcagcagttgattccagaaatgtggaactccagcctaagtatgaagaaagtctgtacatgtatctttactttgttattttcatcatctttgggtccttcttcaccttgaacctgtttattggtgtcatcatagataatttcaaccagcagaaaaagaagtttggaggtcaagacatctttatgacagaagaacagaagaaatactataatgcaatgaaaaaattaggatcgaaaaaaccgcaaaagcctatacctcgaccaggaaacaaatttcaaggaatggtctttgacttcgtaaccagacaagtttttgacataagcatcatgattctcatctgtcttaacatggtcacaatgatggtggaaacagatgaccagagtgaatatgtgactaccattttgtcacgcatcaatctggtgttcattgtgctatttactggagagtgtgtactgaaactcatctctctacgccattattattttaccattggatggaatatttttgattttgtggttgtcattctctccattgtaggtatgtttcttgccgagctgatagaaaagtatttcgtgtcccctaccctgttccgagtgatccgtcttgctaggattggccgaatcctacgtctgatcaaaggagcaaaggggatccgcacgctgctctttgctttgatgatgtcccttcctgcgttgtttaacatcggcctcctactcttcctagtcatgttcatctacgccatctttgggatgtccaactttgcctatgttaagagggaagttgggatcgatgacatgttcaactttgagacctttggcaacagcatgatctgcctattccaaattacaacctctgctggctgggatggattgctagcacccattctcaacagtaagccacccgactgtgaccctaataaagttaaccctggaagctcagttaagggagactgtgggaacccatctgttggaattttcttttttgtcagttacatcatcatatccttcctggttgtggtgaacatgtacatcgcggtcatcctggagaacttcagtgttgctactgaagaaagtgcagagcctctgagtgaggatgactttgagatgttctatgaggtttgggagaagtttgatcccgatgcaactcagttcatggaatttgaaaaattatctcagtttgcagctgcgcttgaaccgcctctcaatctgccacaaccaaacaaactccagctcattgccatggatttgcccatggtgagtggtgaccggatccactgtcttgatatcttatttgcttttacaaagcgggttctaggagagagtggagagatggatgctctacgaatacagatggaagagcgattcatggcttccaatccttccaaggtctcctatcagccaatcactactactttaaaacgaaaacaagaggaagtatctgctgtcattattcagcgtgcttacagacgccaccttttaaagcgaactgtaaaacaagcttcctttacgtacaataaaaacaaaatcaaaggtggggctaatcttcttataaaagaagacatgataattgacagaataaatgaaaactctattacagaaaaaactgatctgaccatgtccactgcagcttgtccaccttcctatgaccgggtgacaaagccaattgtggaaaaacatgagcaagaaggcaaagatgaaaaagccaaagggaaataa(seq id no:2)。
[0114]
由scn1a基因编码的钠通道nav1.1在大脑皮层多个不同的神经元群里表达，包括三个不重叠的神经元群：表达小清蛋白的快速尖峰皮层中间神经元(pv cin)、表达血管活性肠肽的去抑制皮层中间神经元(vip cin)以及第五层锥体神经元。
[0115]
ncbi参考序列np_000731.1中提供了未经修饰的人类毒蕈碱乙酰胆碱受体m3的氨基酸序列。ncbi参考序列np_000731.1如下文所述。本文还包括与下列氨基酸序列具有至少约或等于85％，或至少约或等于90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的多肽或蛋白质或其功能片段。
[0116]
1 mtlhnnstts plfpnisssw ihspsdaglp pgtvthfgsy nvsraagnfs spdgttddpl
[0117]
61 gghtvwqvvf iafltgilal vtiignilvi vsfkvnkqlk tvnnyfllsl acadliigvi
[0118]
121 smnlfttyii mnrwalgnla cdlwlaidyv asnasvmnll visfdryfsi trpltyrakr
[0119]
181 ttkragvmig lawvisfvlw apailfwqyf vgkrtvppge cfiqflsept itfgtaiaaf
[0120]
241 ympvtimtil ywriyketek rtkelaglqa sgteaetenf vhptgssrsc ssyelqqqsm
[0121]
301 krsnrrkygr chfwfttksw kpsseqmdqd hsssdswnnn daaaslensa ssdeedigse
arg lys gln gln tyr gln gln arg gln ser val ile phe his lys arg ala pro glu gln ala leu(seq id no:4)。
[0128]
除非特别说明或从上下文显而易见，否则本文使用的术语“或”应理解为包括在内。除非特别说明或从上下文显而易见，否则本文使用的术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”应理解为单数或复数。
[0129]
本文使用的术语“约”或“大约”指就所描述的数值类型和用于测量该数值的方法而言，在一个可接受的误差范围内。例如，该术语可表示在给定数值或范围的20％以内，优选地在10％以内，最优选地在5％以内。更具体地，“约”可以理解为在规定数值或范围的20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内。或者，尤其是在生物学系统中，术语“约”指在一个对数单位(即一个数量级)，优选地在给定数值的两倍以内。除非特别说明或从上下文显而易见，否则本文使用的术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的两个标准偏差内。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
[0130]
本文在定义变量时记载的化学基团或组分基团的列表包括将该变量定义为单一基团或所列基团的组合。本文记载的变量或方面的实施方案包括单一实施方案或与本文所述的其他实施方案或其部分组合使用。
[0131]
本文提供的组合物或方法可以与本文提供的一个或多个其他组合物及方法组合使用。
附图说明
[0132]
图1a-1、1a-2、1a-3、1b-1、1b-2、1c和1d为与特定增强子(调控)序列(本文称之为e1-e35)的发现和识别相关的表格数据及信息。图中所示为针对在表达小清蛋白的中间神经元等gaba能中间神经元内scn1a受限基因表达的增强子(例如e1-e10)，以及靶向表中其他基因的增强子。图1a-1中的表格数据描述了小鼠基因组中35个增强子元件(即e1-e35)的基因、靶标(如神经元细胞类型)、特异性、位置(如基因间或基因内)、染色体定位，以及基因组序列起始和终止位点特征。相似地，图1a-2和1a-3中的表格数据描述了人类基因组中该35个增强子元件(即e1-e35)的基因、靶标(如神经元细胞类型)、特异性、位置(如基因间或基因内)、染色体定位，以及基因组序列起始和终止位点特征。举例而言，在人类scn1a基因附近、小鼠基因组(图1a-1)和人类基因组中(图1a-2和1a-3)识别到增强子(调控)元件e1-e10(本文中又称s5e1-s5e10)。在图1a-1至1a-3中，本文所述小鼠和人类增强子元件的多核苷酸序列具有表格(以及图15a-1、15a-2、16a-1和16a-2)中所列小鼠和人类基因组中的起始和终止位点；小鼠和人类增强子序列通过图1a-1至1a-3中表格所列的基因组信息提供，该些基因组信息通过网络即可查询得到。图1b-1和1b-2所示图像显示了大脑皮层层中表达小清蛋白的中间神经元内e1-e10增强子元件受限报告基因的表达。图像显示了在将paav-s5-e2-dtomato载体全身体内注射到动物(小鼠)中后，脑切片中dtomato的免疫组织化学(ihc)染色分析结果，可由此检测载体转导的特定细胞。图1c和1d的图形描述了报告基因在大脑皮层表达小清蛋白的中间神经元内的表达特异性(图1c)和敏感性(图1d)的程度量化。报告基因的表达受包含在raav载体中的e1-e10增强子元件控制。将paav-s5-e2-dtomato载体全身体内注射到动物(小鼠)后，通过脑切片的免疫组织化学来评估表达病毒报告基因
dtomato的细胞的比例来量化特异性，该病毒报告基因dtomato共表达pv中间神经元标记pv。将paav-s5-e2-dtomato载体全身体内注射到动物(小鼠)后，通过脑切片的免疫组织化学来评估表达pv中间神经元标记pv的细胞的比例来量化敏感性，该pv中间神经元标记pv共表达于病毒报告基因dtomato中，该pv中间神经元标记pv共表达于病毒报告基因dtomato中。条形图表示平均值 /-，平均值的标准误差。
[0133]
图2a和2b的图像展示了利用包含e2增强子元件序列和报告转基因(如d-tomato)或效应基因(如gq-dreadd)的raav载体在包括皮层在内的大脑结构中定位报告基因表达。图2a的图像显示了在向动物(小鼠)全身体内注射paavs5-e2-dtomato载体后，脑切片(图2a顶部为矢状切面；图2a下部为冠状切面)中dtomato报告基因的免疫组织化学(ihc)染色分析结果，可由此检测载体转导的特定细胞。图2b的图像显示了在给动物(小鼠)全身体内注射paav-s5-e2-dtomato载体后，脑切片中表达的dtomato报告基因的免疫组织化学(ihc)染色分析结果，可由此检测特定的表达pv的细胞。来自paav-s5-e2-dtomato载体的报告基因表达显示在脑切片中(图2b左侧图中的红色)。在图2b中，来自paav-s5-e2-gq-dreadd-dtomato的报告基因表达针对gq-dreadd以绿色显示，针对dtomato则以红色显示。图2b左侧和右侧图中显示载体转导的表达pv的特定细胞的侦测。
[0134]
图3a至3f显示与scn1a增强子的识别相关的示意图、曲线图、图表和共聚焦显微镜图像。图3a提供了scatac-seq管道的示意图。从成年dlx6a
cre
::sun1-egfp小鼠的视觉皮层收集中间神经元。图3b为umap空间中3500个细胞核的曲线图。从snapatac管道获取的簇集被归类为四个主要的中间神经元类别。图3c是维恩图(venn diagram)，显示四个中间神经元群pv、sst、vip和id2中独特和共享峰值的数量。图3d的示意图展示了本文方法部分(实施例8)描述的在scn1a基因座选择增强子的方法。图3e和3f阐释了向成年小鼠全身注射包含增强子元件的raav-e[x]-dtomato载体后取得的结果，以及注射三周后的分析结果。s1皮层中报告基因和指定标记物的免疫组织化学(ihc)评估用于评定报告基因的表达强度(图3e上图)和病毒报告基因针对指定标记物的表达特异性(其他所有图)。图3f左侧各图为体感皮层中指定病毒报告基因的代表性荧光图像。虚线代表解剖结构的限度，比例尺为100μm。图表中的圆点代表各个测量值，线条代表平均 /-，即平均值标准偏差。
[0135]
图4a-4e显示与小鼠pv皮层中间神经元(pv cins)的病毒靶向相关的图像、图表和记录痕迹。在e2调控元件的控制下，向成年小鼠全身注射(图4a-4b中的图像)或局部注射(图4d)表达报告基因dtomato的raav-e2-dtomato，并在注射后三周利用免疫组织化学(ihc)或ish分析报告基因和pv标记物。图4c为病毒标记神经元内在特性的切片记录。图4d(右侧图)图表解释了相对于报告基因表达强度的表达特异性，该特异性即为表达报告基因的细胞的比例，该报告基因共表达pv。图4e中的图像展示了实验结果，其中，在e2调控元件的控制下，向小鼠局部注射表达报告基因dtomato的raav-e2-dtomato，并在报告基因和指定标记物的指定发展阶段进行分析。比例尺为250μm(图4a)和50μm(图4b、4d、4e)。图表中的圆点代表各个测量值，线代表平均 /-，即平均值标准偏差。
[0136]
图5a-5e为与小鼠pv皮层中间神经元(pc cins)的病毒监测和操作相关的图像、电流钳记录迹线和图表。在体感(s1)皮层向小鼠局部注射raav(图5a-p10注射raav-e2-syp-dtomato；图5b：p14注射raav-e2-gcamp6f；图5d和5e：成年小鼠注射raav-e2-c1v1-eyf)，或全身注射raav(图5c：成年小鼠注射raav-e2-psam4-5ht3-lc-gfp)。图5a的代表性图像显示
注射一周后，syp-dtomato报告基因和突触标记物syt2之间的共定位，以及对应的量化结果。图5b显示注射后2-3周进行晶须刺激(whisker stimulation)时ca2 的成像结果。右侧图为成功率，计算方式为回应晶须刺激而高于阈值的δf/f峰值的比例。图5c为注射4周后在脑切片中进行电流钳记录的结果。迹线显示了在基线和伐尼克兰(varenicline)的浴施加后在指定电流下的代表性细胞反应。图5d为注射1周后在脑切片中进行电流钳记录的结果。表达病毒报告基因的细胞在恒定激光刺激(550nm)下暴露2秒，同时记录电压超过3秒。激光刺激期间还记录了不表达病毒报告基因的相邻锥体细胞。图5e示例神经元活性的体内单一单元分析，并显示激光刺激后被病毒感染的神经元的光栅曲线图和相应的群量化数据。左侧各图显示快速尖峰细胞，右侧各图显示规则尖峰兴奋性细胞。值得注意的是，由于局部病毒注射的镶嵌性质，个体细胞反应是双峰的。这可能会反映特定细胞是否被感染。比例尺为5μm。“试验”与“时间”对比图表顶部位于中间位置的条代表激光刺激。图表中的圆点代表各个测量值，线代表平均 /-，即平均值标准偏差。
[0137]
图6a和6b为与包括人类在内的灵长类动物的病毒靶向和pv皮层中间神经元(pv cins)的操作相关的图式、图表、图像和记录迹线。图6a：向选自指定物种的动物局部注射(大鼠和猕猴)或全身性注射(狨猴)raav-e2-c1v1-eyfp(猕猴)或raav-e2-dtomato(大鼠和狨猴)，并在注射后2-8周进行分析。表达的特异性显示为共表达pv的病毒标记细胞的比例。图6b：通过手术切除获得的人脑组织暴露于raav-e2-dtomato(i-iii)或raav-e2-c1v1-eyfp(iv)，并持续培养7-14天。右上图显示经固有特性电生理记录评估的病毒标记细胞中快速尖峰神经元的比例。(iv)激光刺激后病毒标记细胞的电生理电流钳记录。比例尺为25μm。“直接光激活(pv)”迹线顶部的条代表激光刺激，箭头指向共表达pv和病毒报告基因的神经元。图表中的圆点代表各个测量值，线代表平均 /-，即平均值标准偏差。
[0138]
图7为成年小鼠矢状切面的荧光图像，该小鼠全身性注射有指定的病毒报告基因载体raav-e[x]-dtom，并在注射后三周对病毒报告基因进行ihc分析。比例尺为500μm。
[0139]
图8a-8d为向成年小鼠全身性注射raav-e2-dtomato后结果的图像和图表。图8a涉及病毒标记神经元固有特性的切片记录。左侧图为表达病毒报告基因的代表性细胞。中间和顶部的三角形迹线代表记录吸液管。量化值为指定的参数。“同一性”图表中颜色较暗的灰点代表具有常规快速尖峰(fs)特性的细胞。图8b显示阳性和阴性快速尖峰细胞(分别为fs和nfs)的代表性切片记录迹线。比例尺为20μm。图表中的圆点代表各个测量值，线代表平均 /-，即平均值标准偏差。图8c和8d显示向成年小鼠全身性注射raav-e2-dtomato，并在注射后三周进行分析的结果。图8c：采用ihc分析冠状和矢状切面的病毒报告基因和pv，大脑各区域均回报pv特异性。图8d：对指定器官的天然病毒表达进行分析。比例尺分别为100μm(图8c)和250μm(图8d)。图表中的圆点代表各个测量值，线代表平均 /-，即平均值标准偏差。
[0140]
图9a-9c为图像、记录迹线数据和图表。在体感皮层中向小鼠全身性注射raav-e2-gcamp6f(图9a：p14)和局部注射raav-e2-c1v1-eyfp(图9b)和raav-e2-gqdreadd(图9c)。图9a：注射后一周对小鼠进行分析。左侧图为中间图中井号显示的两个代表性尖峰的宽场图。右侧图为gcamp记录后拍摄的荧光图像。图9b：注射后一周进行切片电生理电流钳记录。用10hz或40hz的激光刺激(550nm)靶向表达病毒报告基因的细胞，同时记录电压超过3秒。图9c：在注射一周后进行切片电生理电流钳记录。在施加cno浴之前和之后记录电压。比例尺
为500μm。“ cno”条代表激光刺激。图表中的圆点代表各个测量值。
[0141]
图10a和10b中的染色图像和数据曲线图涉及获取自手术切除的人类脑组织暴露于aav-e2-dtomato并持续培养7-14天。图10a：在记录期间充满生物胞素的病毒标记细胞树突的代表性图像。图10b：病毒标记神经元固有特性的切片记录。量化值为指定的参数。“同一性”图表右上角颜色较深的圆点代表具有常规快速尖峰(fs)特性的细胞。比例尺为100μm。图表中的圆点代表各个测量值，线代表平均 /-，即平均值标准偏差。
[0142]
图11中的表格显示表达标记物/报告基因的细胞的量化值。如实施例7所述，使用最少两个独立的生物复制物进行量化，表格中针对每个单独的量化值指定了特定的细胞数量和条件。
[0143]
图12为收集自4只dlx6a
cre
::sun1-gfp小鼠的3500个神经元细胞核的umap曲线图，反映了指定的典型中间神经元标记物启动子可达性。
[0144]
图13a和13b为与具有区域特异性的病毒增强子的识别相关的切片、图像及图表。图13a：全身性注射指定的raav载体的成年小鼠，该载体包含增强子元件多核苷酸序列及可检测的报告基因或标记物(例如gfp)多核苷酸，即raav-e[x]-egfp，注射后3周对小鼠进行分析。s1皮层中报告基因和指定标记物的免疫组织化学(ihc)分析用于评估表达病毒报告基因的神经元细胞体的密度(左侧图)以及病毒报告基因针对指定标记物的表达特异性(右侧图)。就e29病毒而言，除丘脑网状核(trn)外，在丘脑中未观察到细胞体。图13b：在v1中向成年猕猴注射raav-e22-egfp，并在注射后8周采用ihc对报告基因和指定的标记物进行分析。比例尺为100μm(a)、50μm(b，左侧)、和10μm(b，右侧)。图表中的圆点代表各个测量值，线代表平均 /-，即平均值标准偏差。
[0145]
图14的图像和图表涉及向成年小鼠注射指定的改性raav-e2-dtomato构建体，并在注射后3周采用ihc对病毒报告基因和pv进行分析。对应的特异性显示在右侧的图表中。比例尺为2μm。图表中的圆点代表各个测量值，线代表平均 /-，即平均值标准偏差。
[0146]
图15a-1和15a-2中的表格包含所有受测增强子的规格，包括与它们相关联的基因、目标细胞群、针对目标细胞群的特异性、位置、atac峰的存在，以及人类序列的保守性。
[0147]
图16a-1和16a-2中的表格汇编了与每个受测增强子相关的各种参数，包括增强子名称(e1-e35)、基因、目标、特异性百分比、鼠染色体位置(mouse_mm10_chr)、鼠基因组中的增强子序列起始位点(mouse_mm10_start)、鼠基因组中的增强子序列终止位点(mouse_mm10_stop)、大小(碱基对(bp))，人类染色体位置(human_hg38_chr)、人类基因组中的增强子序列起始位点(human_hg38_start)、人类基因组中的增强子序列终止位点(human_hg38_stop)，以及小鼠和人类增强子序列之间的保守性百分比。图15a-1和15a-2，图16-a1和16-a2以及图1a1和1a3的表格中，根据增强子e1-e35中每一个的多核苷酸序列的碱基对(bp)总量可知，序列中排序第一的碱基对(bp)的数值为零(0)，这是本领域技术人员可以理解的。尽管如此，每个增强子(e1-e35)的多核苷酸序列的碱基对总量可在本文附图所示表格化数据的基础上，通过计算序列中碱基对的总量来简单地获取。
具体实施方式
[0148]
本文所示和所述的实施方案涉及开发用于识别多种新增强子(e1-e35)的策略、方法和产品，其与重组腺相关病毒(raav)载体等病毒性载体一起使用，以例如靶向功能各异
的神经元亚型，尤其是大脑皮层内的神经元亚型。针对疾病基因scn1a调控景观的研究确定了靶向该基因表达范围的增强子，包括(非限制性示例)对小清蛋白(pv)和血管活性肠肽(vip)皮层中间神经元具有选择性的两个增强子。这些调控元件的功能实用性已经得到了证实，研究发现pv特异性增强子允许跨物种(从老鼠到人类)选择性靶向和操作这些神经元。此外，本文所述的选择方法可推广到其他基因，并以某些pv特异性增强子为特征，例如，e11、e14、e22和e29，这些增强子对大脑的不同区域具有高度的特异性。含有增强子序列的病毒性载体，如raav载体，提供病毒工具用于细胞类型特定回路操作和治疗干预，以治疗和改善神经病变性或神经精神性疾病、病症和病理。
[0149]
本文描述了用于治疗或改善神经系统、神经发育、神经遗传或神经精神性疾病、病症和病理的基于病毒的特定治疗产品、组合物、方法和途径。如上所述，用于基因递送的病毒性载体或媒介物被设计和生产为包含特定增强子序列(增强子)和效应基因(如转基因和报告基因)等目标基因的多核苷酸序列。利用病毒性载体或媒介物转导中间神经元或神经元细胞后，该目标基因在特定中间神经元或神经元细胞群中特异性和功能性地表达。在一个实施方案中，提供了包括特定增强子序列(增强子)的多核苷酸的病毒性载体或媒介物，利用病毒性载体或媒介物转导中间神经元或神经元细胞后，该多核苷酸在特定中间神经元或神经元细胞群中特异性和功能性地表达。在一个实施方案中，病毒携带的增强子能够将转基因的表达限制到特定中间神经元细胞或神经元细胞。在一些实施方案中，转基因的表达被限于缺乏该基因的细胞中。在一个实施方案中，转基因的表达在中间神经元细胞或其他神经元细胞中遭特异性调节。在其他实施方案中，转基因是效应基因或治疗基因。在一些实施方案中，增强子元件将基因表达限制于一种或多种神经元细胞类型，包括表达小清蛋白(pv)的皮层中间神经元细胞(pv-cin细胞)，该皮层中间神经元细胞为快速尖峰形成皮层中间神经元；表达血管活性肠肽(vip)的去抑制皮层中间神经元细胞(vip cin细胞)；以及锥体(pyr)神经元，特别是大脑第5皮层的锥体神经元。
[0150]
在一个实施方案中，病毒性载体含有特定的增强子序列和与神经系统、神经发育或神经遗传疾病、病症或病状相关的转基因(效应基因)。该增强子能够将转基因的表达限制在中间神经元细胞群中，而该中间神经元细胞群丧失该基因的功能，缺乏该基因或表达于神经系统或神经遗传疾病、病症和病理相关的该基因的突变体、变异体或缺陷形式。在一个特定的实施方案中，插入到病毒性载体多核苷酸的增强子序列被发现具有调控scn1a基因表达的特异性，该基因编码nav1.1钠通道，并将表达限制到表达scn1a的细胞，尤其是gaba能中间神经元细胞。scn1a基因功能丧失是导致衰弱性疾病德拉韦综合征(ds)的普遍原因，ds是一种与认知障碍及早产死亡相关的耐药性小儿癫痫。在某些实施方案中，中间神经元中转基因(效应基因)的特异性表达可以通过检测中间神经元细胞的特异性标记物来确定，例如但不限于gaba gad67或pv中间神经元细胞标记物。在一个实施方案中，病毒性载体或媒介物为腺相关病毒(aav)或重组aav(raav)。术语“aav”和“raav”在本文中可互换使用。
[0151]
术语“转基因”在本文中指包含于如本文所述raav载体或媒介物中的单个或多个目标基因(效应基因)，该目标基因在如本文所述的某些细胞类型或细胞群中特异性表达并发挥功能，尤其是因为raav载体中也包含增强子序列，该序列将基因的表达限制到确定的细胞群，例如表达pv或表达scn1a的中间神经元或其亚型。在某些情况下，目标基因(效应基
因)是在raav转导的细胞类型中表达的基因的正常形式，其编码产物的功能是在细胞中提供正常或功能正常的产物，例如丧失了与转基因相同基因的功能的细胞。在一些情况下，转基因或效应基因可以是报告基因，例如绿色荧光蛋白(gfp)或红色荧光蛋白(rfp)，其在raav载体转导细胞后提供可检测的信号。在一些情况下，转基因或效应基因可以同时是报告基因和编码其表达和活性提供正常细胞功能的产物的基因。后一种基因可以视为治疗基因。在一个特定的实施方案中，raav包含scn1a特异性增强子序列和scn1a转基因。
[0152]
本文所述的raav载体和方法至少部分基于以下发现和证明：特定增强子可以将病毒性载体携带的转基因的表达限制在表达该基因且经编码的基因(转基因)产物功能正常的脑部中间神经元细胞(“中间神经元”)，该转基因是，例如，与神经系统疾病、病症或病理相关的基因或报告基因。在一个实施方案中，这种经表达的功能性基因抵消、替换或替代基因的异常、畸变或功能缺失，该基因编码参与中间神经元细胞正常运作的产物。
[0153]
在一个实施方案中，合适的病毒性载体，例如慢病毒载体或，特别是重组腺相关病毒(raav)载体，用于将转基因的表达限制在哺乳动物表达gaba能pv的中间神经元中，其中本文所述增强子元件以顺式提供。在一些实施例中，该增强子元件是s5e1(e1)、s5e2(e2)、s5e3(e3)、s5e4(e4)、s5e6(e6)、s5e7(e7)、s5e8(e8)、s5e9(e9)、s5e10(e10)之中的一个。在一些实施方案中，该增强子元件是能够将病毒报告基因的表达限制在表达小清蛋白(pv)的皮层中间神经元(pv cin)内的e2，对vip中间神经元具有选择性的e6；或e5，其标记跨所有皮层的中间神经元群，但对大脑第5皮层中的锥体神经元尤具选择性，特别是本文所述的谷氨酰胺能锥体神经元。在一个特定的实施方案中，该增强子元件是e2。在另一个特定的实施方案中，该增强子元件是e5。在又一个特定的实施例中，该增强子元件是e6。
[0154]
在一个实施方案中，包含增强子的病毒性载体或raav载体驱动scn1a副本在经转导的表达pv的中间神经元细胞中的表达，以治疗癫痫发作、各种形式的癫痫，或ds。在其他实施方案中，包含增强子的载体或raav载体驱动gq-dreadd或psam等效应子的表达，用于pv-中间神经元活性的化学遗传调节，从而治疗各种形式的癫痫发作、癫痫(包括局灶性和药理学顽固性癫痫)，以及ds及其症状。
[0155]
一般而言，病毒性载体或raav载体包括包含选自本文所述s5e1-s5e10的增强子序列的多核苷酸，以及转基因序列，例如编码scn1a基因的多核苷酸序列、编码hm3dq修饰的毒蕈碱受体(gq-dreadd受体)的多核苷酸序列，或编码psam的多核苷酸序列。在一个实施方案中，该多核苷酸包括选自本文所述e2、e5或e6的增强子序列。在某些实施方案中，提供了为有需要的个体(如人类患者)治疗或预防性治疗癫痫发作和癫痫，更具体地，德拉韦综合征的方法。
[0156]
在一个实施方案中，提供了一种方法，其中向有需要的个体或受试者，例如患有癫痫发作、癫痫或ds的患者施用病毒性载体，例如重组腺相关病毒(raav)载体，该病毒性载体包括如本文所述的增强子序列，例如e2、e5或e6，以及转基因多核苷酸序列，例如编码scn1a的多核苷酸序列、编码经hm3dq修饰的毒蕈碱受体(gq-dreadd)的多核苷酸序列，或编码psam的多核苷酸序列，从而令scn1a、gq-dreadd或psam分别在个体或受试者的中间神经元，尤其是表达pv的中间神经元中表达。因此，提供了一种方法，其将有需要的个人或受试者体内不表达scn1a、gq-dreadd或psam的中间神经元，特别是表达pv的中间神经元，转化为分别表达scn1a、gq-dreadd或psam的中间神经元。因此，基因和编码蛋白质的表达与本文所述增
强子元件(e1-e10)的存在相关，所述增强子元件也是raav载体基因组的组分。在一个实施方案中，增强子元件是e2、e5或e6。在一个实施方案中，给有需要的个体或受试者，例如患有癫痫发作、癫痫或ds的患者，施用病毒性载体，例如重组腺相关病毒(raav)载体，该病毒性载体包括本文所述的增强子序列，例如e2，和编码scn1a的转基因多核苷酸序列。
[0157]
在一个实施方案中，提供了预防和/或治疗癫痫发作、癫痫或ds的预防性或治疗性处置方法，其包括将病毒性载体或raav载体引入有需要的个体或受试者体内，所述病毒性载体或raav载体包含本文所述的增强子序列(e1-e10)，以及编码多核苷酸序列的序列，该多核苷酸序列编码scn1a，从而减轻个体或受试者经历的癫痫发作、癫痫或ds症状的严重程度，或治疗或预防癫痫发作、癫痫或ds症状。在一个实施例中，该增强子元件是e2、e5或e6。在一个实施方案中，该有需要的个体或受试者在施用前述载体时正在经历发作(如痫性发作)或ds症状。在向个体或受试者施用载体后，癫痫发作、癫痫或ds症状的严重程度降低，或者癫痫发作、癫痫或ds症状得到治疗或预防。
[0158]
在一个实施方案中，提供了一种预防和/或治疗癫痫发作、癫痫或ds的预防性或治疗性处置方法，其包括将病毒性载体或raav载体引入个体中，该病毒性载体或raav载体包含本文所述增强子序列(e1-e10)，以及编码多核苷酸序列的序列，该多核苷酸序列编码经hm3dq修饰的毒蕈碱受体(gq-dreadd)；随后向个体施用有效量的gq-dreadd激动剂，从而使癫痫发作、癫痫或ds症状的严重度减轻，或使癫痫发作、癫痫或ds症状得到治疗或预防。在一个实施例中，增强子元件是e2、e5或e6。在一个实施方案中，有需要的个体或受试者在施用gq-dreadd受体激动剂时正在经历发作(例如痫性发作)。施用激动剂后，癫痫发作的严重程度降低。在一些实施方案中，gq-dreadd受体激动剂是氯氮平-n4-氧化物(cno)或本领域已知和使用的另一种合适的gq-dreadd受体激动剂。
[0159]
在本文所述的治疗和预防方法的实施方案中，个体或受试者正在经历局部性癫痫发作或全身性癫痫发作或面临患病风险。在其他实施方案中，个体或受试者患有、疑似患有或已确诊患有任何形式的癫痫，包括但不限于药物抗性癫痫。利用本文所述方法可以抑制、阻止、减少、减轻或预防癫痫发作、癫痫或ds症状。
[0160]
在一个实施方案中，向有需要的受试者施用包含病毒性载体或raav载体的组合物。在一个实施方案中，施用包含载体的组合物(或载体本身)促进个体或受试者脑部不表达scn1a的中间神经元或表达pv的中间神经元转化为表达scn1a的中间神经元或表达pv的中间神经元，所述载体包含本文所述的增强子元件，例如e1-e10，和编码scn1a的多核苷酸。在另一个实施方案中，施用包含载体的组合物(或载体本身)促进个体或受试者脑部不表达gq-dreadd受体的中间神经元或表达pv的中间神经元转化为表达gq-dreadd受体的中间神经元或表达pv的中间神经元，所述载体包含本文所述的增强子元件，例如e1-e10，和编码gq-dreadd受体的多核苷酸，从而产生对gq-dreadd激动剂有反应的中间神经元或表达pv的中间神经元。在另一个实施方案中，施用包含载体的组合物(或载体本身)促进个体或受试者脑部不表达psam的中间神经元或表达pv的中间神经元转化为表达psam的中间神经元或表达pv的中间神经元，所述载体包含本文所述的增强子元件，例如e1-e10，和编码psam的多核苷酸。在一个实施方案中，本文所述的载体、组合物和方法用于局部和/或全身性癫痫发作的预防性或治疗性处置。在一个实施方案中，该增强子元件是e2、e5或e6。
[0161]
在一个实施方案中，本文所述的载体、组合物和方法用于预防性或治疗性处置各
种形式的癫痫，包括但不限于耐药性癫痫，和/或可以替代药物治疗。在一些实施方案中，本文所述的载体、组合物和方法用于预防性或治疗性处置一种或多种癫痫发作病症，包括但不限于癫痫症，包括局灶性癫痫症、全身性癫痫症、全身和/或局部发作的癫痫症等；与lennox-gastaut综合征相关的癫痫发作，作为疾病或病状并发症的癫痫发作，例如与脑病(encephalopathy)、苯丙酮尿症(phenylketonuria)、青少年戈谢病(juvenile gaucher's disease)、unvericht-lundborg进行性肌阵挛性癫痫(unvericht-lundborg's progressive myoclonic epilepsy)相关的癫痫发作，中风、头部外伤、压力、激素变化、药物使用或戒断、酒精使用或戒断、睡眠剥夺、发烧、感染、脑癌等，或化学诱发的癫痫发作病症。
[0162]
在一些实施方案中，如本文所述的载体或raav载体、组合物和方法用于预防性或治疗性处置有需要的个体或受试者，例如，经历过癫痫发作和/或面临癫痫发作风险，从而有可能被诊断出或被怀疑患有癫痫发作病症的个体或受试者。在一个实施方案中，可以在发作，例如痫性发作或ds症状发作前，例如数天、数周、数月或数年前，施用包括本文所述增强子元件和转基因的病毒性载体或raav载体。举例而言，本领域技术人员已经证明，raav驱动的表达可以在非人灵长类动物模型中持续至少六年(rivera,v.m.等，2005，blood，105:1424-1430)。
[0163]
在一个实施方案中，包含scn1a特异性增强子序列的raav载体还包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白增强病毒性载体的靶向能力并允许载体特异性转导中间神经元细胞，例如gaba能中间神经元细胞，和/或gaba能中间神经元细胞的特定亚群，特别是位于大脑皮层的中间神经元细胞。转导gaba能中间神经元的raav载体和包含衣壳蛋白的raav载体非常适合用于本文所述的组合物和方法。该衣壳蛋白增加了病毒特异性转导gaba能中间神经元的可能性，特别是也表达小清蛋白(pv)的gaba能中间神经元亚群，其被称为表达pv的中间神经元(也称为表达pv的皮层中间神经元)。在另一个实施方案中，包含scn1a特异性增强子序列(例如e5)的raav载体还包含衣壳蛋白，该衣壳蛋白增强病毒性载体的靶向能力并允许载体特异性转导锥体神经元，例如大脑皮层的谷氨酰胺能锥体神经元细胞。
[0164]
在一个实施方案中，插入到病毒性载体的转基因(效应基因)是一种其功能(或功能丧失)已经被发现与以小儿热性惊厥或德拉韦综合征(ds)等癫痫发作或癫痫症的危害性症状为特征的神经系统疾病具有因果关系的基因。载体中的增强子序列将转基因的表达限制在中间神经元或其亚型，或锥体神经元等神经元，并且特异性地调节，例如增加或增强该基因在中间神经元细胞中的正常功能性版本的表达。在一个实施方案中，该中间神经元细胞是gaba能中间神经元细胞。在一个实施方案中，该中间神经元gaba能细胞是表达pv的中间神经元细胞。在一个实施方案中，该神经元细胞是锥体神经元细胞。在一个实施方案中，该锥体神经元细胞是谷氨酰胺能锥体神经元。
[0165]
在一个特定的实施方案中，本文提供的aav载体、基于载体的组合物，以及递送和治疗方法可用于治疗患有德拉韦综合征(ds)及其严重症状，例如癫痫症和伴随的癫痫发作的患者。在一个实施方案中，该患者是人类患者，尤其是患有ds的婴幼儿。如下文进一步所述，德拉韦综合征(ds)是小儿癫痫症的一种形式，其与许多严重症状相关，包括认知障碍和危及生命的癫痫发作。scn1a基因编码的钠通道nav1.1的功能丧失是ds最常见的原因。使用ds小鼠模型的先前研究表明，gaba能中间神经元中scn1a基因功能的丧失是代表ds综合征
最具危害性的症状的癫痫发作背后的主要原因。目前没有可靠的治疗方法来消除或减少ds患者的癫痫发作。因此，本文所述的病毒产品、组合物和方法为患有ds的患者提供了亟需且非常有益的治疗。
[0166]
因此，在一个特定的实施方案中，包含在aav载体或媒介物中的转基因或效应基因是scn1a，增强子则是将scn1a基因的表达限制在表达scn1a的中间神经元的核酸序列(例如，aav载体中的顺式作用控制元件)，并且该增强子特异性调节scn1a基因在中间神经元细胞中的表达，例如gaba能中间神经元，或表达pv的gaba能中间神经元。在另一个特定的实施方案中，包含在aav载体或媒介物中的转基因或效应基因是scn1a，增强子则是将scn1a基因的表达限制在表达scn1a的锥体神经元的核酸序列(例如，aav载体中的顺式作用控制元件)，并且该增强子特异性调节scn1a基因在锥体神经元细胞中的表达，例如位于大脑皮层(如大脑第五皮层)的谷氨酰胺能锥体神经元。
[0167]
aav载体经设计和分子工程化以包含特定增强子，该增强子将编码nav1.1钠通道的正常scn1a效应基因的表达限制在中间神经元细胞内。利用该aav载体的方法涉及给受试者(例如，患有ds的人类婴幼儿)施用治疗有效量的病毒性载体、病毒颗粒或包括该病毒性载体或颗粒的药物组合物，特别地，使用包含scn1a特定增强子序列和scn1a基因的载体转导受试者的中间神经元细胞，在该些中间神经元细胞中表达前述基因并提供功能性反应，例如，在施用后在受试者的中间神经元细胞中提供功能性nav1.1钠通道或增强该钠通道的功能。scn1a在转导的中间神经元细胞中的功能性表达使scn1a缺陷的中间神经元细胞群的兴奋性正常化，例如gaba能中间神经元和表达pv的gaba能中间神经元。这样的结果恢复了大脑区域中兴奋/抑制的微妙平衡。
[0168]
为了成功且特异性地表达aav中包含的基因作为ds的一种治疗形式，发展出了一种方法，其中探索了scn1a基因的调控景观，以识别能够将表达特异性地限制到缺乏该效应基因的神经元细胞群的增强子多核苷酸序列((图3a-3d))。在一个实施方案中，该增强子序列是顺式作用元件，其调节，例如，增加、增强、增大或以其他方式改善scn1a基因的表达，特别是在中间神经元细胞中，例如gaba能中间神经元细胞或表达pv的gaba能中间神经元细胞，特别是在scn1a基因功能丧失的中间神经元中。在一个实施方案中，该增强子序列是顺式作用元件，其调节，例如，增加、增强、增大或以其他方式改善scn1a基因的表达，特别是在锥体神经元，例如谷氨酰胺能锥体神经元细胞中。术语“增强子”和“增强子元件”在本文中可互换使用。在本文的一些情况下，术语“增强子元件”被称为“调控元件”。
[0169]
在一个实施方案中，特异性调控scn1a基因在中间神经元细胞中表达的增强子多核苷酸序列长约25-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050或2500个核苷酸(碱基对(bp))，或更长，例如长度大于2500个核苷酸(bp)，包括上述bp长度之间所有较大和较小的值。在一些实施方案中，适合使用的pv特异性增强子序列是261bp、521bp、547bp、606bp、618bp、663bp、832bp、1280bp、1644bp或2430bp。在其他实施方案中，适合使用的pv特异性增强子序列是267bp、586bp、636bp、665bp、844bp、849bp、894bp、1636bp、1766bp或5124bp。对调节(例如，增强)中间神经元细胞中scn1a基因表达具有特异性的增强子序列可以源自dna或rna等
基因组多核苷酸的基因内或基因间序列((图1a-1至1a-3))。
[0170]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长、或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下列小鼠多核苷酸(dna)序列(e1)或其人类直系同源物具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高、或至少95％或更高的序列同一性。该小鼠多核苷酸序列又称“s5e1”，位于2号染色体上，起始/终止位置为66256056/66257335，如图61a-1所示。
[0171]
caaagtggacagaggggaggggaggggatgcgaggggaggggaggggaatgatcgcgaaaggcttccaaaccttgtccttgtttttcaccatttctgaaatatatgctgagtgcaactatgggaagaccattttcataatctataatactcctccttttaaaggactttcgttaaccgcttgcaaaggtgagtgccgggtagaggacattagctcgctaagtccctagaaatcacacttggagactaagcaggctttcccaggagaagtccaaagccaacataagcaggaggctgggggctggccgttaaccgcaaggcagtggttgagccctcgggatcatcccggcggggggcgcagcatctccgccaaggccgcaggctctcaccatcagctgcccgagccaccctgtacctcgcagtccactcgccctgcccacgccccgcgccgcccgctcaccttcagcccctgggagtccatggccgccggctacccggagggtgcccaccgctgcccgccgcagggttaggggttcagacccacttcccgggccctcaaaccctaagggacgcggcgtgcagcacgaggggcgtggcccgatctccattggttgtcggcgtgagggggcggagcttagttgtaggactaggaaggagggggccaccggagcaggcgaggagggaaccccgagggaggaccgcgagggcgactggggctggaatccgctgagcattgagtgctgccgagttgtggggctagaggagggaggtccagcctggaaacggcgcgaggaggagggattgggtggagcaagagatatgagattaaagaataaagatgatgaagcagcaaataggagggagagccatgccgcttttcatccctgcaaacaaaggccgactccattttctcagcattttttgtggaagccgatttgcgcaatgcggcttagtacttgaccagggaaaatgatttacctgacacgtgtagtaatcgtgtctgggccacaaggtggcgcagaaaaatcacagttcggcaaaaaccttgaagcctggcttgggcttgttctaaatcttttcaggcgctgctgtaattttgctattcgagtgcttattaaactgctccgccagatttccacccccaaagtcttatttaaaaatatgtggttacctcttttagatttctatttcttaagtgtttgctgtagtttggatctaaactgtccctcaaagacacacgtgctgaatgttccccagcccgtgtgctgttgggagtggtgga(seq id no:5)。
[0172]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长、或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下列小鼠核苷酸(dna)序列(e2)或其人类直系同源物具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该小鼠多核苷酸序列又称“s5e2”，位于2号染色体上，起始/终止位置为66364036/66364653，如图1a-1所示。
[0173]
aatctaacatggctgctatagcttactgactagaagttaagtgcacacttcctaaaagaaggctttgacacaagccacttcagttccctcctcattttcttgtccccattcctctctctgtagaattctgagatttcaattcagttttatacagaaaccacattactgtaagccctacaaagttatggcaatatagctatatggagtcaagtaatgtaggttatttttttcccaatggtgctggtgaaggtggcaattatgtagctatacttagcagactgaggaaattctgctagagtcagcatttgtctcttcattgctatgaaacagtaatggaaaaataaacaaaaacaaaaggcaaacactatgcataattccctcagatcatattaacatgtgatgttggagtaaattgttataaccccattttggaaatacttaccttaattaactatgatttccttaaaataatgcagtatttacaatctatatgaaagcactatatgggacacatggtatgatggaacagtgcacccaagagacaccaagaacattcctgtctgtggcagtcttttctctatacagaggcatttagtctca
attgctcagagttatttt(seq id no:6)。
[0174]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下列小鼠多核苷酸(dna)序列(e3)或其人类直系同源物具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该小鼠多核苷酸序列也称“s5e3”，位于2号染色体上，起始/终止位置为66383190/66384021，如图1a-1所示。
[0175]
ataaaattttattttcctaaaatttacatttaaaagccatccaacttaccaaagtgatttcaaaccacaattacattttatctcaactaccagcattttatttagccaggatctacatgagacacatatcatgatgtgctatgtacatcttgttatacagtgttatattgataacaaatgtcatcaatataacattgaattaatcttccataatttatggggaaaaaaggagcagccttactgaagggcaaagttatacaacagctttacagaagctgcatgcgagtgcagtaccgggacacgggcacggacggcggcactataaccattttccgtggtggtaatcttgctttcatctgacacagaaaagagaccgccgttttgaaaactcacagaactagcctcacggttttgtgagtccattgagcgctggctgcgaagaacggtgtttaactcgagaaatcattgaacaagttttagaaaataaagatgcttatgacaatttcaaacttgaaggtctccaaagaaggactgagatattggtgagaggagtaaagagaatcctggtgcatttatttcatgcttccttctgttcgaagatcattttgaggtttataaaaggtggggtgatccaaaaatctccaggctgagagtcctggctgaggctgtgaactgggctgcagagaaagggccacgcctccctcctctgctcgcattactcagcagcttttctgcatgtggctggctgcagacaatctaaacccttccgctgtcgctccccccttatactgttctgccaaaaggaaggcagagaggaaatcagctacggggc(seq id no:7)。
[0176]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下列小鼠多核苷酸(dna)序列(e4)或其人类同源物具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该小鼠多核苷酸序列也称“s5e4”，位于2号染色体上，起始/终止位置为66387764/66388024，如图1a-1所示。
[0177]
tctgacagagcaagtcttgacctgcttaacattatgttatgctagtcattttaaaatgagtctttatttcccatagaaggtcagtttttttacattattatataatcttttgacagaataacaaataacattctgaatgtctcatttctaaatacaaaacatcttagtataaaattatgcattgttttaaatgcttggaagtaggtccacatgtagaaaacaaagtacgtatgataaaaaatatcaaaattgtatattcag(seq id no:8)。
[0178]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下列小鼠多核苷酸(dna)序列(e5)或其人类直系同源物具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该小鼠多核苷酸序列也称“s5e5”，位于2号染色体上，起始/终止位置为66392447/66393109，如图1a-1所示。
[0179]
aatgttttgatatttaggagaaaattgcaaaacaaaatgatgacagtgtttgaaagtgtttgatcagtgccaagcatcactttatgtacttggcaaacatgacttgaggccttaagctgtgatttgcaaatgtagattggaatcaagatctttatagatgaggaagcaaaaatcagaagacaaaataacattatcaacttgatctcatgtgcagccagggctgaactgcaaatgctgatttgccccagtctgggctcctcaaatcgttccttggaatcctattagttggaacttta
tctctgctcgtggcagggtgcctgggaccatgtttataaatatctgctgaatgaagaataagtgagtcaatcgaaccagaactcactttggttagttaatttcattcgtggtatttatggagagcagaagaaagaattccagagacacgatttgtcaaaactctctaaagaaaatgatgacactatatattgatgaaaatgaatgttcttgttcttgctttatttgattttcttgtccccccactccccatctgctagggtctcattacagcatagttcttgaatatcccaggttgacctgaagttacaatatattcttgatttagatggcagacattgggaatattttgactcttaaaatttaata(seq id no:9)。
[0180]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下列小鼠多核苷酸(dna)序列(e6)或其人类直系同源物具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该小鼠多核苷酸序列也称“s5e6”，位于2号染色体上，起始/终止位置为66401767/66402372，如图1a-1所示。
[0181]
ttgtcactttgttactctacagtgttgcctggagttcgatacttcattactctatagtggggtgaagaagttcaccttcttattttcatttccttccctcaatgatttcttcagagctagctcttaccagctagaaattcttcaaacgacactcgtgccttccttcacacaggttgaactatttgtctctaatgccctaaagtactggtgttcaatcttccaggcacttccaatgatctgaaatctgacctgcttaggtcagctggctctgagattatggtattctagtcctcaaaccaacctgttggctcgttggttttgtaccaaacacactgacttacatagctcaaaataccactggccttttaaaaatggcatatcacattccaggggaggatcaaaactgctggctggtgatatttgtcaagtctctcaaagttgcactttccaggattttcaattcactgaattcttagacagacatgtttatgtgaaagaattctttatatattttttctcctctttgagtgggcaaatgaaaatcttgacctctgggttccttattttatttgactctctgtagtatttaaatcttaaaattttcct(seq id no:10)。
[0182]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下列小鼠多核苷酸(dna)序列(e7)或其人类直系同源物具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该小鼠多核苷酸序列也称“s5e7”，位于2号染色体上，起始/终止位置为66407834/66410263，如图1a-1所示。
[0183]
gatactgtataattaattaggcctccaatcatgccttcccagcctccacggatggagaaaccctctccgccatgccttaaagaggaattgctgtaataaatgagtctcctgatagcaaatttctcagcaagggggaatcgcgtaaatggagacatagtattgacagcaaagtccaatgtgttatttttaccagaacgaactctccggttcaagcctttgaaagagacatttgaaaaccaaaaacaaacaatgtaatggagcgaggaaaaaagccacagaagtgagtggcagggagtttaaaagagcagatgccactgccaggtctatgggacataaccagccacttgtgctgggtcttggcagtttataatgctacctcatcttctccgcgaaattgttttcccgtaaatctctgtggccatccattcctgtctacacattatgttcctaaaatagacaccatctaaaaatcacttcaaggagctttgtggaggaaggcctaaattgcaacactcctccagcgaagatagatgcagtgtttgatggcattaccagtcggtagccaggaaggggagtttgtgaggagtttttccaccacagttaatctgtttctggaaggaaagggaagtgtcagacttcccgaggaggcaaacgtgtgtggaagctctcatttgcatcacccccggcctgtcaggtattgcagcaaaagggagaggtgagctaccctggctctccttgggcaggagggacagaatcaggaagcatcaacctcagcatggaattttcctattcctgtttggcatcctcctcttgggatgatttacagcgcgggttggagaaacacgctctgccactccactagcgcaccagatagacagtgcagacctgcagatccatacccgaggagaagccacatttcctacgtgtgatagcaacagcgtttggcaatttgcgactttgctactgcagcttagaaaata
tttagtcacatgcacatctgaacagaaagacacccaggcttgactcagtcatttccgtcagacacacgaaagaaaaagcgtctctgctcacaagcttatttggactgctttgttgaaaggaggggcggcagacactttgtagatgtggcaagagggctttatatccagacctcaaacaggtaggagagaaggaagccaggagaggtaaggaaggggcgtggaaaagcctcacagccacctcgaagaaaacagtttttttgccctgttcagaaagcaagaggttccacagtggttttgtgtcaatggagcacatctgcagtatcattgccgttggtgacctctgtctaattaaaagtaagtcagtccttcccacccggcattgtctgaaacccgggactctttatcactttgctaaagttcatttgcaagtgtagttaaggaagagtcaggggggaaacagcatctgtcccttctggtcctggggaggaggcactcctttccaagagtcaagcctctgcccaaagaagctgcctcccctgcaatgctaggatccaggagcagccccgctgccttcttgcttcctctgtgaggtctaatttttgcatcatctttaggagcgatatgacctctattcacagccatcgaatccagttccaaagcaccaatgacagagggggcttcaagacaagaccttgcctaggaggatgcaggcaagcaaaggcaagagctggcccgatgccaagttattttaggccaaagaatctcatccttctatcaaaatgctgaactgcaaaacgaacctgatttcagttcatggaaggttgagaggaggaggagggggaggggaggaggaggaagagaggaggaggggaggaggagggaggaggaggaggggaggaggagggggacagttggtccgaattcacatgcaaaaatagacttcctgttctgccccaactcttatttccgtgggctcttctccccaaggatttaccaggtaagaattcaccaccaaagaagatcacaatgagataatcagatggcttacctgataaaaaggaaaattatccatctgcagtgaggagcaacatctccccacgacgagtccgcaccttccgttgcaacgattcagattccttcttgcaaaaggtgaccaagtgcttcacaagggctgcagcctcataggggcagaacacacgtacacaaacacacgcacacacacacacacatgcaccagagacctctgcagtatcctctcggcttcatcctcgcctcactctatggtacctaatacaaatcagcaaatagcttgttttaaaaaaaaaagaaagaaaaaaaagcggagacagcacctaacgttacagtgccatctagtggctacatcgtaaataggttctcacagcctggatttctgtgttctttctcaaccgcttccttctggttccttttt(seq id no:11)。
[0184]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下列小鼠多核苷酸(dna)序列(e8)或其人类直系同源物具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该小鼠多核苷酸序列也称“s5e8”，位于2号染色体上，起始/终止位置为66439814/66441457，如图1a-1所示。
[0185]
attgatctccaactttttaaatccctctgtcattttaaatgaggtgcactcggttgtgtcatcatctcggttttaattgtgtgaaaatttcctgccaatctcacaccgctgcggcaacctcaccttgctacttgccctgcaagttctgcagtgtgccgttctgagtatgccgttttaactagttcttgcagcaggacacaaagcgagatagtctgatagaaccagttctcctctggttttacctttactcttagatgagttaagggtcacatcaaaccagggctcagcccgccagatctcctaagcacagcccctcctgacccaatgcagttaacccaacctcattcagcgctagtatcaaatgacactggagctgctgcagtatgcatcccgagactaagtaggcaggatttattatcagcagaagtcccctaactaccaggttattcaagctccgttcttgtcacaaacaggcgcggcggaagacacagtgcagcagactcagagctcatttacaagacaagcgaattctcagttagagacaagggcagcgcggcagcgaactgcagtaaatcttttcacgctcacagcaacatctaacaatgctctcctgcaacgcctcagatcaaacgaatcctacttggtttaaacatcaaatcaacaccataaaaaaggcttcattagcaaagttcaatttaggatgtttttaatcgtgtcttaattctagaaccagtgcgagactttccatgcttattcaagcatgctgacagaattggaacctcttagaattgcctacctgcacctatcagcctggctgacaggagcccgccaaaggattaaaaaaaaacaaaacccaaaacataaaatcatgcaaaaaaatatttacccccgaaagatgtatgtagttaaagctcagcttcctgcagcctcgatagcccctgaagtgttaatctgaagaaacagttccatgagtttccaca
ggccggtagtgagtctcctacacttgacctagacagacttacataatgaagcatcagtgctggggagcttgcacgatgtcatcaccagcaagagtaagaagtattggcagcagcaagcaggcgggcaggctgagatcttgcatggaaatcatgaaccaggtcttgcttttcgtttttgaaacgttttggaaggagagttatgaatagcccagaaataggtctcattttgtgggtaggaagaatgaccagaagcatgaaagctaaatctcctggcaagtgcaggggacctctcttggagtgtgcagtaaacccgaggggacgacttctcctgctgtcaactcctgaaccatcacatctggagtgaaggaaggggctggtgaagccttgtaataaatgcaaaggatgctgctgagagctttggtctgcctttaactcattgtggtgagtagaggggatgtggcagtatgcaatgagagttggttgtgtaggttgctttgcagagtaataaccaaaaaaaaaaaaatctgtgaagtgctcaatactttagacacattttaataaacaagatgatagtaaaattactcttctccatcaaattgagactgtgctgggttaaactgttttaatgcattttaactcctgatgttcatccaagtaataagag(seq id no:12)。
[0186]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下列小鼠多核苷酸(dna)序列(e9)或其人类直系同源物具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该小鼠多核苷酸序列也称“s5e9”，位于2号染色体上，起始/终止位置为66441748/66442268，如图1a-1所示。
[0187]
atctcaagtgtatgtaacatgagctacagtcttaaaacctacaaacagtacatccagtctcctaccatgattctgagtgtgatgatttcatatgagcacaagatgacatcatactatttagttatatgtaaaatcatggtcttacatgggttgtggacaaaaccatctagttttggaggtgacagaaatagagaggacgccatgcactacttaaaaataatcgcagccttcttttcttagctagggagtttgctgctatgagccacattaagaccagggtgaggagatgagacgatacaggggcatgaaagaacacggtgatctactttctcctgttaattaacgagtaaggaaatagacattaaaagaagttaaatgtgtctgagccaacgtaggtgaggtttcccccaaattcacctggtagttttgctactgcagtatagtaaatacttgttttcatttgtttttttttttttgttttttttgtttttttgtttttttgtctttttgttttttttttt(seq id no:13)。
[0188]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下列小鼠多核苷酸(dna)序列(e10)或其人类直系同源物具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该小鼠多核苷酸序列也称“s5e10”，位于2号染色体上，起始/终止位置为66450594/66451140，如图1a-1所示。
[0189]
tattgcaaaaggaaggaatgagacagtttatgcagagctaagggtttgtgcgttattatgattaatcacaaggacagctgccaagcttccatcatgacaatattctctgggagaattcatcaggttctactgtctattaatttctgttgatgtatcttatctggcatcttcaatgacagaggacacttgttagtttttttttttaagtgaaggttaaaagacaaagttcattaaagaaatgatttatatatgacatttaagaactagcaatgtcattgcttcaagaaaattatgagaatttagtcttggtaggagtttacaccatgtccttgaagtgtctaattatgtgacttgatagttttacttagtacatatcgattaggctgtatctattatttatcaagaaattatggaaggaggcaatgtggcataggcatacacattctgattttaaaataatcctgcttttaccattaactccttctcagataattctgaatacatatcttgtctatgaatctgtgtaatcatggaaaaagaaaaaatc(seq id no:14)。
[0190]
在本发明的一个方面，根据小鼠序列与scn1a人类基因组序列的比对，包括上游和下游100kb，确定用于上述10个鼠类增强子序列的人类序列(人类直系同源物序列)。因此，
确定了小鼠和人类序列之间高度保守的人类直系同源物序列。
[0191]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e1或s5e1，位于人类基因组序列human_hg38 start 165953030/human_hg38 stop165954796(图1a-2和1a-3)：
[0192]
tctaatggacatacagtaacccttcataaatatttgctgaacgagtgattcagtgaacaaatgaatagagaagaccaacatccgaaaagttattttattttcaagcctcatgtctttaactgttttatatcagcctttcttaagttgaccgtcattaatatttgctgaatgaatgagtcagtgataaacagagaagaccatcaccctaaaataacgacccctccacttttaagtcttacgtctttaatgggtttcatataatctttctgcgctctttttactgtccagtgtgggagctgacactagtttgccttaagtccttaaaaatcgcacccggaggcgcagtgtcataggtaacccaagctttcctagtaaacatgatacaaaagtaaacacaaccaacagcatggggaccagcaattcagaaacaccgagcgggcgggctgcccagacctgggcttccccagcagggcccgcggagaccggccgtgagcagaggctgcaggcccaccccgcaacccgagcagccggggcaccgcagggaaacagcggcctagcgaagccacccgagctccctccgcgcccccgggccaaaaggccgcaaaggaactccgcccgcccgcccgctcacccgctcacccgctcacccgctcaccttcaattcctgcgagtccatggctgccccgaggccgggccgcggggctctggggattgtctcgccgcagcctaaaggaagacgcagaattcagctcccctagcctcccggagcgctctagcgccccgggccccagcgggaggggcggggtcgcgccgcgattggctgtcggagggagaggcgggcctgtgtggcggggatcgtgctgtaatggagcaggggcggcggggacccggaggtgagggctgcgagggccgcccgggagggtccgggctgggaaaagggcctccgccggagagtgcagctggaaaaggaggtcacactgggaaacggctgtctgaggacagtgggtgggcgggccgaggaaatggaattcaggaataaaggaaacggagtatgaagaaggggaagtctgtttcctgtcactggttgtaaaggaagacaccattttctgcacgtttgtctggaggcggattcccgcagtgcggctctcagcaaggctctgccggcgcgggaaaaagcggtcaactttcacgtgggcaagttgttttacggccacaaggtggcgcagaaaaaaaaaatcacacgttcttaacagaaatacggtgcgcttgggcccgtctttgcaggcgttgctgcaatctttgttagaatgtgtgttcaattagcccttttttaccagccccgataataagagggacaaataaattaaacttccagaaaattagtgtcttgttttcaatgatactactgattttaaactgagaataaaatgaatcccaatgcaaatttttatgtttgcaccccattaggcaactcaatcagtcacacatagatttcttaagtccaggaaattaaatggaaatataatagactaagattttctatttctgcttaaataaatatttaaaatagtgcataaggtctgagatttaagtgatctttgcagaatctttcacgtggattccaaattttgatcctagtgttaattatcttactttagttgacatgatacgtagttgccttttccagattttaagtttcttaaggagtttataaacattgactttttccccatgccaataggttatgtaaggacagtctt(seq id no:15)。
[0193]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e2或s5e2，位于人类基因组序列human_hg38 start 166084035/human_hg38 stop166084884(图1a-2和1a-3)：
[0194]
agtgtgggcctcccagggctgtttagctagcaatgagagaggcactgcctatatccaagttgtatatggcaggttttgcacaaagtggattactcgaagagaaagcctaatggccagtctattcatcttcccctttctcgatgt
tcatcttttctctcccagctctcctttattctcaattttctttttttttttttttttgctcagcctccatctcacttccgttgctgtcctctccccaccccttcccactctggactgtgcctctcctttgtagacacttcaagtccattctatttcattcaaaaaccatggtctagaagtaacttaatgtaaacccacaaagatggagacagaatgaatgccattcttcttgctgctctctcagacaatgcaggtcatttttgcctatggtgctggtaaagccaggagttatgtagctataagtagcagccagaggaaatagtgcctgagtcagcaattgtctttttattgctgtggggcaataatgggagaaaaaatcaggcttggtacaattccctttgaaggaaaaagatgccaacactagcattttaacacaaaatgctggttgggggttgggaggaaggatgcttacattccttctttggaaatatctactttgataaccattttggtaaaataatgcagtgttttcagtgtgcaaatcctttcaggactcatggttgtatggcagacgcacctgacagcaataatttaagggtaccctgagaatgactctgtggtctaaaaagaatgtgtgtttggaagtctgaggtaagaaatctggctggaagtggccaacctggaaatttgctccttattattaagg(seq id no:16)。
[0195]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e3或s5e3，位于人类基因组序列human_hg38 start 166090876/human_hg38 stop166091720(图1a-2和1a-3)：
[0196]
atagtgcaaagtttaaatttcattttcctaagatttgttttaaaataacacgatttacccaagtgatttcaaaccacaattacattctgtttaaattactaatattttattgcatcacaatctgcatgaaacagatgtcaggatataatgaactaacctgcattgtatttttatttttgtctcctgtggcataacgatttcataggaaagagaactacacagctgactgactgatggggaaagttacacaatggatagctttgcagcaacatactaatgcggtagggagatgctgcagagaggctagaaataaaatcatttctttccggagcagcactgcttgctgtcggctgagacaaaaaagagatttcctttttttcctttcttttttttgaaaactcacataacattaattctgttaagcactggatacacggaaaggtgtttaccttagaaaatcatttagcaatttttagaaactagacatatagcaattttaaatctttttaactatctaatgaccaaagcagagggtcctcacaagagggatttagatgctactgaattgaataaagaaaatatggatacatttattgtatgccttattcagtttgaggttcattttgagtttagaaatagggatataaaaacatcaggggttaaatagcatgggtaaaggacatgaaccaagctgcagagaagaggctgactgcctgctatatttgcaggcattactcagcacttttcttaaaccgatacatcttgctggctgcataagcaagacaagacccttttccctatggctcaggaaggcagagaagtcaacttcagccttgaaaaaggca(seq id no:17)。
[0197]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e4或s5e4，位于人类基因组序列human_hg38 start 166094366/human_hg38 stop 166094633(图1a-2和1a-3)：
[0198]
tgccagacagaacaagttttagtgtagttgatagtaagttgtgcccagaatattaaattgagtcaaatttattttccacataaagtcacagttttatatgtcattatataatctcttggcagaaataaggaataacattctgaatgttgcactccaaaattcaaagaatcttagtataaaaatatctagcattttagatgtttcaaagtagggccaaatgcagaaaataagttggatatgataaaaataccagaaagttctattcagt(seq id no:18)。
[0199]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多
165892760/human_hg38 stop 165897884(图1a-2和1a-3)：
[0204]
tggcaaaaacgcaaaacgttgatggataacggtgatgacttacacaacaatgcgaatgcatttaatgccactgaacagtacacttaaaaatggttaagatgatgaattttgtgttatatatgtttcaccacaatacaaaatattctttaaaaaagacttttggaaatactgtatctacttaattacaggatgtcaaactaatacaggctgatagtatcatttgtccccttgacacacaatcttgggtccagagattttgttcaccacaccttttagcatcactaaaaagggcacaataagaatatggtttcagaaaaagacaattcaaatattggtcttgtcctttagctatgtgaattcaatcaaattactcaaattctttgagtccaatatacttattttcttaaaataggattataatattgactgtaggagtgctacagaaataaaggcatgaaaaatatttataaattacaaatgttattaataatatttatacttccaaaaatgttgacaagaaatagagtaactaccccataataaagccacagcatctggaagctatattggattaagcaagaactaaaggttaaaatttcggattaaattttttttgcatgatactgctagtattatcaacattgggaaggcaatttcttgaatatttcttatatactattgaaatgtattcattattagttcaagttataattaccagtgacagattaaattacattcacttgtctttggttaaccatgacatttgacagaaggcaaatttctgcacttaagaaatgtattaaaaactaaaatgtatattaccttctaaaaaacttagctggtccatctttattgatgaatagtaggaagatatcaaaatagttatagggtgatgagatgtggcaagcatgcagtgctatggtatggtattacaaagcacaggattcttaactttgcctggaggagttgggaaatttcacataggagttgacctttgagcagcctcaaggataggaggaagatcttactagacggacaaaggcattccaagtagcagaaggcatgcgccaagagggaagcagagaacagtgtggggagtgttggtaactttgatattattaaagcggaggaagaaggataagaaatataaatggccaaataatttgcggccatattattattaaaataatgctatgattttagactttatcctgaagcactaacttaaattttaagcaaagggtaggttttgatttttagaactgatatgctagtcctatgatgacctggagcagccagaacctagaagctggaagatgagttgggaatctgcactagttcagatgagaggtgataagggtcttcattagagcagtgggttaggatacgacagactggatgtgttagctagctatcaagcaaacagagctgaggagacatgttaaccaattagtatgaaggaaggggaaagctcaaggcgatctggagattctgagagagaaaaggggcaatctgtcgtgagagcagtaattagatctagaagaggaatttttcaactacttaaattaggtcaaatttgtatggtacatttctgaaataagctaaaatagagccttaatctaaagtacaagatgagttactgaggataaccaataatgtacacataaaatgaacggagatgcatgttttagagtaattccaacaaaatagatctgtggataagtatgtaaggtactagtaagaataaagcatacaacacaagattaaaaactcttaagattaaaaatatcacatagacaataaaaatttacttaaaattttgtggttgtttttgagaccaagtctcactctgtcaccgaggctggagtgcagtggtgtgatcttggctcacggcaacctccacctcccaggttcaagcgattctcctgctgtgtttttaattgacttggtgttttacagtcattcactgatccattcaaccaataaacatctatgttgccacatccatgtgtgtggcattttgtctgatattgggaatatggtgtgatccctgaactcgaggagtctacagtgtaataaagaacacaaatatgcacataaatatttttagtaaaatactataagtaataaagacgtatggacaaagtaaccgaggattagggttaccaactcatcccagtttgcctgtgactttctgttagcatgggaagtcctgcatccaggaaaaccctttgctccgaggcaaatctaggatggttggtcatgctacccagcaccacataagacattttttaatgtaggtggtggtagtgggatgcagatttacttttttattttcccccaagagggatatattttagattatgtgtttggaaagagaaaagggataaggaagctaaagttcattttaggcaaaaggaaaaaacccaagcaaagacttggaagcatggttgtatgtcatttggtgttgctggagtacaagatccttatattgcatttataaaaaattgcttttatatttgtttacaaacagtccaaagcagccagtctactaagccaatttttttgggaaaaaggctgctgccaagcaacagaaacttacgtgaaacaaaacccacaagacacatgaagacttcttcaaatcttagaaaactataatgtgtgagattcttcaaatcttagaaaactataatacttttaatgacttaaaatattcacagtggaagaagtctgttttttaaagaaataaagttagatcattgtctcaaagggaaagactgtgaaatgggaacagcttgagatagaatgaatatattatgtatattacttttaaatggtagtttagagaagaggaataagagaaaacagtgtggaacacaa
ggtagaaatggcagggaaaaaaacgatacaggcctgaagaaaataaaagtaggtttgggcaatgtgggtggcaagatgagcccatattttggacccagagtgagtggaagaggtgagatggtcaagtagttcacagcattcttttaaataacatctgagtatactctggaatagacagggcaaaaaacaaatgaaattgcctgtggtagtccccatattaaataaatttaatttatttaattaaaaaactcaaagagtaaaaataataaagagaaagtgttgatattactgtaaaaaacagaccatattttctcctttcaatttttgtgctcgctggggatattttatttttaaatacaaactgatgttctctaaattcaaacatctttttattaaaagcgttactagaggtagcctgcagagcatatctagttctttgagttgccctgcttgaaggattgccacctctgtgtctctgaggctctgagcacagatgcctagggcatcagcctgagatgaaggtggtggggtttagaagaactgaaacacagctctaggacttcctctgccatttcaaactctttttagtaacacaggtagtaacatacagtcatgtattagtcaaacagttcccacctctttctttttctctttcctctcctccctccatccctgcttccctttcttccttttctccctcactcttctttccatctagtatttgttgagtactaactaggccagatattcttctaaattctggaaacacagcagtgaaggacaacgtttctggtcacttgatgcttccattctatgatttgtagttttttgcttttgtttcacaagggctacacaaaacccaaaaatcctaaagccaaaccccaaaaactcaactgaacagaaaacaggataaagggacagagagcaagaagtggtgctacttgatgtaggccagtgagggaggggcattctaaggaagaagcagcaccagagcaaaggcacaaaagaaaatgaggcagcagccagatagacctgtgggagcagcatattccgggaagtagaaacagcaaacaaaaaggctcaaggctgtaattggcttgggcttttgcctacctagtttctgttgtccctttcttctttactatcagaattctgattttattctacagggtattagattcagctaaaagataacatttcccaccttcttttgcagccacggaggtgatactactaagggtttttttgtttgtttgtttgttttgtttttaataaaacgatgatttgctggttgggaagcccttttgcccagctctgcacccaccttccccacctgggccctggaacatcaatgcccagcactgcggtggtcatcttgaaccatgaggtgatgctcaggcaagtcagggtaacaacgtagaacaaaaagagagaaggctctggtttcctgatgatactgtggaaccgccacaccagtccctacacagtgtacttttcatttcttttacagagagaaaactaaaaaccgtgatttttagcctagaattttcaggggtatctctgccattttcaatgaaagtatttctaaattcttcataggctagggatggaaacacagatgagttatgacgacgctgcaataatctatgtggaagatggcaatgccttagaccagggtggcactaacagaggtggtaaaaagtgatggcattctaggtatactttgaatgtagcactaacaaggatttgctgatagactggaggtgatatatgagagaaagatgagacaaaggttaactgtgaggtctgggccggcacaacagtgagcagtgatgccagtcactgaggtgagaggtgggggtggagcaaacttagaggcgagggaaagttcaggtgttctattttggacatgttaagcttgagttactcctagacatctgagtgggaatgcaaagaggcagaggtgtacatgagtaagggctgcagataaatgtttaggacacatctgcacatacatgggatataaagccacgcacctggacaaagtcacctagggggtgaatatataaaaagaaagggagttcaggaactgaagctacgagtgttctaatatttaaacgtcatacagagaagagaactccaaaaaaggaaactcaaacagcaggcaatggggcaaaagaagaactgagtgagtttaggatctcagagacaaatgaagaaagtctttcattgtggaagggaataa(seq id no:21)。
[0205]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e8或s5e8，位于人类基因组序列human_hg38 start 166148156/human_hg38 stop 166149792(图1a-2和1a-3)：
[0206]
tttgtcttcaactttttaaatatccatctattttttagattagatgccatctgttgtattatcatatctggttaaatcttattaaaattcctggccaatatatcactctgctgcggcaatcttaccctgctacctctctaggcttttctgcagcattcaataaagagcctgctattttaactaattgctgaggcaggacacagtgtgagagtctaaaaca
166160023/human_hg38 stop 166160609(图1a-2和1a-3)：
[0210]
tatcccagaaagaaggaaatggtcagtttatctggagttaagcatttgtgtattatcatgattaatcacaggaacagttgccaagctttcattataaaaatattctccaggagaattcatcaagttccattgcctattaatttctgtccatgcattttatttggcatcttcaatgacagaggacacttttaaaaaaaagaaatgaagacaaaagaaaaagttcattagagaaataatgtatgtgtgatatttaaaaattaagccacatcatcatcctaagaaaactacgagactttagttttagtataaacttgcagtgtgttcttgagatttctaaatataaggcttaacattttttccttaatacacatcgatttggcatctcatatgtattatttatcaggaaattataaaacaaagtaaaatgatgttttactaaaatgcacatcatttttagatatgggattttaaaacttgatttataatactacttttaccatgaaatactcttttgttgtatgaccttgagtacatttcccatctgtgaatctgtgtaatcatgtacaaaaataaatgagacaaaacct(seq id no:24)。
[0211]
在一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个约100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与上述e1(s5e1)至e10(s5e10)增强子元件序列(例如seq id no:15-24)的人类多核苷酸(dna)序列具有至少75％或以上的序列同一性。在另一个实施方案中，scn1a特异性增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个约100bp或更长的区域。该scn1a特异性增强子序列与上述e2(s5e2)增强子元件序列(例如seq id no:16)的人类多核苷酸(dna)序列具有至少75％或以上的序列同一性。
[0212]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e11或s5e11，位于人类基因组序列human_hg38 start 36816984/human_hg38 stop 36817612(图1a-2和1a-3)：
[0213]
tcagcaagtctgtcatcgacatcctgcaactgtttgagcgggcagagcaagtgcgaaaagattaaaaagtgcttttctcatcatttctgctcatatgaccagcgctgcagtgctgcgcgccgggcgcacgcccgccgggcctggcatggcgccaggggcccggactctgagcgcagcgggagcggctcagtccagccgcgccgctgagcagcgccggccgccggcaagaaggcgcgcggacctgctaccactcctgcaccgccaggccaggggtccgcgggatcccaggggctgcggccagggcacgagggaaggggccacctctgggatttagggggcactggcgtcaccagctgggtctggaaagtccacctgccgtcaaggacacgcaggaggtgcgccgtctcagatctgggaaccttggcggatgtcctgccgcgtgggggaagatcctgaaccttcagcggccagcctgcacctcaggacctcctaggccctgctccctttctctctccactcctacctcagcctctgctctggtctgtcctggatgcaaatttatgctgcaaaatctgagcgctgaggtcctgaaacctgacccacccgacgcagggaggaggtggcaggga(seq id no:25)。
[0214]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e12，位于人类基因组序列human_hg38 start 36817484/human_hg38 stop 36817720(图1a-2和1a-3)：
[0215]
tccctttctctctccactcctacctcagcctctgctctggtctgtcctggatgcaaatttatgctgcaaaatctgagcgctgaggtcctgaaacctgacccacccgacgcagggaggaggtggcagggacagggacagggacag
gcaggagctgctggggcccacttcgggtgccccatcccacatctggccagggatgcatattctaaaacctgatttgatgttttacttttattt(seq id no:26)。
[0216]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e13，位于人类基因组序列human_hg38 start 36818134/human_hg38 stop 36818727(图1a-2和1a-3)：
[0217]
cctgggctgcactaagtcccagtgtgaccttgggttgtgaccttctctgggcttctgtctccttctgatgtgttgatgacgtcagtggtcccatgtagtgggacctggggactgcaacttaaggtattggcaggtaggcagggccttgggctgtggtggccctgggtggtggggaccagggagagcagctgtccagctgcccagtaactcaagttccctgacatcgctgtcaacattgtctcctgcagctcagccctggatggctgcccttcctggaaaccttaggatacctctgctggctccagctgccccctccctgtgagtcagctccttcaagccacagcccgccagatggcttccaaggcaccaaggatgcagctcctgacctgatgcctctcagctccaggacttcccaggacccctcagctgccctggaccctgctgctactgccgtcacctctgcaccttgtccccagctgggctgctgactcagatatgccaggctcctatgctatcatttcaactcccaggctcagctcactccaggagcctagttggagaatggatttccccagctgaaggacgcttcagcta(seq id no:27)。
[0218]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e14，位于人类基因组序列human_hg38 start 88802240/human_hg38 stop 88802877(图1a-2和1a-3)：
[0219]
gcacttcagttccttttcatcaaggaactgattaaagtgtggtctattatctctgtagtggggagtcccgaaagattccacttcttcctcttcttgcccaatgagagggtcaggaagcttccaccaccatcctgactgtggccaccacatcctggtgtgaagcaccaccagcttcctccacaagaactctgaaggtcaccagccagcttgagtcctccgaaggtgctgtggctcaaccagcagcctgtgtagcagagagcacaagacctgggactcgaactcagtcccaccttcaagagggatctccaccactttctgagcctcagttttcacatctttggttaggggcaggtgggaagttgccatatttaccttgttgggctctttggaaaaattaaatgaaatgttaatgtatgttacacaacgggctcataggagggattcaaaagctgctagttctttttctccttttcctgaaaacggtattaaagagtactgtagagacactggagaattcctgcttcatatgagatgtccttggtctctcccggggaatttgaagacccagagactcgcagctccccgtgagcctccccgctgacgccttacctccccctctccaccatcccctgccatcc(seq id no:28)。
[0220]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e15，位于人类基因组序列human_hg38 start 88803290/human_hg38 stop 88803678(图1a-2和1a-3)：
[0221]
tgccttcccctccccctgtcggccgcccctcggtccctgggggtggggtttccctttgcgctcgcccc
ctcccgcccccacccctcacgggccctcccctcccccgcccgtccctatgtatgtgtcacagcgcgccatgcccgcccgcccgcccacctacctccccgccgctccagagggggctcgcagagctgaggacgcgcgcagcgctgctcaaggtctctctctctcagcaccctcgccggccggcgtctgacgcgggtgccagggtctccgggcacctttcagtgtccattccctcagccagccaggactccgcaacccagcagttgccgctgcggccacagcccgaggggacctgcggacaggacgccggcaggaggaggggt(seq id no:29)。
[0222]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e16，位于人类基因组序列human_hg38 start 88807290/human_hg38 stop 88807962(图1a-2和1a-3)：
[0223]
gccctgggaaaggggatcaggagcacatcttgggaacaggagccttcctctcctgctgtcaacggcctggcctcgtggccatgcttcgtgtcctgatggtagccgcactgccgccctgataacttaaaggaagccccttcaatgggatgaagggcccgtttctgtgacagctactttgggagtggcagctccccttcccccagatccaacaggacacagccatccctgcgagggagtctgggcccctggacgcagttgaagaagggccactgggaggccggcagaacaaggggagggctggagaaggagcgggagtgcaggcgagaggaggaccagagagggggaatttgtagagaaaacggtaaaacggtttcttttttcaaaagttgaatccagggcaagaacggaaacggtggagtttacttttaaaaactcagagcctccttataagtggtggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcatgctggcagggcgggccctgcgggctggccaggcctgtgagaggtgacttctctccctctcaatggccttacagtgtatcctaaagaagctttttgttaaactcatgaataggtggatttggggtgtgtgatgctgggcatcacgatttggatatttggttacctttgaggtta(seq id no:30)。
[0224]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e17，位于人类基因组序列human_hg38 start 88833390/human_hg38 stop 88833984(图1a-2和1a-3)：
[0225]
ttcatttcaggctccccgtccccttcctctgcctcacctatgctgtcgccctgtcagcacctaattcagcttcccatggagaaaggcctccctgttgacagggccgtgctgggactcagggctgccaaagtcagtcttctcgcataaaaggctcagtgagtcctggagacacttggaagccagacagaatggaatttctccctattttctttacagctgagaaaacacacacaaacacaagagcatatttattgcgatatttctatcccaaagtttgtctttaaaaaaaaaaaagaaataaaattagtttctctgcccactccacccctatccccctacccccactctcctccccacctcttttcattccttcccatttcctggtttaggccagggagagaaatcaagccgtccaagccccacagagcactcctacacccccggacaatgtccagcttgttcagagagtgagggaagaaacacagctccgaaaacatacacacaacctcccaatgaagggtgttctgagggaagaacaggcgggccttgtgtctgaacacgaatccctaaggctctgggaagagaggagccggaa(seq id no:31)。
[0226]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％
或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e18，位于人类基因组序列human_hg38 start 128377753/human_hg38 stop 128378783(图1a-2和1a-3)：
[0227]
ggtcttaaagtaggaaaacacatggtgtgatttgggttggtgaatagtcgacttgtagatctgcggactcgtcaacattgctctgacatcagattttctgaagagcagtgtgggctccttccccagggctggccgagttttgaggggaactgcaggttctgatgtttccaactctgtatctctgccctcgtcatttccatggacaagttatttgtgctggtgtgagatccagaatcggtcctgctacgtgacaatgcctggagcacggagccaggaacccaagctgcctcaccagcgtgttagggttgttactgtgcccgttttagaagatcacttggaggtgcaaaaatagagcagtttttttttgtttttttttttttgacatggagtctcgctctgtcgcccaggctggagtgcagtggcgcaatctcggctcactgcaagctccgcctccccggttcacgccattctcctgccttagcctcccgagtagctgggactacaggagcctgccaccatgcccggctaatttttttgtattttttagtagagacggggtttgaccatgttagccaggatggtctcgatctcctgacttcatgatccgcccgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccaccacgcctggccaagagcagatttttttaaaaaaattaagtacctctattcatttgcaccttcactacccagtgaggagatcaaaatttcctagagcaaatgcattcgatgccactcacagatttcgacaggagagcacaatttcaggaacgcctacatcaaagcactaattggcacttttacagtgtctttctccgcacgtgagccttgctggtggaaggagctgtcatagtaatgcgtattcctccatgcccagtgagtagggtgacggtcaattcacagttcactaggcacaaaagatgacggggctctcctctgctcgggacagcaagaaggttgaggtgatacggtttgtcggtgtccccacccaaatctcatct(seq id no:32)。
[0228]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e19，位于人类基因组序列human_hg38 start 128289803/human_hg38 stop 128290279(图1a-2和1a-3)：
[0229]
catgaaagtcactgttttacatactaattgcattttccccaaaacatcaagctaaatacataactgatagcatgtttaaaggtcctatgtttcacctcaaattatctcatatttcacatgaggcaaaccctgtcctgaggccctgatgaagatgggcaggcagatctgatatcagctgcttttctttccttgatggaacctctggattgcgtgccctatcctataatgtgaaaaaagggcttccagaaaaggtggaggaattactttctgaaattctgaaaggctggatccaaaggtgcagaaaggaacattatttcctaccatataaaacccagtagggcgtgtgatgctgggacactgtatgagtccattctcatactgccataaagaagtacctgagactgggtattttataaaggaaagaggtttggttgactcacagttctgcaggcttaatagaaagcataactgggaggc(seq id no:33)。
[0230]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e20，位于人类基因组序列human_hg38 start 128323153/human_hg38 stop 128323718(图1a-2和1a-3)：
[0231]
aaaaatgaagaatttatatgccaactccaggagaaatatttcagtgaggtcctggcttggtgcaaggatatggaaccagagccaagaattctatcagttaaaagcagcttagtttcctgagcctggactgatgggggacgtggaagacaaagtgtcaggtccatcagtggaagattggccttgagccactgtacacagaatggagagcccactggcctaa
aaggagagattgtcaggcgtgacgaagcaggaattttagccgaagaatattcacaaattacaggccaagagggaagtggggacgttcgtcttctcttcatagccttgctcgttgggggaccagctgtcctttattgttaatagaaaaatcaatatagcaagaggcgaatctttgctgtgataacattggctcctttcaccaggcgtgtggaattagattactgatagatgcacctctgtcgcctccccaggctccagatagaatctatgggctttgccaataagcacggtaacagagtgtggatcaggaaccagcgggtggccaatggcagtggagaaaatgtaat(seq id no:34)。
[0232]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e21，位于人类基因组序列human_hg38 start 128332503/human_hg38 stop 128332974(图1a-2和1a-3)：
[0233]
atagaccatataattctcacatgtcaaggttttaagccaaagccctcaggcaccacttctgattttcttgaaggatcaaaaataaaaggttgcaaccctcacagccgtaggctcctgcagcaactctttggtgcacctgtcaccctgatacctgggaggaggctctgagtccatgctgtgggaaggtgctggccttcatggatgggcctcccctggtgtgtccactgtggacctgagtgggtgtcccagagccctggctctcccttcttttcctctagaaagggaatcggcatgttcccaatcatctctgagattatctttattcttcaaggagttgcagtggctcttgccaagtgccctggggtcttggacatctgcctagtggccctgtagagacctccaccctccagacagctcagaatttgctaaagaaaatgtgaattttggagtccagggctagaaaatatgacat(seq id no:35)。
[0234]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e22，位于人类基因组序列human_hg38 start 128336003/human_hg38 stop 128336491(图1a-2和1a-3)：
[0235]
aagaaaagttttattttgcctctgtagtattggggtttaagtgatcacggtaattttccattatcattttgtgttttaaataaatacaacaggctttattgtgaaaatatttgtctaatattgggcagtaaatgtttaagtgattttggtttaattactattacagtcatactattacagtgcataaaatagaattcttcttgagtttgttcattagatgggaagaggctgcatttttaaaaaatatatgcatgcctataatactacatttaaatatgtgcgtatataaagagatgctttcttatttatatacatggtcattatagagctttgtgagaaatagaattttctctgtgcaatctgtactctgggaggggttatttgctgacactgtatgcccatttcctaacagaatgtctctagttaagtaatcatatgatgaagacatcccagctgggactctatatttaagccaagttactatttcta(seq id no:36)。
[0236]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e23，位于人类基因组序列human_hg38 start 128365603/human_hg38 stop 1283366181(图1a-2和1a-3)：
[0237]
ctaaaaatgcctcctcgcctctgattttagccgtggttgttggagtaccggttccagcaggagctgtgatttccattgagctctcaaaccaaataaaatgcaaatctccgaggatggctcctctccctgcccccacagttgtgc
tccgaatagtgtctgagtttcatttttacaaggggcctttaaaaactcctgggccccttgaaaactcccagccccctttgtccagatggggatggaggtggccaggctgccccgttgattgtgtgccgaggagccctccccgggaaggctgtgatttatacgcgcaggcttgtcacggggtgaaaggaagggccactttttcattttgatccaatgttaggtttgaaagccacccactgctgtaaactcagctggatccgcgggccgtgattaaacacattgcccgctttgttgccgagatggtgtttcggaaggcgctgtgaatgcacttccctttgcggggctcacacagacaagatgtgtgttgcaaggatgaggcgcctgctcggcctccagcccagggccgggaagggagaaggtgctgtgcgtcgctgc(seq id no:37)。
[0238]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e24，位于人类基因组序列human_hg38 start 128375853/human_hg38 stop 128376606(图1a-2和1a-3)：
[0239]
ttgaggcaagagcgagggtggcatatccagggtggccactgggtctggagtgtcagtagcagggcagatttagaaggtgactttgcatacctaggcaaggccagctcatgcgggatgtcggagcccatgggaagcaccttgcgtttgaggctgcctgcggtgggaagcttcagagtttcaagcggggctttgctatgggtttgttctgctttcccgttttcccctttggaggaggcttacagagatagtgatgactttgcagctgttaatcatcaggaagctgtaatcactaagaatgtttgaaatcatcagttaaggatttttagaaggaagtaaaccaaagaaatactgcagtagcctgccctaattatttcctgggcttaaagtaaccaggtgcattggagagattatttttcttcttctgatttatgaaggtctcagggtccaaattttgaaactgctgatcgaatttgttcttggatgttgtcatagaaatctgaaactttcctacttgtctgagagtgaaatttctttgattattcactcaagggtttgataggtttaaaaaaaggccttcgggacatctcttgttataaagtgtcaactttagatatcaagagaatcatgatatatttattactacaaaagagaaaataagcaactgaaaaactcatgaacttgaagcatgaagcaaaccccttaagttctaggggtttcaagatgtggatgccaacatgtgatgacatttaaaaga
[0240]
(seq id no:38)。
[0241]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e25，位于人类基因组序列human_hg38 start 128408553/human_hg38 stop 128408930(图1a-2和1a-3)：
[0242]
ggcttttggtttttacaaaatattacaagttgcctaaatagtccgtgtttaaggacatagagccagagctctttctggaatgtcatacctcggcagggccttttgtgcatgttttaagctgattctgaaattagggggttaaaatggaagcgccgagccatccctaaagagagggaggcgaatgtgcccttgttgctggtgaccccagaacaaggcctctgggctgagaacaggagagaatgttatttctttgaaaagccatcttgacaatccaagtccgtttggctgcagcaccaaaggcagctttgatctgctcgccagtgtccctgccgggaaaaggattagggtccttccagaggacagcagagccaggctgcc(seq id no:39)。
[0243]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％
或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e26，位于人类基因组序列human_hg38 start 13388723/human_hg38 stop 13390212(图1a-2和1a-3)：
[0244]
gcccaggctggagtgtggtggcaaaatctcagataactgaaacctctgcttcccaggctcaagccatcctcccacctctgtctgcagagtagctgagactataggcatgtgccacaatgctcagataattacttaacattctagtagagtctagtagacatgggctatcactatgttgccctggctggtctggaactcctgggctcaagtgattgttctgccttggcttcccaaagtgttgggattacggctgtaagccgccatgcttggcttcgctttacaatttttttttttttttttttgagacagagtcttactctgccacccaggctggagtgtagtggctagattttggctcactgcaaactctggcccttgggttaagagattctcctgcctcagcttcccaagtagctgggattacaggcatggacaaccatacctggctaatattttgtattagcagagacggtatttcaccgtgtcggccgggctggtctcgaactcccgacctcatgatccgcctacctcgggctcccaaagtgctgggattacaggcatgagccaccgtgcttggccaagaagacattttgttttctcaaaaaagtggagatctgagcttcaaagatccttggtaacacttcccagtgctatcagtgtagtggtgcagtggctaataattcatggaccctataggagggatcttgcctgctctttagaggttgggacacactcttcttggtaccagaagggcagaactatgcctctgtggccacttattgcagaatggaattggagtaaactgagggccctttcacacatgctagagaactgactttggccctaggagaagtgggggttgcaggggattggcctgagaaacttgccttttcactggattgtcctctagagtttttcactggagatttgtcagaatgagcctccagtccccatccagactcctggagctggcaggccagagcctgctgaggaaccagttcttgaccatcttcatcctggacgagctgcccagggaggtcttccctctgatgttcatggaggcctccagcatgagacattttgaggccctgaagctgatggtgcaggcctggcccttcctccgcctccctctgggatccctgatgaagacacctcatctggagaccttgcaagctgtgctgaagggacttgatacactgctggcccagaagcttcgccccaggtgaggtgactcaggtggcctggtgggaagggtccaggcatccagggaagggacagctggctcaggaggagtggtggggttggggagctagggtggctcagaggcttctgatggtgcccatgagagaccttgaccattgcccagatcctctggaaaaggactgctcaccatacagggtccactgaggaaacaggaacctgcttcctcccagtggaaggtaaaggttctagaagtgagaaccaggcagaatccaagggggagcgggatg(seq id no:40)。
[0245]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e27，位于人类基因组序列human_hg38 start 13469123/human_hg38 stop 13470861(图1a-2和1a-3)：
[0246]
ttgggttccaatggaactacagagagcaatgactactggtcctgaatgtgggtataaagttttaccctaaaagtaccttgtatttttttccaaggccaaaatataacaactcatttgcaccctggaaaggtatgtttatttaaaaaaaaagattgcatttgcaaacagtagagaacactgctcttttttatttaaaaaaatctttaccatggaaaaacaataaagtttgcgtgtgtgtttattggtctggggacttaaagaacaaagataccttgtggattgcagacaaatgaaacccacagaggtttgctttgggtaggtttcaccatacaggtgtttcaatagaccactttgcaaataataaattacttaacactcaaggccgctagaggccactaaaaaggagtttatggccaaggcacagggctggtggctggctcagtgagcggtggcaggatattaatgagactcagagcctggacgtgctctggatccagttaaatgtaatagagttggaaaaccacctgcccccagccactgacggcacctaggattcatgcctgtaactttgaccatctgagcctgtagggacattggggaggagggggagggtgagaggaggcagtggcaacagcagcatggatgttccatgcaaacccttctctgtcaccagggaaagcagtctgagcacatgaatttcttagcctctcttccaggatgaagcctagtttgaaccagcactgccaggttga
agtgttactgcatcctgcagccagagccagggcatgtggccacccccttggtccctgctgtggtacccagagtcacttggaacatgtgtgaagccaggatgagggtgcatataccctccagatgctgatatctaaatatttacaagtcacaaatacagagaaactgttttttttttgttattgttgttgttgttttgagaaggagtctcgctctgtcgcccaggctggagtgcagtagcgtgatctcggctcaaagttctgcctcccgggttcacgccattctcctgcctcagcctcccaagtagctgggattataggcatgcaccaccacgcctagcaaattttgtatttttagtagagatggggtttctccatgttggtcaggctggtctcaactcctgatctcaggtgatctgcccacctcagcctcccaaagtgctgggattacaggtgtgagccaccgcacccggccaacaaaagtaccttcttaatgacttcgaagactaggtttaaatggtaaattattaaattcttggaaatctgccacagaatatggcattgtggggacagctgagctgattgaaacctgctccctttctcttcccactcccagctccatcctgcaccttaggggtctatgcacacctgtgtggacatcccaccctcacatccaacctctattcacattccccaccaccatcctgtgtggccactcagcctgctctaaagcagggatgctgggaagatgcccacatccaagcttggaatcgtttttgccagaaattgggggccctaagtacccaaaaaatgttctagaaggggacatgttctggatggccatggactccttgctccctggggaagagcacagctggaggaggactggagcaaggccccctaaagcactggacccaagataatgcccctcttgcccaggtccaagggctgtactagtggtacccgctgtcatcacagcattcattactg(seq id no:41)。
[0247]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e28，位于人类基因组序列human_hg38 start 31124894/human_hg38 stop 31125629(图1a-2和1a-3)：
[0248]
cctcggaaccaaggttggctctggcacctgtagggccacgggcagctatgtcagcttcctcggaaggaccgaggctggctctggcatctccccgaccaatcctggctccactgtgtacccctgaagggcagaaaacagctactgcccaccgcagctccagcctggccccaacatctgtgggccagctggtgatgtctgcctcagctggaccaaagcctcccccagcgaccacaggctcagttctggctccgacgtccctggggctggtgatgcctgcctcagcagggccaagatctcccccagtcaccctggggcccaatctggccccaacctccagagaccagaagcaggagccacctgcctccgtgggacccaagccaacactggcagcctctggcctgagcctggccctggcttctgaggagcagcccccagaactcccctccaccccttccccggtgcccagtccagttctgtctccaactcaggaacaggccctggctccagcatccacggcatcaggcgcagcctctgtgggacagacatcagctagaaagagggatgccccagcccctagacctctccctgcttctgaggggcatctccagcctccagctcagacatctggtcctacaggctccccaccctgcatccaaacctccccagaccctcggctctccccctccttccgagcccggcc tgaggccctccacagcagccctgaggatcctgtttt(seq id no:42)。
[0249]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e29，位于人类基因组序列human_hg38 start 31132544/human_hg38 stop 31133831(图1a-2和1a-3)：
[0250]
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[0251]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e30，位于人类基因组序列human_hg38 start 88655733/human_hg38 stop 88657379(图1a-2和1a-3)：
[0252]
acatcttaaacagtcttttaatgttatgaatttgatttttcaagaaatacatgtcatttattttcaaaacgaaatgatagctatactttctagagtctatcaatagtatttaaaataagatactcataactttcaaatactgcttttactagtcatcactcgtcattaaatgtaactgtatattcaagagctttctaataatagcctttaattaaacgaaggactgttagagggtttctgttgccctttgaagttcttaattattacttgtatccagcattttatggtacacttaaggttaaattaaatcatttaaatataccttgaagagaaatatgaagacttttgcccattttaattaaatctctgaatttcagtatttgaaaataataacatatgttttgatttttttttcatggccgaatggcaaaatgctcactatattaaacaacaaaaaaagaaatggtagctttttatgggactaatcgctaagcagatgcatgtaaatgagctattttctatgcatggcttccaaaagtgctaattaaatagttggtattcaaggctatgctcgctcattgtttagtgacacacaaatccagcgatgtgtgccagcagacattttaagttgaatgttttctcctctacggtctttgtcatgaaatggtggcaccatgatgagaacactagtgtaagcaaaacattgaaatatgctttaataatgttttaaccatgtagtgacactagcctagttttctaatgaatttttaatttctgttttcttataagggtgatatgagttatcgctgatgcatattaaatcatatacatgagtcattttctctaaatttgcataaaatggctaaatgctaatgcaccaaatggagcttactatatgtggtacagcaaatattcccttgaagattttctgcaatcaatctcctgtatttcattagcaaccagataaggtgtggtctgcagaataaaaaaagaaaagtgtgtagctcatgaacttatgaggcttcagatgatttctacgtggtgattagagtggattctgcaattagaatttatgtaggtaaaacacacatgtgcttcctttaaaggcacagtgcaacaaaagttctgaatacagccttgcaattgttaaacaatgaaaaggcaccattcaattattgtgatttttttacatctataattaaatgaaggaaagccatactttaaatttagtatcatttgattggcataacccttactgaaattttacaatttccctactatgtttataaaagaacttttaaaaataaccatgtgtgaaatattttgtttgctaactgttcccattttccttgtcaaataa
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[0253]
(seq id no:44)。
[0254]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e31，位于人类基因组序列human_hg38 start 88872683/human_hg38 stop 88872997(图1a-2和1a-3)：
[0255]
tattatcctagtaaatccttaaaaaactttaagaggtgggtgattttataattcccattttacagatcctggtactggggctttctggtcattaaaacacctgcctaaaaccactaatcagtaaatgggaggctggcttttgaacccagttttggtcgttgttcttaatcattattctttattgtttatggacatgtttgtctaatagcataatatgtagaatcaaagaaatgatattaagtgtggaaatggagtctccaaactctttatgcttgtttaaacgatcttctctctcgagagtgtatcttcatcctt(seq id no:45)。
[0256]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e32，位于人类基因组序列human_hg38 start 88745133/human_hg38 stop 88745535(图1a-2和1a-3)：
[0257]
tttcccttactcagctaacaaacatttaccaagtatctgctgtgtgctaacgcttaggtgttaaactgggcatacaaactgaatgagaaagagtttgcctccacagagctgagcgtcctagagagatgtgcccagatgttgcaatcataatgcaatgagaaatgtaatgttggtacaggctactatgtaagcacaggaaagaggtgcataacttgtctgttagagtcaggaaaggcttttctcaaatggctgaactgaattctgtgggatgacaaagagtgctcaatagcatgaagcagaagaaggaaaggcatgctaggattgcataggtaagagtaagcggccgtgacattgccaagtggcggcacagtgtagcaattaagagcacacactgaggccgggt
[0258]
(seq id no:46)。
[0259]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e33，位于人类基因组序列human_hg38 start 88799783/human_hg38 stop 88801354(图1a-2和1a-3)：
[0260]
ataaaatatcaggtaaatataatctctcatctctcatcttctctccatctccctatgtccctttccttctctctctctctctctctctcacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacagagagagagacacacatgttcttcctctaaaaagaaaaaccaataatcctctactgagacagttgtgaatcaaaggtttcttctgcaggagttacatccatctctgaatttcctagagagcagcaaagggccttgtgttttattccccttccacacttaatcac
tggactgtgggcccagactgaatgagtagctcattagaatcactgagttcactgaggggatgagagattccttcctggctgggtgctaagtgatactcccataaggattttgtggttacaaaacgtgctggatatggaggtaacctgtctgggagtcctgtcactccaaggatcacttggaatgctctggaaaaacacatgacctggctgaatgagttctgttgaattgtttagcctacaccttcatttcagcagcttatactgcattaatgaggttattgttcctttgccgtccaattgttcccaagctgattttttgcatatatgttttacatccttaacaagaatgcctgtctcctgctgtttcagagtctcttccacagtgctgagcatgagtggagcttgctaaatcattgctaaatgaagcaatgggctgtaagcatgtcctgtgggatctgcatcttcagatcatcctgaagtactcaacaaccacatcttcttccaggaacagagcccaacataaactggtagggtttgctgtcttagacagctaagagaacgaggagtggagctagtgaacaagcagtgaagggggcagttccttaatgccatccgaactgaatttcaacagtctgacaagctagcgttttgggtaaatatcccagtatacttgtcacagagttaagtaaaatggacttccttcaaaggaagtgcttttaatacaataactgtttttgtttttttaaccaatggattaaaaatttaacacatttactaaatctggcatatttatatattgtatctaaacagatattcaagctgcattataatataatcataaaaaaactgatctcagtctgtctgttaagcctttgtgagtctttgtgccattgttggagtagtgctaattatcaagcaaagacatgataattacgcagagcttttttgctaaaagaaggaatctttttcaacacccacgcactgcacaatttcctatgaccctgtagcactactctggtatggcccagaaatttgtatttctgtgtaaaggctggaaattatattatttctatctctcccgataccttttcttcttgtgagtaaactgtttttagagggttaaggaagaggggtaatggtccaaatgggaaatataaaactaatgacccttcatgaaacatattatgctcctcattaaacttattcagttaaatgtattccattaaattaaaataaataggatttaaaattttacccaggagcagtaaacaatctt(seq id no:47)
[0261]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e34，位于人类基因组序列human_hg38 start 27969472/human_hg38 stop 27969690(图1a-2和1a-3)：
[0262]
tgctgaaccagtctccgctgcatcgtctccgctcgcgctcgggacctgcaacagaagggaatgggacccgagtgtcagtctggactctccatctccccgcactactccgctccccctttttagcccgctctcaaaaagcctcttcaacatcaagggcatctcccaagttgaaaagaaaaaaaatttctctggagcctctcagcacttacttatttagca(seq id no:48)。
[0263]
在另一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个50-500bp或更长、50-250bp或更长、100-200bp或更长，或100bp或更长的区域。该增强子序列与下述人类多核苷酸(dna)序列具有至少70％或更高、至少75％或更高、至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高，或至少95％或更高的序列同一性。该人类多核苷酸序列在本文中称为e35，位于人类基因组序列human_hg38 start 27973822/human_hg38 stop 7974489(图1a-2和1a-3)：
[0264]
caagctgatgggatcctcccatgggaaaagtgggcctcacacccttcctcacccttccctacttcctgggcaatgttctgcttcccccaaactgaagcaggaggcccagagaggaggcggtttcctgggaggaacccaaaccaatgtgagatgagaaggtctttaggaaatgggggtctctgagaaccggttcttaaaggtcaagcacttgagcacctcgcaaactcctgacaattgaaacatatctgaagagtcttcttcagatatgtctctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgagagagagagagagagagagagagagagaatatgaatgtgcagtgtcccagtcctgatctcctggactggtgccagccagccagatgcctgcccttggctggccaagtttttggctcctgaaagtaggcagctctggact
tgtacgaggccacagagagagttccaagccccacctggctcaggcgacaacctctcaacctgaagtcaatctccggtggcatcacagggccctcctggcagcagcccagttccccacatgaaccgaatggtcctttcttaaattttgagccgggggctgcctaaaaggggctgcccccgcaagcattttacctccctaacaccattctctgcccgtgcca(seq id no:49)。
[0265]
在一个实施方案中，如本文所述的增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个约100bp或更长的区域。该增强子序列与上述e11至e35增强子元件序列(例如seq id no:25-49)的人类多核苷酸(dna)序列具有至少75％或以上的序列同一性。在另一个实施方案中，增强子序列包括一核苷酸序列，其包含一个或多个约100bp或更长的区域。该增强子序列与上述e1(seq id no:15)、e2(seq id no:16)、e5(seq id no:19)、e6(seq id no:20)、e11(seq id no:25)、e14(seq id no:28)、e22(seq id no:36)或e29(seq id no:43)增强子元件序列(例如seq id no:16)的人类多核苷酸(dna)序列具有至少75％或以上的序列同一性。
[0266]
遗传性癫痫伴热性惊厥附加症(gefs )与德拉韦综合征
[0267]
遗传性癫痫伴热性惊厥附加症(genetic epilepsy with febrile seizures plus，gefs )是一种罕见的疾病，包含一系列不同严重程度的癫痫发作病症。gefs 通常在成员有各种热性惊厥的家庭中被诊断出来，这些热性惊厥是由高烧和其他类型的反复发作(癫痫)引起的，包括与发烧无关的发作(无热惊厥)。其他发作类型称为全身性发作，通常涉及大脑的两侧；然而，仅涉及大脑一侧的发作(局部发作)会发生在一些受影响的个体身上。gefs 患者最常见的发作类型包括引起不自主肌肉抽搐的肌阵挛性发作；肌张力减弱突然发作的失张力发作；以及导致短期意识丧失的失神发作，其表现为目光呆滞。虽然gefs 通常在家族中被诊断出来，但它也可能发生在没有家族病史的个体身上。
[0268]
gefs 谱系中最常见和最温和的特征是简单的热性惊厥，从婴儿期开始，通常在5岁时停止。若热性惊厥在5岁后持续，或出现其他类型的惊厥时，这种情况称为热性惊厥附加症(fs )，通常在青春期早期停止。
[0269]
德拉韦综合征(dravet syndrome，ds)，也称为婴儿严重肌阵挛性癫痫(severe myoclonic epilepsy of infancy，smei)或早期婴儿癫痫性脑病-6(early infantile epileptic encephalopathy-6，eiee6)，经常被视为gefs 谱系的一部分，是该组病症中最严重的一种。优选使用术语德拉韦综合征，因为并非所有受影响的个体都表现出肌阵挛性癫痫。受影响的婴幼儿通常会出现持续数分钟的长时间癫痫发作(癫痫持续状态)，并由发烧引发。其他类型的发作，包括始于儿童早期的无热性惊厥。这些发作类型可包括肌阵挛或失神发作。在德拉韦综合征中，这些发作难以通过药物控制，并且会随着时间的推移而恶化。大脑功能减退在德拉韦综合征中也很常见。患有德拉韦综合征的儿童通常在出生后的第一年发育正常，但随后发育停滞；一些受影响的儿童会失去先前习得的技能并出现发育倒退。许多患有德拉韦综合征的儿童难以协调运动(共济失调)并且有智力障碍。
[0270]
gefs 的病因
[0271]
几个基因的突变，包括一些目前尚未确定的基因突变，可能会导致gefs 。最常见的相关基因是scn1a。超过80％的德拉韦综合征病例和约10％的其他gefs 病例由该基因的变化引起。仅在少数受影响的个人或家庭中发现了其他基因的突变。scn1a基因和其他与gefs 相关的基因编码离子通道亚基，这些亚基将带正电荷的离子输送到细胞中。这些离子
的输送有助于在神经元(神经细胞)之间产生和传输电信号。scn1a基因的突变对钠通道有多种影响。许多引起或与德拉韦综合征相关的基因突变会减少每个细胞中功能通道的数量。导致轻度gefs 病症的突变可能会改变通道的结构。所有这些基因变化都会影响通道将钠离子输送到神经元的能力。一些有害的突变被认为会减低通道活性，而另一些则可能会增加通道活性。gaba能受体亚基基因的变化会损害通道的功能，导致神经元之间不受控制的信号输送，这可能导致癫痫发作。不希望或不打算受理论束缚，一些研究指出某些scn1a基因突变会引发神经元之间信号传输的持续刺激。大脑中某些神经元的这种过度刺激会引发与癫痫发作相关的异常大脑活动。
[0272]
尽管不清楚是否所有scn1a基因突变都具有相同的影响，但全基因组关联研究已经证实，由scn1a基因编码的电压门控钠通道nav1.1的功能丧失是德拉韦综合征最常见的原因。先前使用德拉韦综合征小鼠模型的研究表明，gaba能中间神经元中scn1a基因功能的丧失是癫痫发作的主要缺陷，而癫痫发作是该综合征最有害的症状。
[0273]
动物实验发现scn1a-/-小鼠出现严重的共济失调和癫痫发作，并在出生后第15天死亡。scn1a /-小鼠则在出生后第21天后出现自发性癫痫发作和零星死亡，明显取决于遗传背景。scn1a的缺失不会改变海马神经元中钠通道的电压依赖性激活或失活。然而，scn1a-/-和 /-小鼠的抑制性中间神经元的钠电流密度显著降低(yu,f.h.等，2006，nat neurosci，9(9)：1142-1149；yu等，2007，nat neurosci，10(1)：134)。实验表明，杂合scn1a突变导致gaba能抑制性中间神经元中钠电流的降低可能导致过度兴奋，从而引发smei患者的癫痫症。
[0274]
gaba能皮层中间神经元
[0275]
释放神经递质γ-氨基丁酸(gaba)的gaba能中间神经元(gabaergic interneuron)是中枢神经系统的抑制性神经元，对于调节和维持神经回路和活动至关重要(kelsom,c.和lu,w.,2013,cell biosci.,3:19)。哺乳动物大脑皮层的gaba能中间神经元包括几种不同的皮层中间神经元亚型，这些亚型可以通过它们表达的蛋白质标记物进行分类。
[0276]
中间神经元在无脊椎动物和脊椎动物生物体尚在发育中的神经系统的布线和神经回路中起着关键作用。中间神经元通常是一种特殊类型的神经元(神经细胞)，其主要作用是在其他类型的神经元之间形成连接。中间神经元既不是运动神经元也不是感觉神经元，其与投射神经元的不同之处在于投射神经元将它们的信号发送到更远的位置，例如大脑或脊髓。至关重要的是，中间神经元的功能是调节神经回路和回路活动。中枢神经系统的大部分中间神经元是抑制型的。与兴奋性神经元相反，抑制性皮层中间神经元通常会释放神经递质γ-氨基丁酸(gaba)和甘氨酸。皮层中间神经元位于大脑皮层中，大脑皮层是指一层外部神经组织，其功能是覆盖大脑中的大脑和小脑结构。(id.)
[0277]
gaba能中间神经元包括许多中间神经元亚型，这些亚型可以根据它们表达的表面标记物进行分类。四种主要的皮层中间神经元亚型为：表达小清蛋白(pv)的中间神经元、表达生长抑素(sst)的中间神经元(其构成一个异质群)和表达离子型血清素受体5ht3a(5ht3ar)的中间神经元。这三种亚型一起占小鼠新皮层gaba 能中间神经元群的大约100％。虽然这些中间神经元位于大脑皮层中各自所属的层，但它们在不同的亚层位置生成，随后再迁移到大脑皮层。
[0278]
皮层电路功能由兴奋性输入和抑制性输入之间的平衡维持。神经回路平衡的破坏可能会导致神经系统、神经发育或神经精神病症的出现，例如但不限于癫痫症、自闭症谱系障碍和智力障碍。
[0279]
gaba能皮层中间神经元的作用
[0280]
gaba能神经元起抑制作用，突触地释放神经递质gaba来调控靶神经元的放电率(firing rate)。神经递质释放通常通过突触后gabaa离子型受体起作用，以触发神经元信号传输通路。中间神经元的作用/功能通常分为三个组成部分：(1)神经传入输入，(2)中间神经元的内在特性，以及(3)中间神经元的目标。一般而言，中间神经元接收来自各种来源的输入，包括锥体细胞以及来自其他皮层和皮层下区域的细胞(kelsom,c.和lu,w.,2013,cell biosci.,3:19)。关于输出，皮层中间神经元参与前馈和反馈抑制。无论输出模式如何，由于单个皮层中间神经元能够与其兴奋性神经元目标建立多个连接，皮层中间神经元网络因此进一步复杂化。
[0281]
皮层中间神经元亚型
[0282]
据估计，大脑皮层中有超过20种不同的gaba能中间神经元亚型。这些亚型还根据它们表达的钙结合蛋白(用作标记物)而各自相异。根据在小鼠和大鼠脑组织中进行的研究，钙结合蛋白、小清蛋白(pv)和神经肽生长抑素(sst)是确定大脑皮层内最主要的中间神经元亚型的关键标志物。特别值得注意的是，表达pv的中间神经元群独立于表达sst的群，因为这些标记的表达不重叠。除pv和sst阳性gaba能中间神经元(它们共同构成gaba能皮层中间神经元群总数的大约70％)外，还发现了表达5ht3ar的另一个中间神经元亚组，该亚群约占所有中间神经元的30％。这三个中间神经元亚群占据几乎或等于所有gaba能皮层中间神经元的100％，但每一个群都是异质的，而且都表达构成各自表征的其他蛋白质或神经肽，尤其是表达5ht3ar的群(kelsom,c.和lu,w.,2013,cell biosci.,3:19)。
[0283]
表达小清蛋白(parvalbumin，pv)的中间神经元
[0284]
表达pv的中间神经元约占gaba能皮层中间神经元群的40％。该中间神经元群具有快速尖峰形成模式，并持续发出短暂动作电位的高频序列。这些中间神经元还拥有所有中间神经元中最低的输入电阻和最快的膜时间常数。
[0285]
两种类型的pv中间神经元包括该pv中间神经元组：篮状细胞和枝状吊灯细胞。篮状细胞是在目标神经元的胞体和近端树突处形成突触的中间神经元，通常具有多极形态。数项研究已表明，快速尖峰形成篮状神经元是新皮层中的主要抑制系统，它们在新皮层中介导目标神经元的快速抑制，并发挥许多其他功能。此类快速尖峰形成篮状神经元可能在调控大脑皮层兴奋性和抑制性输入之间的微妙平衡方面发挥着重要作用。与篮状神经元不同，表达pv的中间神经元的枝状吊灯细胞亚群靶向锥体神经元的轴突初始段。篮状细胞和枝状吊灯细胞都是快速尖峰形成细胞，区别在于它们的电生理特性。与其他中间神经元相比，枝状吊灯细胞因对膜电位有去极化作用，所以可能是兴奋性细胞而非抑制性细胞(kelsom,c.和lu,w.,2013,cell biosci.,3:19)。
[0286]
新皮层(例如小鼠神经皮层)中另一组独立于吊灯状和篮状神经元的表达pv的细胞称为多极性爆裂细胞，其在电生理学和连接性方面与吊灯状和篮状细胞相异。多极性爆裂神经元具有与锥体细胞(或其他多极性爆裂细胞)之间显示成对脉冲易化的突触；相比之下，吊灯状和篮状细胞通常非常压抑(kelsom,c.和lu,w.,2013,cell biosci.,3:19)。
[0287]
表达生长抑素(somatostatin，sst)的中间神经元
[0288]
表达sst的中间神经元构成小鼠新皮层中第二大中间神经元组，约占总皮层中间神经元群的30％。sst gaba能中间神经元代表皮层中间神经元的的一个异质群。sst阳性中间神经元被称为martinotti细胞，具有上升的轴突，可将大脑皮层的第1层树枝化并在锥体神经元的树突簇上建立突触。martinotti细胞也存在于第2至第6皮层，但在第5层中最为丰富。与pv阳性中间神经元相比，martinotti细胞的兴奋性输入有很强的促进作用。表达sst的皮层中间神经元的其他亚群在这个群体中的放电特性、分子标记物的表达和不同神经元的连接性方面表现出差异(kelsom,c.和lu,w.,2013,cell biosci.,3:19)。
[0289]
表达5ht3ar的中间神经元
[0290]
gaba能皮层中间神经元的第三个群是5ht3ar中间神经元组，约占gaba能皮层中间神经元群的30％。根据小鼠实验，大脑皮层中gaba能中间神经元的该群表达5hta3受体，但不表达pv或sst。
[0291]
5ht3ar中间神经元代表异质群。5ht3ar中间神经元群中有数个中间神经元子集，这些子集也表达其他蛋白质或神经肽标记物，包括血管活性肠肽(vip)。表达vip的中间神经元位于第2和第3皮层。表达vip的中间神经元不表达pv或sst，但表达5hta3受体，该类中间神经元约占5ht3ar群的40％。vip中间神经元通常在树突上形成突触；已经观察到一些突触会靶向其他中间神经元。与其他皮层中间神经元相比，vip中间神经元的输入阻力非常高，是最容易兴奋的中间神经元之一。
[0292]
表达5ht3ar的中间神经元群中有60％的皮层中间神经元不表达vip。在这个vip阴性的5ht3ar群中，近80％表达中间神经元标记物reelin。在此类皮层中间神经元中，被称为蜘蛛网细胞的神经胶质细胞群表达神经肽y(npy)，并展现出从圆形体细胞放射出的多个树突。神经胶质中间神经元可以相互形成突触连接，也可以与其他类型的中间神经元形成突触连接，而其他类型的中间神经元只能在同源神经元上形成突触。因此，神经胶质细胞通过激活慢速gabaa和gabab受体以在锥体神经元和其他中间神经元上激发持久的抑制性突触后电位，从而在调控神经回路和功能方面发挥重要作用。
[0293]
锥体神经元
[0294]
锥体神经元又名锥体细胞，是具有直径20-120μm的锥体形细胞本体(细胞体)以及两个不同树突树的神经元。基底树突从基部出现，顶端树突从锥体细胞本体的顶端出现。像大多数神经元一样，锥体神经元有多个树突和一个轴突，但树突和轴突都有广泛的分支。锥体神经元的树突通常被视为输入结构，接收来自其他神经元的突触接触，而轴突则作为锥体神经元对其他神经元的输出。锥体神经元树突也可以释放逆行信号传输分子(例如内源性大麻素)，因此通信在某种程度上是双向的。树突和轴突广泛的分支允许单个神经元与神经元网络中的数千个其他神经元进行通信(spruston,n.,2009,scholarpedia,4(5):6130)。
[0295]
锥体神经元存在于前脑结构中，例如大脑皮层、海马和杏仁核，但不存在于哺乳动物以及鸟类、鱼类和爬行动物的嗅球、纹状体、中脑、后脑或脊髓中。锥体神经元是兴奋性神经元家族中数量最多的成员，例如，在这些神经元占据的如大脑皮层结构等脑部区域释放神经递质谷氨酸的神经元。它们的丰富存在表明锥体神经元在神经系统的功能运作以及认知处理中发挥着关键作用。锥体神经元约占哺乳动物大脑皮层所有神经元的三分之二，它
1)至aav-12)和100多种来自非人类灵长类动物的血清型(daya,s.和berns,k.i.,2008,clin.microbiol.rev.,21(4):583-593)。此外，美国fda已经批准在至少38种实验中将raav用作载体进行多项不同的人体临床试验。aav缺乏致病性、具有持久性和许多可用的血清型，其在本文所述组合物和方法中作为递送工具用于基因治疗的可能性因此增加了。
[0304]
已构建的重组aav(raav)载体不编码复制(rep)蛋白，并且缺乏频繁的特定位点整合所必需的顺式活性38碱基对整合效率元件(iee)。末端反向重复序列(itr)因是封装所必须的顺式信号，因此保留了下来。所以，目前的重组aav(raav)载体主要作为染色体外元件存在。
[0305]
用于基因治疗的重组aav(raav)载体主要基于aav-2血清型。基于aav-2的raav载体可以转导肌肉、肝脏、大脑、视网膜和肺，需要数周才能达到最佳表达。raav转导的效率取决于每个步骤的aav感染效率，即病毒结合、进入、运输、核进入、脱壳和第二链合成。
[0306]
已经开发有几种增加aav基因组容量或增强基因表达的新颖的aav载体技术。通过利用aav经由在itr中的重组形成头对尾多联体的能力，反式剪接aav载体已被用于增加载体携带异源多核苷酸的能力。在这种方法中，转基因盒在含有充分放置的剪接供体和受体位点的两个raav载体之间拆分。从重组aav分子转录，然后正确剪接mrna转录物，就会产生功能性基因产物。虽然效率略低于raav载体，但反式剪接aav载体可以递送多达9kb的治疗基因，并且已经成功用于视网膜、肺和肌肉中的基因表达。
[0307]
编码本文所述raav的多核苷酸包括scn1a增强子多核苷酸序列。由于其作为增强子的性质，增强子多核苷酸序列的取向，即5'-3'或3'-5'，对其功能无关紧要。因此，增强子序列(例如本文所述的e1-e10，例如e2(pv特异性增强子序列)或e5或e6)可以反向使用，也可以用作反向互补序列。“pv特异性增强子”指本文所述的增强子序列，如本文所述，其靶向并将转基因的表达限制在表达pv的皮层中间神经元(pv-cin)中。
[0308]
此外，增强子不需要相对于其他序列(例如scn1a编码序列)特别间隔。此外，raav多核苷酸可以包括额外的元件，例如，编码报告基因或荧光蛋白等可检测标记物的序列，或诸如可以增加rna稳定性和蛋白质产量的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)等元件。raav多核苷酸亦可以包括启动子，以驱动插入在末端反向重复序列(itr)之间的一种或多种多核苷酸((基因))的转录。聚腺苷酸化信号，例如牛生长激素聚腺苷酸化信号和/或sv40多瘤病毒猿猴病毒40聚腺苷酸化信号，可以作为元件包括在raav多核苷酸中。raav多核苷酸可包括最小启动子，例如人类β-珠蛋白最小启动子(phβg)和嵌合内含子序列(hermeming等,2004,j virol methods,122(1):73-77)。不希望受理论束缚，在单链aav载体dna被宿主细胞dna聚合酶复合物转化为双链(ds)dna之后，itr可以协助在细胞核中形成多联体。因此，施用上述raav可以在该载体被转导至其中的中间神经元细胞的细胞核中形成游离多联体。在成人中间神经元等非分裂细胞中，多联体可能在中间神经元的整个生命周期中在这些细胞内保持不变。优点在于，raav多核苷酸整合到宿主染色体中有可能可以忽略不计或不存在，且这种整合不会改变或影响任何其他人类基因的表达或调控。
[0309]
可以使用本领域的标准和实践技术并使用市售试剂来制备重组aav载体。本领域技术人员应可以理解，在若干临床试验中使用的raav载体已经产生了前景不错的结果。举例而言，正如kotterman,m.a.等人2014,nat.rev.genet.,15:445-451所报导，基于raav的治疗在2012年获得了欧盟的销售许可。在一些实施方案中，质粒载体可以编码所有或一些
众所周知的复制(rep)、衣壳(cap)和腺辅助组分。复制组分包括四个重叠基因，这些基因编码aav生命周期所需的复制蛋白(例如：rep78、rep68、rep52和rep40)。衣壳组分包括衣壳蛋白vp1、vp2和vp3的重叠核苷酸序列，这些序列相互作用形成二十面体对称的衣壳。编码辅助组分并为aav载体提供辅助功能的第二质粒也可以共转染到细胞中。辅助组分包括用于病毒复制的腺病毒基因e2a、e4orf6以及va rna。
[0310]
在一个实施方案中，制备用于本文所述产品、组合物和用途的raav的方法包括：培养包含所述raav多核苷酸表达载体的细胞；培养前述细胞以允许表达多核苷酸，从而在细胞内产生raav；以及从细胞培养物中的细胞和/或细胞培养基中分离raav。此类方法为本领域技术人员所熟知和使用。可以使用常规技术将细胞和细胞培养基中的raav纯化到任意所需的纯度。
[0311]
在一个实施方案中，raav载体含有scn1a受限的增强子多核苷酸序列和编码化学遗传dreadd(只能由人工设计的药物激活的人工设计受体)的序列，例如gq-dreadd受体(hu，j.等，2016,j biol chem,291:7809-7820)，或armbruster等报导的gq-dreadd受体的氨基酸序列(2007,proc natl acad sci usa,104:5163-5168)。gq-dreadd受体的氨基酸序列是人类毒蕈碱乙酰胆碱受体m3的氨基酸序列的衍生物，其中位置149的酪氨酸被半胱氨酸取代，位置239的精氨酸被甘氨酸取代。未经修饰的人类序列的ncbi编录号为np 000731.1。在一个实施方案中，可以对raav载体中编码gq-dreadd受体的多核苷酸序列进行修饰，例如，通过包括用于在人类中间神经元中表达gq-dreadd受体的优化密码子。
[0312]
在一个实施方案中，raav载体包含scn1a受限的增强子多核苷酸序列和编码化学遗传psam的序列。
[0313]
具有小型(约5kb)基因组的重组aav载体可以工程化成封装和包含更大的基因组(转基因)，例如大于4.7kb的基因组。举例而言，两种封装较大量遗传物质(基因、多核苷酸、核酸)的方法包括分裂aav载体和片段aav(faav)基因组重组(hirsch,ml等，2010，mol ther 18(1):6-8；hirsch,ml等,2016,methods mol biol,1382:21-39)。经分裂的raav载体的应用利用了raav基因组在细胞转导后的自然串联和其作为增强同源重组(hr)的底物(hirsch,ml等,2016,methods mol biol,1382:21-39)。这种方法包括将大的转基因“分裂”成两个单独的载体，并在共转导后经由hr或非同源末端连接(nhej)发生通过载体基因组串联进行的细胞内大基因重建。raav分裂方法通常包括三种策略：重叠、反式剪接和混合反式剪接。
[0314]
片段aav(faav)作为aav介导的大基因递送的方法是基于以下报告开发的：尝试包封超出aav衣壳封装能力的转基因盒导致封装了两种极性的异质单链基因组片段(《5kb)。经由多个faav颗粒转导后，基因组片段可以先后进行相反链退火和宿主介导的dna合成，以在细胞内重建预期的超大基因组。(hirsch,m.l.等，2016,methods mol biol,1382:21-39)。
[0315]
本文所述载体、组合物与方法的优点和益处在于对足够小的增强子元件(顺式作用元件)的识别和使用，该些增强子元件能够将基因表达特异性地限制到确定的细胞群，例如中间神经元细胞。在一个实施方案中，增强子元件是本文所述的e1-e10增强子序列中的至少一个，其具有scn1a特异性，并将scn1a基因等基因的表达限制到中间神经元细胞，例如gaba能中间神经元和表达pv的gaba能中间神经元，或谷氨酰胺能锥体神经元等锥体神经
元。由本文所述raav载体递送的基因(转基因)在表达它们的特定细胞中具有活性和功能，即产生它们编码的产物，并由细胞功能性地表达。作为具体示例，本文所述raav载体经工程化以包含将报告基因或scn1a等转基因的表达特异性地限制到gaba能中间神经元细胞或表达pv的gaba能皮层中间神经元细胞的增强子序列。该raav载体转导这些特定的细胞类型、经编码的报告基因蛋白质或scn1a中的nav1.1钠通道，并在特定细胞类型中功能性地表达。作为另一个具体示例，本文所述raav载体经工程化以包含将报告基因或scn1a等转基因的表达特异性地限制到如大脑皮层中的谷氨酰胺能锥体细胞等锥体细胞中的增强子序列。
[0316]
另一个优点是，所述scn1a特异性增强子控制元件e1-e10的大小/长度(kb)，例如小于大约2kb，允许它们和其他效应子元件多核苷酸序列，例如，报告基因多核苷酸、dreadd和转基因，一起插入raav载体。举例而言，考虑到报告基因元件(例如增强型绿色荧光蛋白(egfp)、橙色荧光蛋白(dtomato))单独或与平均分别约为700bp到2kb的效应子或报告基因元件(例如通道视紫红质(chr2)或dreadd)一起使用时的规定最小尺寸，封装容量中最大约2kb保留给插入raav载体的顺式作用dna控制元件，例如增强子序列。本文中识别和所述的scn1a限制性增强子序列能够将表达限制到特定的细胞群，例如中间神经元或gaba能中间神经元，或锥体神经元细胞，并且尺寸小到足以容纳额外的核酸序列、报告基因元件和转基因，也可以被克隆到aav载体中。
[0317]
细胞特异性aav衣壳
[0318]
显示选择性组织/器官靶向的aav载体的合理设计已将aav的应用拓宽至用作基因治疗的载体/媒介物。直接和间接靶向方法已被用于增强aav载体细胞靶向特异性和重新靶向。举例而言，直接靶向时，靶向特定细胞类型的aav载体由已经直接插入病毒衣壳序列的小肽或配体介导。该方法已成功用于靶向内皮细胞。直接靶向需要详细了解衣壳结构，以便肽或配体处在暴露于衣壳表面的位点；插入不会显著影响衣壳结构和组装；而且天然向性遭消融以最大限度地靶向特定细胞类型。间接靶向时，aav载体靶向由与病毒表面和特定细胞表面受体相互作用的缔合分子介导。此类用于aav载体的缔合分子可以包括双特异性抗体和生物素。间接靶向的优点在于，不同的适配子可以在不显著改变衣壳结构的情况下偶合到衣壳上，而且可以很容易地消融天然向性。使用适配子进行靶向的一个缺点是可能会降低体内衣壳-适配子复合物的稳定性。
[0319]
此外，可以生产包含衣壳的aav载体，细胞转导和通过脉管系统转移到中枢神经系统和大脑的基因得以增加(chan,k.y.等，2017，nat.neurosci.,20(8):1172-1179)。此类载体促进包括中间神经元在内的神经元细胞的稳健转导。当与增强子和细胞型特异性启动子一起使用时，此类aav在神经系统的神经元细胞中提供靶向基因表达。
[0320]
对于不需要每个细胞都拥有高表达水平的应用，可以降低使用的病毒量，即病毒剂量。降低用于全身基因递送的病毒载量可以减低成本和生产负担，并把对病毒性组分的不良反应的潜在风险降至最低。
[0321]
重组腺相关病毒性载体的递送和治疗方法
[0322]
一般而言，可使用病毒性或病毒性载体(例如aav或raav)等适当且有效的载体递送效应基因，实现从基因层面治疗神经系统疾病的目的，例如通过修饰或校正基因表达，或通过基因治疗等。使用raav载体可以把治疗基因有效地到递送到表达这些基因的细胞里。虽然其他将基因递送至细胞的方法和方式包括，例如，在流体动力学压力下使用纯化的
dna、使用粘附在金颗粒上的dna或脂质-dna复合物的鸟枪法，但此类方法和方式通常无法有效地递送基因，导致基因表达低于治疗效果所需的水平。此外，此类方法不适用于人类使用。另一方面，病毒代表了在体内宿主细胞中递送和表达外源基因的天然载体。
[0323]
与使用raav作为病毒性载体相关的一个优势是，raav转基因表达通常持续数年或终生，该优势已经在动物模型中得到了证明。与之相反，非raav病毒性载体通常会导致转基因表达在初始时爆发，但这种爆发通常会在相对较短的时间(例如数周)后消失。
[0324]
为了强化治疗或处置，可以通过使用特定raav血清型等方式减少治疗反应所需的raav载体剂量。或者，可以改变raav载体衣壳的表面以包含用于附着到如上所述靶组织和细胞的特异性配体。另一种方法考虑到了病毒颗粒从内质囊泡到细胞核的运输(zhao,w.等,2007,gene ther.,14:545-550；daya,s.和berns,k.i.，2008，clin.microbiol.rev.,21(4):583-593)。通常，raav载体制剂的病毒颗粒与传染性的比率范围为10:1至100:1。高比率反映了不完整或空的载体颗粒，以及从胞质囊泡到细胞核的运输。在运输过程中，载体颗粒可能会泛素化并被定向到蛋白酶体进行降解，而不是进入可以表达转基因的细胞核。已经发现泛素化和蛋白酶体定向需要将raav载体衣壳表面的酪氨酸残基磷酸化。当aav-2衣壳表面的七个酪氨酸残基被苯丙氨酸残基取代后，检测转基因表达所需的感染复数(moi)在细胞培养物和在肝脏与眼睛细胞转导的多个小鼠模型中都大幅降低。因此，可以增强在疾病治疗中将转基因表达增加到治疗水平的能力。
[0325]
本文所述治疗产品、组合物和方法包括一种或多种控制癫痫发作治疗方法，其中包括最先进的基因治疗或药物遗传学方法。此类方法可能会促成临床相关疗法的开发，以减轻ds的癫痫发作症状。
[0326]
若需直接递送至大脑，raav载体可以通过开放式神经外科手术或局部注射施用，从而绕过血脑屏障，在时间和空间上限制转基因表达，并靶向大脑的特定区域，例如中间神经元细胞和包含这些细胞的脑组织。
[0327]
(通过静脉注射的)全身性raav递送提供了一种向神经系统广泛递送基因的非侵入性替代方法，但其所需的高病毒载量和相对较低的转导效率限制了该方法的广泛使用。数个团体已经开发出了可以在静脉递送后增强基因向cns及特定组织和细胞群转移的raav衣壳。例如，aav-as capsid18利用aav9.4719 vp2衣壳蛋白的聚丙氨酸n端延伸来提供更高的神经元转导，尤其是在纹状体中的神经元转导。基于aav2的aav-br1 capsid20可用于更有效和更具选择性的脑内皮细胞的转导。另一种aav衣壳，即aav-php.b，包括在静脉注射后将成年小鼠大脑和脊髓中众多区域内的大部分神经元和星形胶质细胞进行转导的衣壳。在一个实施方案中，raav包括特异性转导大脑皮层中包括pv中间神经元在内的中间神经元的衣壳。
[0328]
施用raav载体的其他方式可能包括脂质介导的载体递送、流体动力学递送和基因枪。在一个特定的实施方案中，该raav载体包括增加直接感染或转导中间神经元细胞的可能性的衣壳，该些中间神经元细胞如gaba能中间神经元细胞和表达pv的gaba能中间神经元细胞，或谷氨酰胺能锥体细胞等锥体细胞，以及包括该些细胞的脑组织。
[0329]
本文所述的病毒性载体及其组合物可用于治疗神经系统、神经发育和神经退行性疾病和病症，特别是用于治疗ds。ds包括癫痫症及伴随而来的发作症状，通常是严重的发作症状。区分发作类别的一个特征是确定发作活动是部分性(例如局灶性)还是全身性的。在
一个实施方案中，本文所述的病毒性载体及其组合物用于治疗部分性和/或全身性发作。一般认为，部分性发作指发作活动仅限于大脑皮层的离散区域。本领域技术人员应可理解，若在发作过程中完全保留意识则为单纯部分性发作。如果意识受损，则为复杂部分性发作。复杂部分性发作还包括那些开始时为部分性发作但随后扩展到大脑皮层的发作。因此，这些类型的发作被视为具有继发性全身性发作的部分性发作。
[0330]
全身性发作以双侧对称的方式同时包括大脑远端区域，并且可能包括突然而短暂的意识丧失，例如在失神或小发作的情况下，但不会丧失姿势控制。非典型失神发作通常包括更长时间的意识丧失和较平缓的发作和终止。全身性强直阵挛或大发作被视为全身性发作的主要类型，通常在没有预警的情况下突然发作。初始阶段通常包括肌肉强直收缩、呼吸受损、交感神经张力显著增强导致心率加快、血压上升和瞳孔放大。大约10-20秒后，发作的强直阶段通常演变为阵挛阶段，这是由强直肌肉收缩与肌肉松弛期叠加产生的。肌肉松弛的时间逐渐增加直到发作期结束，通常持续不超过一分钟。发作后阶段的特征是反应迟钝、肌肉无力和唾液过度分泌，可导致喘鸣呼吸和气道部分阻塞。
[0331]
无张力发作的特征是姿势性肌肉张力突然丧失，持续约1-2秒。虽然意识短暂受损，但通常没有发作后意识模糊。肌阵挛发作的特征是突然而短暂的肌肉收缩，可能涉及身体的一部分或整个身体。非限制性地，本文所述的raav产品、组合物及其使用方法包括上述发作的预防性和/或治疗性处置，包括折磨ds患者的发作。在一个实施方案中，本文所述的raav产品、组合物及其使用方法用于预防和/或治疗性处置与scn1a基因编码的钠通道nav1.1的功能丧失或功能受损相关的癫痫症。在一个特定的实施方案中，本文所述的raav产品、组合物及其使用方法用于预防和/或治疗性处置德拉韦综合征(ds)。在另一个实施方案中，本文所述的raav产品、组合物及其使用方法用于预防和/或治疗性处置药物抗性癫痫，药物抗性癫痫是指尽管使用两种或以上适于治疗此类癫痫症的药物，而且药物施用已达最大耐受剂量(mtd)，但仍无法控制的癫痫病况。在一些实施方案中，药物抗性癫痫包括发作未能通过先前的抗癫痫药物治疗或治疗组合消除的病症。
[0332]
药物遗传学方法
[0333]
考虑将药物遗传学方法与本文所述的病毒性载体、raav载体、其组合物以及方法一起使用。药物遗传学方法特别使用病毒性载体将gq-dreadd受体或psam递送至pv中间神经元，该病毒性载体如包含本文所述增强子元件(例如e1-e10)以及编码gq-dreadd受体或psam的多核苷酸的raav载体。无论是在局部注射后的特定区域还是全身性注射后的整个皮层，具体取决于要治疗的病状类型，被靶向的pv神经元均稳定表达受体gq-dreadd或psam。此后，向个体(患者)施用激活该受体的药物(例如分别为cno或psem)。这种方法对表达受体的pv中间神经元的兴奋性造成受控改变，并可以对神经元(中间神经元和pv表达中间神经元)中兴奋/抑制(e/i的)的平衡进行与剂量和时间相关的调节，从而让大脑活动正常化。
[0334]
药物组合物
[0335]
本文还提供了用于治疗患有ds等神经系统或神经遗传疾病、病症或病状或面临患上前述疾病风险的受试者的药物组合物或制剂。在一个实施方案中，该药物组合物包括aav载体或病毒颗粒，例如含有如本文所述scn1a特异性增强子序列((作为活性剂))和药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂的载体或病毒颗粒。配制成药物组合物时，raav载体可用作治疗化合物或产物，与药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
[0336]
治疗剂可以以任何适当的量包含在合适的载体物质中，按重量计，治疗剂的量通常占组合物总重量的1-95％。组合物可以以适合肠胃外(例如皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内)施用方式的剂型提供，从而全身性递送如本文所述病毒性载体等试剂。在一个实施方案中，如本文所述raav载体的全身性注射允许表征跨越脑部各区域的表达特异性，特别是当报告基因产物也由该载体编码时。药物组合物可根据常规药学惯例配制(参阅，例如，由ar gennaro编著，lippincott williams&wilkins于2000年发行的remington:the science and practice of pharmacy(第20版)，以及由j.swarbrick和jc boylan编著，纽约marcel dekker出版社于1988-1999年发行的encyclopedia of pharmaceutical technology)。
[0337]
药物组合物可配制成在施用后立即或在任何预定时间或施用后的时间里释放活性剂。后两种类型的组合物通常被称为控释制剂，其包括(i)较长时间内在体内产生浓度基本恒定的制剂；(ii)在预定的滞后时间过后的较长时间内在体内产生药物浓度基本恒定的制剂；(iii)通过在体内维持相对恒定且有效的水平，同时将与活性物质血浆水平波动相关的不良副作用(锯齿状动力学模式)最小化，从而在预定时间段内维持作用的制剂；(iv)通过例如将控释组合物在空间上放置在邻近或接触目标位点或位置，例如，在组织或器官的区域中，来定位作用的制剂；(v)方便给药的制剂，例如每一周、两周或几周给药一次；(vi)使用载体、化学衍生物或专门设计的载体(例如，包含特定衣壳组合物)靶向特定组织或细胞类型，以将治疗剂递送至例如中间神经元或表达pv的gaba能中间神经元，或谷氨酰胺能锥体神经元等锥体神经元的制剂。就一些应用而言，控释制剂避免了在白天频繁给药以将所施用药剂的血浆水平维持在治疗水平的需要。
[0338]
获得释放速率超过药剂代谢速率的控制释放的方法并不具限制性。举例而言，可以通过适当选择各种制剂参数和成分，包括控释组合物和包衣，来获得控制释放。因此，将治疗剂与合适的赋形剂一起配制成药物组合物，该组合物在施用后以受控方式释放药剂。示例包括单个或多个单位的片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、微球、分子复合物、纳米颗粒、贴剂和脂质体。
[0339]
只要治疗剂与其他成分组合时的浓度能有效地改善、减轻、降低、减少或稳定受试者的癫痫发作，可以用任意适合的方式施用包含用于治疗ds等神经系统疾病或病症的药剂组合的组合物。该组合物可以全身性施用，例如配制在药学可接受的缓冲液如生理盐水中。在一个实施方案中，本文所述raav载体的全身性注射允许表征跨大脑各区域的表达特异性，特别是当报告基因产物也由该载体编码时。
[0340]
施用方式包括，例如，颅内、肠胃外、皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、肌肉内(i.m.)或皮内给药，例如通过注射可以最佳的方式在患者体内提供连续且持续的药剂水平。待施用的治疗剂的用量因施用方式、患者年龄、身体状况和体重，以及ds等神经系统疾病或病症的临床症状而异。尽管在某些情况，如果药剂表现出增强的特异性，使用量相对较低，但用量通常在用于治疗神经系统疾病和病症，特别是脑部的该些疾病时使用的以病毒性载体为基础的药剂的数量范围内。组合物施用的剂量需显示治疗效果，例如改善、减轻、降低、减少或稳定患者的癫痫发作，该剂量可用本领域技术人员熟知的方法来确定。
[0341]
药物组合物可以剂型、制剂或通过含有常规无毒药学可接受载体和佐剂的合适递送装置或植入物以肠胃外注射、输注或植入(皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、颅内等)的方式施用。此类组合物的制剂和制备为药物制剂领域技术人员所熟知，并且可以在，例如
remington：the science and practice of pharmacy(同上)中找到。在特定的实施方案中，施用是全身性且在肠胃外进行的，例如通过注射或静脉内递送。
[0342]
肠胃外递送和施用的组合物可以单位剂型(例如，在单剂量安瓿中)提供，或在包含若干剂量且其中可以添加合适防腐剂的小瓶中提供(见下文)。组合物可以是溶液、悬浮液、乳液、输注装置或用于植入的递送装置，或者它可以作为干粉存在，在使用前用水或另一种合适的媒介物重构。除了活性剂(例如，如本文所述，包括增强子序列和编码效应基因及相关调控序列的多核苷酸的病毒性载体或颗粒)，组合物也可以包括合适的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。活性治疗剂可包含在微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中以用于控制释放。此外，该组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、ph调节剂、张力调节剂和/或分散剂。
[0343]
在一些实施方案中，包含活性治疗剂(即，本文所述病毒性载体或颗粒)的组合物被配制成用于静脉递送。如上所述，根据所述实施方案的药物组合物可以是适合无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，将合适的治疗剂溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体媒介物中。可以使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、加入适量盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲剂后调节至具有合适ph的水、1,3-丁二醇、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和葡萄糖溶液。水性制剂还可以包含一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在其中一种试剂仅微溶于水的情况下，可以加入溶解促进剂或增溶剂，或者，溶剂可以包括10-60％w/w的丙二醇等。
[0344]
施用和递送方式
[0345]
将本文所述病毒性载体或药物组合物施用至受试者，例如患有ds的患者或婴幼儿患者。在一些实施方案中，病毒性载体、病毒性颗粒或药物组合物可以任意方式递送至细胞(靶细胞，例如中间神经元或包含中间神经元的脑层)，只要该病毒性载体、颗粒或组合物功能正常且具有活性，从而表达包含在载体或病毒颗粒的序列即可。举例而言，可以将包含scn1a特异性增强子和效应基因(例如scn1a)多核苷酸序列的raav递送至中间神经元细胞或包含中间神经元细胞的组织，从而提供scn1a在中间神经元中的靶向表达。因此，通过将细胞与包含病毒性载体或病毒性颗粒的组合物接触，以及通过病毒性载体或病毒性颗粒所携带的多核苷酸在细胞中的异源表达，可将病毒性载体或病毒颗性粒递送至细胞。raav载体包含的多核苷酸必须以可以被吸收的形式递送至受试者的细胞，以便可以产生治疗有效水平的编码产物。
[0346]
转导raav载体用于将编码所需蛋白质、多肽或肽的基因递送至细胞并表达，特别是因为转导raav载体具有高感染效率和稳定的整合与表达(参阅，例如cayouette等,human gene therapy,8:423-430,1997；kido等,current eye research,15:833-844,1996；bloomer等,journal of virology,71:6641-6649,1997；naldini等,science,272:263-267,1996；以及miyoshi等,proc.natl.acad.sci.usa,94:10319,1997)。举例而言，raav经工程化成包含编码本文所述scn1a特异性增强子核酸序列的多核苷酸，该序列优先指导特定中间神经元细胞类型中的基因表达，并用于指导和限制gaba能中间神经元靶细胞或谷氨酰胺能锥体细胞等锥体靶细胞中的基因表达，例如scn1a。在一个实施方案中，基因的表达可以由任何合适的启动子驱动，例如靶细胞特异性启动子。在一个实施方案中，全身性施用raav载体。在一个实施方案中，如本文所述raav载体的全身性注射允许表征跨大脑各区域
的表达特异性，特别是，例如，当报告基因产物也由该载体编码时。
[0347]
也可以使用体外转染方法实现基因转移。此类方法包括使用磷酸钙、deae葡聚糖、电穿孔和原生质体融合。脂质体也可能有利于将dna递送到细胞中。
[0348]
治疗方法和方案
[0349]
本发明提供了向有需要的受试者施用治疗剂的方法，所述受试者例如患有、正在经历、已经经历和/或有风险经历神经系统疾病或病症，更具体地，癫痫发作、癫痫或ds的受试者，以及也可能被诊断患有或疑似患有癫痫病症或具有癫痫病症的症状，或被鉴定为需要此类治疗的受试者，其中本文所述病毒性载体或病毒颗粒，或本文所述组合物以治疗有效的量施用于受试者，以产生治疗效果。根据所述方法，治疗效果包括但不限于引入足够数量的中间神经元以抑制、减少或改善神经系统疾病或病症(例如，癫痫发作或癫痫)的一种或多种症状的raav的量，或在向受试者施用raav载体产品或组合物后预防一种或多种症状。施用的raav的量可由本领域技术人员确定，例如开业医生或临床医生，而且如本领域技术人员所理解，基于诸如癫痫病灶的大小、病毒制剂的滴度和从非人类灵长类动物中获得的数据等因素(例如，colle,m.-a.等，2010，hum.mol.genet.,19:147-158)。举例而言，10
10
至10
12
个raav颗粒可能会被用于将raav载体或其颗粒转导至治疗相关数量的中间神经元。识别需要此类治疗的受试者可以由受试者或医疗保健专业人员判断，而且可以是主观的(例如意见)或客观的(例如可通过测试或诊断方法衡量)。
[0350]
治疗方法(包括预防性治疗)通常包括向有需要的受试者(例如动物、人类)，包括哺乳动物，尤其是人类，施用治疗有效量的药剂，例如raav载体、病毒颗粒，或包含前述药剂的组合物。此类治疗将适当地施用于遭受、患有、易患，或有风险患有神经系统疾病或病症，例如癫痫发作和/或癫痫或ds的受试者，特别是人类或婴幼儿。可以通过诊断测试或受试者或医疗保健服务人员的意见(例如，基因测试、酶或蛋白质标记物或生物标记物、家族史等)来客观或主观地确定“有患病风险”的受试者。
[0351]
所述病毒性载体和药物组合物可用于治疗性地处置患有神经系统或神经退行性疾病或病症，例如癫痫发作、癫痫或ds的患者，或预防性地为处于某些神经系统或神经退行性疾病或病症风险中的患者提供预先治疗或保护，例如预防性疫苗接种以降低、减少、减轻或防止癫痫发作、癫痫、ds的一种或多种症状，或其严重性。本文所述raav载体的预防有效量无限制之意，可以在每千克受体体重约102tu(转导单位)至约10
20
tu之间，或这两个值之间的任意tu。癫痫发作和ds的小鼠模型可用于优化剂量和治疗方案。
[0352]
可将有效量的本文所述治疗载体施用至有需要的受试者，以使scn1a缺陷型中间神经元的兴奋性正常化，并减轻德拉韦综合征(ds)的癫痫发作和发作症状。本文所述载体和方法对于患有或有风险患有一种或多种癫痫发作和/或ds的个体(例如人类婴儿、儿童或成人)可能具有治疗价值。在一个实施方案中，将本文所述的raav或包含raav的组合物施用于其中间神经元在施用时不表达编码nav1.1钠通道的scn1a基因，或显示该基因的功能或表达丧失的个体。前述nav1.1钠通道的表达依赖于scn1a特异性增强子，例如本文所述的e1-e10。在一个实施方案中，scn1a在由包含scn1a限制性增强子序列的所述raav载体转导的中间神经元细胞中的表达使scn1a缺陷或异常表达的中间神经元的兴奋性正常化。在一个实施方案中，将包含本文所述raav载体的组合物施用于其中间神经元不再表达scn1a基因的个体。在一个实施方案中，将包含如本文所述raav载体的组合物施用于至少一个月大
的个体。在一些实施方案中，该个体的年龄至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18岁。
[0353]
受试者，例如哺乳动物受试者以及施用了本文所述raav载体的人类患者，也可受益于辅助或额外的治疗或治疗性化合物或药物，例如抗癫痫疗法，包括但不一定限于与其他抗癫痫治疗剂和/或本领域技术人员熟知的手术技术一起使用。举例而言，可与本文所述治疗产品和组合物联合使用的抗癫痫药(aed)，包括但不限于乙酰唑胺、布立西坦、卡马西平、氯巴占、氯硝西泮；醋酸艾司利卡西平、乙琥胺、加巴喷丁、拉科酰胺、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡西平、吡仑帕奈、苯巴比妥、苯妥英、普瑞巴林、扑米酮、卢非酰胺、丙戊酸钠、司立喷醇、噻加宾、托吡酯、丙戊酸(又称convulex、epilim chrono、epilim chronosphere)、氨己烯酸和唑尼沙胺。
[0354]
试剂盒
[0355]
本发明还提供了用于预防或治疗有需要的受试者的神经系统或神经精神疾病、病症或病状，例如癫痫发作和/或癫痫，以及德拉韦综合征(ds)症状的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒提供了一种包含有效量的本文所述raav载体或病毒颗粒的治疗性或预防性组合物，该载体或病毒颗粒包括scn1a基因特异性增强子多核苷酸序列，该序列将scn1a基因的表达，例如，包含在病毒性载体中的scn1a基因，限制到包括脑部(如端脑)gaba能中间神经元细胞在内的中间神经元细胞，或大脑皮层谷氨酰胺能锥体细胞等锥体细胞，或vip细胞。在一个实施方案中，scn1a特异性增强子是如本文所述的e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、e8、e9或e10人类增强子序列。在一个实施方案中，scn1a特异性增强子是e2人类增强子多核苷酸序列。在一个实施方案中，scn1a特异性增强子是e5人类增强子多核苷酸序列。在一个实施方案中，scn1a特异性增强子是e6人类增强子多核苷酸序列。
[0356]
在另一个实施方案中，该试剂盒提供包含有效量本文所述raav载体或病毒颗粒的治疗或预防组合物。该载体或病毒颗粒包括对神经元或中间神经元，尤其是表达pv的神经元中表达的基因具有特异性的e11-e35增强子多核苷酸序列，特别是人类e11-e35序列。
[0357]
在一些实施方案中，该试剂盒包括含有治疗或预防组合物的无菌容器；该容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他合适的容器形式。容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合盛放药物的材料制成。
[0358]
本发明提供了包括包含至少一个本文所述scn1a特异性增强子多核苷酸序列的raav载体的组合物，以及向患有或有风险患有癫痫发作、癫痫或ds的受试者施用该组合物的说明书。在一个实施方案中，该raav载体包含在中间神经元细胞中表达的scn1a转基因，所述中间神经元细胞包括gaba能中间神经元和表达pv的中间神经元，或锥体细胞，例如谷氨酰胺能锥体细胞。说明书通常包括关于使用组合物治疗或预防癫痫发作、癫痫或ds的信息。在其他实施方案中，说明书包括以下至少一项：治疗剂(包含scn1a特异性增强子多核苷酸序列的raav等)的描述；用于治疗或预防缺血或其症状的剂量方案和施用；预防措施；警告；适应症；禁忌症；用药过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。说明书可以直接印在容器上(若有)，或是贴在容器上的标签，或是放在容器中或与容器一起提供的单独纸张、小册子、卡片或文件。
[0359]
其他实施方案及其优势
[0360]
了解和开发治疗神经系统病症的方法源于所涉及的神经元类型的复杂性。开发本
文所述实施方案的产品和方法的目的在于解卷积疾病基因或疾病相关基因的细胞作用。因此，系统地解剖了scn1a基因座，从而识别出了10个不同的增强子元件(增强子e1-e10)，特别是人类增强子元件及其序列，这些增强子元件被发现分布在scn1a基因的内含子和基因间区域(图3d)。通过创建其表达依赖于这些增强子中的每一个的aav，识别出了至少三个概括scn1a基因表达全局模式的增强子，例如，e2(用于pv特异性表达)、e6(用于vip特异性表达)和e5(用于与锥体层5相关的表达)。其他七个元件(例如，e1、e3、e4、e7、e8、e9和e10)都对gad1具有高度特异性，标记了一系列中间神经元亚群，并且可以构建不同的亚型组合。在一个特定的实施方案中，e2增强子元件被证实为对特定的cin亚型具有选择性，即表达pv的快速尖峰细胞。由于scn1a表达的丧失与pv cin功能障碍特别相关，e2增强子因此被证明特别擅长选择性靶向该细胞群，该细胞群不仅存在于啮齿动物中，还存在于包括人类在内的各种灵长类动物中。此外，e2增强子已确定可用于研究pv cin功能的各个方面，包括但不限于连接性、监测兴奋性和利用光遗传学操作pv cin活性。e2增强子在一系列物种中的效用展示突出了该方法提供的基础和临床应用的广度。e2增强子的其他用途包括，例如，更广泛的回路探索(例如，使用狂犬病等重组病毒创建用于单突触追踪的起始细胞)、细胞类型特异性基因功能丧失(例如crispr)和靶向药物筛选。此外，e2增强子的使用提供了一种试剂，用于研究pv cin的数量、分布或生理特性方面的物种特异性差异。推广到其他细胞类型，该方法有利于研究一系列物种，最显著的是灵长类动物和人类。
[0361]
如本文所述，系统地检查特定疾病位点(例如scn1a基因位点)的增强子的策略成功地识别出了表达该基因的每种细胞类型的关键调控元件，从而突显了该方法的益处。该方法既阐明了控制scn1a基因表达的调控景观，又提供了一个工具包，用于操作表达scn1a基因的细胞的不同亚群。
[0362]
许多与scn1a基因座相关的snp映射到内含子1。在特定的实施方案中以及如本文所述，已识别出对表达scn1a群具有高度特异性的三个增强子，即e2、e5和e6，这三个增强子就位在该区域内。不希望受理论限制，已识别出的snp可能代表这些增强子中影响scn1a表达的突变。据文献资料报告，gtex数据显示这些增强子中的多个eqtl与人类scn1a表达的改变相关(auget,f.等,2017,nature,550:204-213)。e2尤其值得注意，因为从前脑中间神经元中有条件地去除scn1a已被证明可以概述小鼠的癫痫发作表型。由于scn1a表达大部分被限制到表达pv的中间神经元亚群，e2增强子的突变可能是德拉韦综合征的直接原因。
[0363]
检查回路成熟的早期动力学的一大障碍是，不使用转基因动物就无法访问特定的细胞类型。即使采用复杂的基因策略，仍特别难以靶向年轻的pv cin。鉴于pv-cin丰富的数量(占所有抑制型cin的40％)以及对神经发育障碍的影响，在pv表达开始前访问这些细胞是该领域的优先事项。e2增强子在这些发育阶段的特异性和病毒注射的使用为了解pv cin等神经元细胞类型的正常发育及其在神经或神经精神疾病中的作用提供了试剂和工具。在一个实施方案中，e2增强子提供了用于研究pv-cin的正常发育及其在疾病中的作用的试剂。此外，e2增强子以及本文提供的其他增强子元件可用于靶向特定细胞，并且有利于治疗疾病，例如包括德拉韦综合征在内的神经元疾病。
[0364]
在其他实施方案中，本文识别和描述的增强子提供了访问具有不同临床相关性的特定细胞群的途径。举例而言，使用这些增强子来缓解德拉韦综合征令患者衰弱的方面，例如，通过基因治疗或通过调节神经元活性，例如通过光遗传学或化学遗传学方法((参阅，例
如，walker,m.c.等,2019,neuropharmacology,107751.doi:10.1016/j.neuropharm.2019.107751.review.pmid:31494141))。如本文所述和证明，局部和全身性注射可用于将病毒有效递送至大脑，从而提供用于临床干预的递送和施用方法。举例而言，局部注射(例如，携带增强子元件和靶多核苷酸的重组病毒)可用于减轻局灶性癫痫、前额叶皮层功能障碍或海马记忆障碍。在需要全局干预的情况下，病毒可以系统性施用或递送，例如，矫正全身性癫痫发作或精神和神经退行性病症。根据本文描述和示例的实施方案，调控元件的严格识别允许访问特定细胞类型。这样的元件用于实验和治疗程序及方法是有益处的。
[0365]
除非另有说明，否则前述实施方案的执行采用了分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术都在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有充分的解释，例如《分子克隆：实验室手册》，第二版(sambrook，1989)；《寡核苷酸合成》(gait,1984)；《动物细胞培养》(freshney,1987)；《酶学方法》；《实验免疫学手册》(weir，1996)；《哺乳动物细胞的基因转移载体》(miller和calos，1987)；《分子生物学实验室操作程序手册》(ausubel，1987)；《pcr：聚合酶链反应》(mullis,1994年)；《免疫学实验室操作程序手册》(coligan,1991)。这些技术适用于生产多核苷酸、病毒性载体和病毒颗粒，因此，可以在设计和执行本文所述实施方案时考虑这些技术。特定实施方案中特别有用的技术将在接下来的部分中讨论。
[0366]
为向本领域技术人员完整公开和描述如何制造并使用本文所述产品、组合物和治疗方法，特提供下列实施例供参考。该些实施例无意限制本文描述和示例内容的范围。
[0367]
实施例
[0368]
实施例1：识别将报告基因和效应基因的表达限制到表达pv的皮层中间神经元细胞群的顺式调控序列(pv中间神经元特异性增强子序列)
[0369]
scn1a是编码nav1.1钠通道的基因，在大脑皮层多个不同神经元群中表达，其中包括三个非重叠神经元群：表达小清蛋白的快速尖峰形成皮层中间神经元(pv cin)、表达血管活性肠肽的去抑制皮层中间神经元(vip cin)和第5层锥体神经元。在一个特定的实施方案中，scn1a在表达pv的皮层中间神经元中表达。scn1a备受瞩目的原因在于其功能的丧失与德拉韦综合征相关联，德拉韦综合征是一种早发性和顽固性癫痫性脑病，其特征是早发性癫痫发作。更具体地说，scn1a单倍剂量不足或致病变体引发德拉韦综合征。
[0370]
开发并设计了一种综合方法来系统性地识别scn1a基因座内的候选增强子，作为靶向表达该基因的不同皮层群的基因策略。根据以下三个标准选择调控序列。首先，因为已经假定增强子和基因转录起始位点(tss)的距离与表达水平直接相关，因此检查了scn1a最接近其tss的基因间和内含子区域，以识别能够驱动转基因功能水平的增强子。其次，由于给定细胞类型中活性增强子的位置与染色质开放性相关，因此使用dlx6a
cre
；sun1-egfp转基因小鼠收集视觉皮层的中间神经元，以评估表达scn1a的细胞群的染色质景观。给定细胞类型中活性增强子的位置与染色质开放性和dna低甲基化相关。
[0371]
分离细胞核后，使用snapatac分析管道(详参下文“方法”一节)进行单细胞atac-seq分析(参阅，例如buenrostro,jd等,nature,523:486
–
90(2015)；和cusanovich,da等,science,348:910
–
4(2015))，以确定四个主要类别的皮层中间神经元中每一个类别内开放性相异的染色质区域，前述皮层中间神经元包括scn1a表达水平最高的pv cin、vip cin和锥体神经元(图3a-3c和图12)。第三，由于调控元件承受正选择压力，因此能够在包括人类
在内的哺乳动物物种中识别出高保守性最高的序列。因此，为了确定和分离具有治疗潜力的增强子，评估了进化过程中高度保守且靠近scn1a tss的10个选择性开放的内含子和基因间区域，例如本文所述的e1-e10(图3d以及图15a-1、15a-2、16a-1和16a-2)。
[0372]
为了检查候选增强子靶向表达scn1a的神经元群的能力，每个增强子序列均被插入raav骨架中，该骨架包含红色荧光报告基因(raav-e[x]-dtomato)上游的最小启动子。然后，在这些构建体的基础上使用phpeb衣壳产生raav(chan,k.y.等,nat.neurosci.,20:1172
–
1179(2017))并将其全身性地注射到成年小鼠体内。3周后，所有病毒都在皮层及多个大脑区域内表现出强烈而稀疏的表达。除e5外，绝大多数病毒标记的细胞均表达了泛中间神经元标记物gad1。然而，皮层神经元内pv的共定位程度不尽相同，e2的pv共定位程度高达90％以上，而e6则低于5％，其余的增强子都显示出中等水平的pv特异性(图3e和图7)。此后，进一步检查了由e2、e5和e6增强子捕获的神经元群的标识和层分布。与它们的层分布一致，各种标记物的共定位分析表明，e2调控元件将病毒报告基因的表达限制到pvcin，而e6对vip中间神经元具有选择性。相比之下，e5调控元件虽然在所有层中稀疏标记中间神经元，但却在第5层中显示显著富集的锥体神经元(图3f)。因此，scn1a皮层表达谱的很大一部分反映在三个增强子的集体表达中。因此，这些调控元件在很大程度上解释了具有不同功能和发育起源的中间神经元和神经元群体中的非重叠表达。如本文所述开发的病毒工具提供了解剖神经元亚型的手段，并且可以有利地用于研究它们的正常功能以及在患病皮层的异常。
[0373]
在一个特定方面，将s5e2(e2)增强子元件序列并入包含最小基础启动子和报告基因转基因(例如，d-tomato)或效应基因(例如gq-dreadd)的重组aav(raav)载体，生成名为paav-s5-e2-dtomato的raav载体。通过将含有e2增强子的raav载体全身性地注射到动物(小鼠)中并分析包括皮层在内的大脑结构中已表达的报告基因之间的共定位，评估了e2增强子将报告基因(转基因)的表达限制到脑中表达pv的中间神经元的能力。图2a为显示脑切片中dtomato报告基因的免疫组织化学(ihc)染色分析结果的图像(图示顶部的矢状切面；图示下部的冠状切面)，进行ihc染色分析之前，先将paav-s5-e2-dtomato载体全身性体内注射到动物(小鼠)中，以便检测由该载体转导的特定细胞。图2b的各图像显示了该dtomato报告基因的免疫组织化学(ihc)染色分析结果，进行ihc染色分析之前，先将paav-s5-e2-dtomato载体全身性体内注射到动物(小鼠)中，以便检测表达pv的特定细胞。来自paav-s5-e2-dtomato载体的报告基因表达在脑切片中可视化(图2b，左侧图，红色)。来自paav-s5-e2-gq-dreadd-dtomato的报告基因表达对于gq-dreadd(绿色)和dtomato(红色)可视化(图2b，右侧图)。由载体转导的表达pv的特定细胞的检测也可视化(图2b，左侧图，绿色；图2b，右侧图，蓝色)。
[0374]
候选增强子的识别
[0375]
使用上述增强子序列选择方法，在小鼠基因组中发现了邻近scn1a基因转录起始位点的十个候选增强子序列。这些增强子序列在本文中又称s5e1(e1)、s5e2(e2)、s5e3(e3)、s5e4(e4)、s5e5(e5)、s5e6(e6)、s5e7(e7)、s5e8(e8)、s5e9(e9)和s5e10(e10)，是在scn1a基因附近识别出来的(图1a-1)。本文还提供和描述了对应于e1-e10增强子序列(seq id no:15-24)的人类多核苷酸序列，以及如本文所述的其他人类增强子多核苷酸序列e11-e35(seq id no:25-49)(图1a-2和1a-3)。
[0376]
e1-e10增强子的人类(人类直系同源物)序列是根据小鼠序列与scn1a的人类基因组序列的比对确定的，包括上游和下游100kb，从而识别出两个物种之间高度保守的人类直系同源物序列(图1a-1至1a-3、16a-1、16a-2)。本领域技术人员应可理解，增强子调控元件包含一系列转录结合位点，这些位点在物种间相对保守，但其中散布有在物种间不连续保守的间隔序列。因此，在一个实施方案中，scn1a增强子元件可以构成核苷酸序列，该核苷酸序列包含与本文所述人类多核苷酸(dna)增强子序列具有至少75％或以上序列同一性且超过100bp的任意区域，即e1至e10。在一个实施方案中，scn1a增强子元件构成核苷酸序列，该核苷酸序列包含与人类e2(s5e2)多核苷酸(dna)增强子序列具有至少75％或以上序列同一性且超过100bp的任意区域。就此类增强子序列而言，核酸序列的大小不受限制，只要该序列包含与本文所述人类多核苷酸(dna)e1-e10或e11-e35增强子序列具有至少75％或以上序列同一性的100bp的任意区域即可。与本文所述每个已识别出的增强子序列(35个增强子序列)相关的数据记录在图1a-1至1a-3、15a-1、15a-2、16a-1和16a-2显示的表格中。
[0377]
受e1-e10增强子元件限制的报告基因在小鼠大脑各皮层表达pv的中间神经元中的表达如图1b-1和1b-2所示。图中展示了将paav-s5-e2-dtomato载体全身性注射到动物(小鼠)后脑部切片中dtomato的免疫组织化学(ihc)染色分析。报告基因在大脑皮层表达pv的中间神经元内的表达特异性((图1c))和敏感性((图1d))程度以图表方式量化。该报告基因的表达受包含在raav载体中的e1-e10增强子元件控制。特异性量化为表达病毒性报告基因dtomato的细胞的比例，该病毒性报告基因共表达pv-中间神经元标记物pv，而该量化是在向动物(小鼠)全身性体内注射paav-s5-e2-dtomato载体后，通过脑切片上的免疫组织化学进行评估。柱状图表示平均值 /-，平均值的标准误差。
[0378]
实施例2：小鼠pv皮层中间神经元(pv cin)的病毒靶向
[0379]
e2调控元件对pv cin显示出90％的特异性，这种特异性提供了靶向快速尖峰神经元(例如，篮状细胞和枝状吊灯细胞)的方法，快速尖峰细胞一共占所有皮层(gaba能)中间神经元的40％。这些神经元对局部网络有很强的抑制作用，它们的功能障碍直接与神经系统和神经精神疾病有关，包括德拉韦综合征、局灶性癫痫、自闭症谱系障碍(asd)和精神分裂症。所以，掌控这些神经元的活性对于基础研究和临床应用都特别重要。因此，研究和表征了e2调控元件以开发具有广泛用途的药剂，例如作为病毒工具或治疗剂。
[0380]
向成年小鼠全身性注射raav-e2-dtomato后，病毒报告基因的表达在注射一周后达到可以检测得到的水平，并在3周后达到较高且稳定的水平。进行了免疫组织化学和原位杂交，结果一致显示约90％的病毒标记细胞是位在皮层的pv in(即表达pv的皮层中间神经元)。相反，平均而言，75％的pv cin表达病毒报告基因，最大灵敏度高达93％(图4a和4b)。这表明e2有能力靶向所有pv cin，不受皮层位置或细胞亚型的影响。与对pv cin的特异性一致，来自小鼠的切片记录显示，表达病毒报告基因的神经元在初级躯体感觉皮层(s1)和前额叶皮层(pfc)中均表现出快速尖峰形成pv cin的电生理特性(图4c及图8a和8b)。
[0381]
尽管病毒报告基因主要局限于大脑皮层，但在与scn1a表达区域密切对应的其他大脑区域中也观察到了一些阳性细胞。e2对初级视觉皮层(v1)和扣带回皮层(cingulate cortex)、下托(subiculum)、海马ca1、黑质网状部(图8c)内表达pv的神经元保持高特异性。值得注意的是，在大脑外几乎没有观察到病毒报告基因的表达，除了在肝脏(全身性递送任意aav时预计会出现这种情况)和肺部(scn1a在此处的表达水平较低)观察到的几个细胞
(图8d)。这些结果表明，尽管是全身性递送，但含有e2的载体可用于选择性靶向不同大脑区域中表达pv的神经元，在中枢神经系统外的脱靶表达微乎其微。
[0382]
许多实验范例和临床应用可能需要局部而非全身性注射。为了在这些情况下有用，病毒表达必须保持对pv cin的高度特异性。与全身性递送相比，立体定向引导注射通常会向每个细胞都递送较多数量的病毒颗粒，这可能会导致脱靶表达。为了测试增加病毒载量是否改变了特异性，以不同滴度将相同体积的raav-e2-dtomato局部注射到成年小鼠的皮层中，并在一周后评估pv cin内的报告基因表达(图4d)。结果显示，虽然较高的滴度增加了报告基因的表达水平，但没有观察到特异性的显著改变。
[0383]
尽管表达pv的中间神经元在成熟皮层中普遍存在，但在产后早期靶向这些pv cin受到了小清蛋白表达相对较晚(大约出生后15天，即p15)和缺乏其他早期标记物的阻碍。pv cin在发育障碍中的作用凸显了在皮层回路组装过程中靶向并操作该细胞群的必要性。复杂的基因策略仅提供了在小鼠中实现该目标的部分解决方案(即lhx6-cre、sst-flp和cre以及依赖于flp的报告基因)。然而，这些策略并未提供在产后第2周前轻松操作这些神经元的方法。
[0384]
为了测试e2增强子是否在小清蛋白开始表达之前靶向快速尖峰形成cin，在产后各阶段检查了其活性。为此，通过一系列立体定向引导的raav-e2-dtomato注射(图4e)，分析在产后早期进行。小清蛋白在p15阶段开始表达时评估报告基因的选择性。评估结果表明，在p1阶段注射时，pv cin的选择性大于50％，在p7阶段注射时增加到67％，若在p10阶段注射则增加到超过80％。这种方法进一步用于在p15阶段之前标记pv cin。为了在这种情况下识别快速尖峰形成cin，使用了lhx6-cre/intact转基因小鼠，其中gfp在内侧神经节隆起(mge)衍生的中间神经元(pv cin和sst cin)中表达。通过对sst进行共染，pv cin可以区分为gfp阳性/sst阴性。分别在p4-p7或p7-p10时间进程获得了72％和78％的pv特异性。因此，这种方法提供了使用单次病毒注射在回路成熟过程中研究此类神经元的手段。
[0385]
实施例3：小鼠中pv皮层中间神经元的病毒监测和操作
[0386]
如实施例2所述，已经使用不同的注射模式并在各个发育阶段证明了e2针对pv cin的表达精准度，因此评估了该载体用于研究连通性(使用突触前报告基因)和活性(使用成像技术，再加上基因编码的钙报告基因)的实用性。当e2用于驱动突触素-tdtomato融合基因时(参阅，例如，madisen,l.等,2012,nat neurosci,15(5):793-802)，报告基因的表达被限制在突触前的pv cin，末端体周位于锥体神经元上(图5a)。当该载体用于驱动gcamp6f表达时(chen，t.w.等,nature，499：295-300(2013))，已证明在晶须刺激时募集pv cin(图5b和图9a)。这些结果一起证明e2提供了监测pv cin作用方式各个方面的有效手段。
[0387]
使用化学或光遗传学方法进行了进一步的研究，以检查e2是否足以引起活性的功能变化。e2用于指导成年动物体内化学遗传受体psam4-5ht3-lc的表达(magnus,cj等,2019,science,364(6436))。观察到收集自这些动物脑部切片的pv cin在暴露于致动剂伐尼克兰时，可能会在电流钳位低于阈值时被诱导放电(图5c)。使用化学遗传受体gq-dreadd获得了类似的结果(armbruster,bn等,pnas usa,104:5163
–
5168(2007)(图9c)。最后，对在脑部切片中表达红移视蛋白c1v1的pv cin进行恒定且高频的激光刺激，导致与刺激时间锁定的放电(图5d和5e以及图9a和9b)。病毒标记的pv cin附近的锥体神经元活动持续遭激光刺激中断，证明这些神经元的参与导致伴随的局部抑制。值得注意的是，这种效果在用苦味
毒处置后不复存在(图5d和图9b)。在证明该方法的体外功效后，检查了通过光遗传学刺激pv cin改变体内兴奋网络的能力。在将aav-e2-c1v1局部注射到成年动物的初级视觉皮层后三周，在基线和激光刺激下对感染区域内的单个单位进行记录。根据它们的尖峰宽度和最大放电频率来区分记录的神经元的身份。激光刺激确实增加了抑制性中间神经元的放电率，而兴奋性神经元放电则被抑制(图5e)。这些结果一致表明e2可以在功能上与pv cin结合，并使用化学或光遗传学方法在体外和体内引起网络抑制。
[0388]
实施例4：包括人类在内的灵长类动物中pv皮层中间神经元的病毒监测和操作
[0389]
e2增强子的序列在包括人类在内的哺乳动物物种中高度保守，因此表明其在基因调控中的保守作用。进行了研究以确定e2调控元件是否可用于靶向哺乳动物物种的pv cin。使用全身性注射(在狨猴中)或局部注射(在大鼠和猕猴中)携带e2(e2病毒)的病毒性载体后，显示pv cin的靶向特异性约为90％(图6a)。据文献资料报道，在手术切除过程中获得的人类脑组织可以长时间培养(eug
è
ne,e.等,2014,j.neurosci methods,235:234-244)。利用人脑在体外保持健康的抗逆性，新鲜切除的下叶或内侧颞叶皮层暴露在e2病毒下。在两周的培养期间内，观察到荧光标记细胞的逐渐出现。在pv染色反映这些细胞的预期分布的区域中，病毒标记的细胞呈pv阳性(图6b(i)；详见”方法”)。此外，皮层和下托内的大多数细胞都显示出多个标准指示的pv ins的特征标志，包括形态学、直接去极化诱发的最大放电率或光遗传学光刺激(图6b(ii-iv)以及图10a和10b)。
[0390]
值得注意的是，人类e2增强子显示出与在小鼠注射后同等程度的pv特异性，进一步证明了以高度序列保守为特征的基因组非编码区域可能会在物种间保留其功能特性。最后，人类e2增强子在5'和3'末端的截断导致特异性急剧降低，表明已用最佳方式识别出了e2增强子的功能边界(图14)。这些结果一致表明e2载体提供了在包括人类在内的哺乳动物中靶向和操作pv cin的有效工具。
[0391]
实施例5：识别具有区域特异性的病毒增强子
[0392]
为证明本文所述的增强子选择方法可推广使用，在7个其表达在各物种的pv cin中均得到强化的基因附近识别出了25个额外的增强子/调控元件候选(本文的e11-e35)(图1a-1至1a-3；图15a-1和15a-2；图16a-1和16a-2(参见下文的“方法”)。全身性注射含有这些序列的aav后，结果表明其中4个增强子/调控元件候选显示出大于90％的pv cin选择性。值得注意的是，在这些增强子中，有相对较少不表达pv的病毒标记神经元对泛中间神经元标记物gad1呈阳性。在图1a-1至1a-3中，pvalb(uniprotkb
–
p20472)是指编码钙结合小清蛋白α蛋白的基因；acan(ncbi基因识别代码：176；uniprot p16112)是指编码聚集蛋白聚糖核心蛋白(也称为软骨特异性蛋白多糖核心蛋白)的基因，其可能与疾病有关脊椎骨骺端发育不良有关；tmem132c(ncbi基因识别代码：92293)是指编码跨膜蛋白132c的基因，132c是一种跨越细胞或细胞器生物膜的蛋白质；lrrc38(uniprotkb
–
q5vt99)是指含有38个基因的富含亮氨酸的重复序列，在肾上腺和前列腺组织中表现出较高的表达；inpp5j(uniprotkb
–
q15735)是指编码磷脂酰肌醇4,5-二磷酸5-磷酸酶a的基因，其可能参与调节膜褶皱中肌醇和磷脂酰肌醇磷酸结合蛋白的功能；mef2c(uniprotkb
–
q06413)是指编码肌细胞特异性增强因子2c的基因，2c是mef2家族中的一种转录因子，参与心脏形态发生、肌发生和血管发育，以及神经发生和皮层结构的发育。人类mef2c基因的突变导致常染色体显性遗传智力低下20(mrd20)，其特征是严重的精神运动障碍、周期性震颤以及异常的脑电图和癫痫。pth1h
(ncbi基因识别代码：5744)是指编码甲状旁腺激素样肽的基因，由乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌或结直肠癌细胞等分泌，因激活肾脏和骨骼中的1型pth/pthrp受体而引发恶性肿瘤的体液性高钙血症。与scn1a类似，与大脑中的所有其他细胞相比，上述基因在pv中间神经元中高度富集。因此，这些基因被增强子元件选为用于靶向的候选基因，所述增强子在这些基因的编码序列附近被识别和定位出来。
[0393]
具体而言，四个pv特异性调控元件，即e11(seq id no:25，人类)、e14(seq id no:28，人类)、e22(seq id no:36，人类)和e29(seq id no:43，人类)被识别为在特定大脑区域具有高度选择性的表达((图13a和13b))。这四种增强子中的每一种都对表达pv的神经元的不同但重叠的子集具有特异性。具体来说，虽然e11和e14显示其偏向于靶向皮层上方各层的pv cin，但e22增强子几乎只在皮层表现出受限的表达，只有少数神经元在其他地方表现出低水平的表达。相比之下，e29增强子表现出最全面的表达，因为它靶向整个中枢神经系统的整个表达pv的神经元群。所有这些增强子都表现出高度的序列保守性，并且选自其表达谱在物种间相似的基因。为了直接测试增强子之间的跨物种相似性是否导致跨物种的相似功能，将aav-e22-dtomato局部注射到猕猴的v1中。结果表明，病毒报告基因的表达以类似于小鼠的方式被限到pv cin。区域选择性和跨物种表达保守性的组合为这些病毒制剂在靶向治疗中纠正不同哺乳动物物种的异常脑功能提供了实用性。
[0394]
实施例6：通过在ds小鼠模型中表达scn1a的群内递送scn1a基因的功能性副本，将scn1a表达恢复至正常水平
[0395]
为了通过将scn1a基因的功能性副本递送至例如ds小鼠模型中表达scn1a的中间神经元细胞群，从而把scn1a基因表达恢复到正常水平，“有限的核酸(dna)有效载荷”(即raav载体中包含或携带的外源性核酸(dna)的大小，例如转基因和相关核酸序列)通过使用一种或多种方法而增加，该些方法导致一个能够容纳scn1a基因大小的raav载体。如上所述，aav dna大约为4.7-5kb，而需要插入raav载体并由其递送的基因通常是其两倍或更大。使用raav递送更大的基因已经在其他使用多个载体的情况下得到了证明，该些载体通过同源重组或通过受体位点介导的剪接重新组装((参阅，例如，hirsch,m.l.等,2016,methods mol biol,1382:21-39))。这两种方法都可以克服raav的封装限制。
[0396]
正如ds动物模型和人类患者均显示的那样，对scn1a的需求是剂量依赖性的。因此，受raav驱动的scn1a的表达水平如本领域已知和实践的那样适当地滴定以匹配或尽可能接近地匹配scn1a表达的正常内源水平。可以使用多种方法来精确调节scn1a基因表达的水平。使用各种策略来调节scn1a的表达水平，将癫痫发作的改善作为治疗有效性的直观表现。
[0397]
实施例7：选择性地使ds小鼠模型中scn1a缺陷神经元群的兴奋性正常化的药物遗传学方法
[0398]
直接基因疗法使用含有特定增强子和基因核酸序列的raav载体进行递送和中间神经元细胞内受限的表达。作为该种疗法的替代方案，可以采用药物遗传学方法直接纠正scn1a神经元群内的神经元活性。为此，使用“人工设计受体”的化学遗传学方法可用于调节中间神经元活性。只能由人工设计的药物激活的人工设计受体(dreadd)是经修饰的人类毒蕈碱受体。此外，psam-psem化学遗传剂也适合使用。
[0399]
gq-dreadd是一种只能由氯氮平-n4-氧化物(cno)激活的受体，属于药理学惰性和
口服生物可利用的药物。使用gq-dreadd可以纠正ds小鼠模型(ds小鼠)。简而言之，使用包含scn1a特异性增强子(例如上文所述的e1-e10)和scn1a基因的raav载体即可在scn1a缺陷的中间神经元细胞中表达gq-dreadd受体。基于其他使用gq-dreadd的研究，预计该受体具有功能性并位于经转导/感染的细胞的膜上。此外，包含scn1a特异性调控元件(例如本文所述的e1-e10)的raav载体应仅在中间神经元(例如gaba能中间神经元和表达pv的gaba能中间神经元)内驱动g1-dreadd受体的表达。可以评估受感染细胞内gq-dreadd的功能。在cno的浴应用后，所有表达gq-dreadd的中间神经元预计会在不到一分钟的时间内显示出膜电位去极化，这与功能性受体的表达一致。此外，在表达gq-dreadd的中间神经元附近的锥体细胞的电压钳记录预计会在应用氯氮平-n-氧化物(cno)后显示抑制性突触后电流(ipsc)的增加。此类实验表明，包括scn1a特异性e1-e10增强子序列和gq-dreadd编码多核苷酸的raav允许gq-dreadd的特异性、功能性和限制性表达，并且cno处置有效且选择性地增强了中间神经元的活性，从而提供相邻兴奋性神经元内的中间神经元抑制活性的局部和显著增加。
[0400]
如果缺乏scn1a(scn1a的功能丧失)会损害dreadd增加细胞兴奋性的能力，可以通过使用泛中间神经元增强子将dreadd传递给所有中间神经元，例如，独特和相异的dlx增强子，如dimidschstein,j.等人所述(2016,nature neuroscience,19(12):1743-1749)，通过增加不受scn1a功能丧失影响的其他类型中间神经元的活性来规避损伤。
[0401]
实施例8：上述实施例的材料和方法
[0402]
scatac-seq文库制备和测序。将雄性半合子dlx6a-cre小鼠(jax stock#008199与雌性纯合intact小鼠(flox-sun1-egfp,jax stock#021039)杂交，产生供scatac-seq实验使用的的dlx6a-cre::intact后代。得到p28 dlx6acre::intact小鼠的大脑后，在小鼠脑切片机(zivic instruments)上进行冠状切片，并在冰冷的人工脑脊液(acsf)中解剖感兴趣的区域。然后将组织转移到含有裂解缓冲液(10mm tris-hcl、10mm nacl、3mm mgcl2、0.01％tween-20和0.01％igepal ca-630、0.001％毛地黄皂苷)的杜恩思匀浆器中。用杵a捣10次、杵b捣10次将组织匀浆，并在冰上孵育5分钟，然后用30μm过滤器进行过滤，并在4℃下以500xg离心10分钟。将沉淀物重新悬浮在1％bsa中，以便在sony sh800s细胞分选仪上分选gfp 细胞核。将细胞核分选到稀释的细胞核缓冲液(10x genomics)中。使用chromium single cell atac solution(10x genomics)制备单细胞atac-seq文库。使用nova-seq s2 100循环试剂盒(illumina)对文库进行测序(图3a-3c)。
[0403]
scatac分析。使原始测序数据通过cell ranger atac管道(10x genomics)。然后使用片段文件生成快照文件以使用snapatac包(https://doi.org/10.1101/615179)进行分析。使用基于图表的聚类(k＝15,24个主要成分)对细胞进行聚类。按照snapatac包中的描述生成基因活性评分，并用于确定与中间神经元基数类别相对应的集群。对于每个基数类别，生成bigwig文件并使用macs2调用峰值以输入到集成基因组浏览器(integrated genome browser)和增强子选择中。使用bedtools jaccard比较各基数类别的峰值。
[0404]
增强子选择。本文介绍的所有增强子(s5e1-e10和e11-e35)都是基于atacseq数据(用于dna开放性)和跨物种保守性(使用ucsc基因组浏览器脊椎动物保守性踪迹)的共存来选择的。小鼠及其人类直系同源物的基因组坐标显示在图1a-1到1a-3。
[0405]
对于选择，候选调控元件是从通过将“context”区域(scn1a基因间区域 内含子1)
与“ataseq peak union”文件和“phastcons 60-way”文件(见下文)相交而生成的元素列表中手动挑选出来的。可及性。将atac-seq数据(mo等,2015,neuron,86:1369-1384)下载到geo存储库，并使用macs2以默认参数运行(https://github.com/taoliu/macs)，将数据离散为峰值。使用自定义r脚本，生成了一个包含跨数据集所有峰值的并集的文件，并将其用于下文所述的增强子选择。最终选择依赖于对单个细胞类型的峰值的检查，而不是所有峰值的的并集。甲基化。从brainome门户网站(http://brainome.org)下载了小鼠整个基因组中100kb的非重叠仓的小鼠mch水平(luo等,2018,nat commun,9(1):3824)。这些数据用作确认使用上述atac-seq数据集选择的候选载体的定位。保守性。“phascons 60-way”踪迹是从ucsc门户网站(https://genome.ucsc.edu)以bed文件格式下载的，并使用自定义r脚本进行过滤，以删除任何小于10bp的元件。使用bedtools/interesct融合任何间隔小于50bp的元件。
[0406]
raav克隆和病毒生产。所有病毒构建体均使用分子生物学中的标准克隆方法和方案生成。质粒paav-mdlx-gfp(addgene#83900；addgene,watertown,ma),(dimidschstein,j.等,2016,nat.neuroscience,19(12):1743-1749)用于创建包含产生aav所需元件(内部末端重复序列、最小启动子、土拨鼠转录后反应元件)的标准骨架。
[0407]
增强子序列(将表达限制到特定神经元类型所必需的)由genewiz(cambridge,ma)从头合成，报告基因和效应子通过pcr扩增。具体地，使用以下引物通过pcr从小鼠基因组dna扩增增强子序列：e1：caaagtggacagaggggggagg(seq id no：50)和gtgctgttgggagtggtgga(1280bp)(seq id no：51)；e2：aatctaacatggctgctata(seq id no:52)和caattgctcagagttatttt(618bp)(seq id no:53)；e3:ataaaattttattttcctaa(seq id no:54)和gaggaaatcagctacggggc(832bp)(seq id no:55)；e4：tctgacagagcaagtcttga(seq id no:56)和tatcaaaattgtatattcag(261bp)(seq id no:57)；e5：aatgttttgatatttaggag(seq id no:58)和ttgactcttaaaatttaata(663bp)(seq id no:59)；e6：ttgtcactttgttactctac(seq id no:60)和ttaatcttaaaattttcct(606bp)(seq id no:61)；e7：gatactgtataattaattag(seq id no:62)和cttccttctggttccttttt(2430bp)(seq id no:63)；e8：attgatctccaactttttaa(seq id no:64)和gttcatccaagtaataagag(1644bp)(seq id no:65)；e9：atctcaagtgtatgtaacat(seq id no:66)和gtctttttgttttttttttt(521bp)(seq id no:67)；e10：tattgcaaaaggaaggaatg(seq id no:68)和tcatggaaaaaagaaaaaatc(547bp)(seq id no:69)。使用gibson assembly克隆试剂盒(neb-e5510s)按照标准程序克隆增强子、报告基因和效应子。具体来说，对于aav-e1:10-dtomato，dtomato编码序列从质粒addgene#83897中扩增出来的；对于aav-e2-syp-dtomato，突触素-tdtomato编码序列从质粒addgene#34881中扩增出来；对于aav-e2-gcamp6f，从质粒addgene#83899扩增gcamp6f编码序列；对于aav-e2-c1v1-eyfp，c1v1-eyfp编码序列从质粒addgene#35499扩增出来。
[0408]
使用gibson克隆试剂盒(neb-e5510s)((新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州))按照制造商的说明和标准方案组装最终的质粒。使用标准生产方法生产raav。聚乙烯亚胺(pei)用于转染(参见，例如，longo,pa等,2013,methods enzymol.,529:227-240)，并使用optiprep
tm
密度梯度(西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)，圣路易斯，密苏里州)用于病毒颗粒的纯化和分离。血清1型用于生产向小鼠和大鼠局部注射的aav。血
清9型用于狨猴全身性注射，血清型phpeb用于猕猴局部注射和小鼠全身性注射。病毒滴度通过qpcr估算，引物通过所有构建体共有的wpre序列退火。生产的所有批次都在每毫升10
10
至10
12
个病毒基因组的范围内。具体而言，土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件(wpre)是一种dna序列，在转录时会产生增强表达的三级结构。wpre是一种具有伽马、阿尔法和贝塔组分的三方调控元件，常用于分子生物学以增加raav-dtomato等病毒性载体递送的基因的表达(参阅，例如，choi,j.-h.等,2014，mol.brain，7:17)。生产的所有raav批次都在每毫升10
10
至10
12
个病毒基因组的范围内。
[0409]
动物。小鼠：雌性c57bl/6j小鼠(小家鼠；10周龄)，获自杰克逊实验室(巴港，缅因州，股票号#000664)。大鼠。sprague dawley大鼠(成年重150-250克)，获自位于纽约金斯顿的查尔斯河实验室。狨猴。一只雌性普通狨猴(普通狨(callithrix jacchus)，6岁)，获自位于麻省理工学院的种群。猕猴。一只雄性猕猴(普通猕猴(macaca mulatta)，15岁)，从加州大学戴维斯分校的加州国家灵长类动物研究中心获得。所有动物都保持在12光/12暗循环中，小鼠每笼最多5只动物，大鼠每笼最多1只动物。狨猴和猕猴是群居的。所有动物饲养和实验程序均根据麻省理工学院和哈佛博德研究所(小鼠)、麻省理工学院麦戈文研究所(大鼠和狨猴)和索尔克生物研究所(猕猴)的实验动物管理和使用委员会制定的指导方针进行，并遵守美国国立卫生研究院的标准。
[0410]
局部和全身性病毒注射。鼠标局部s1。成年小鼠的局部注射在体感皮层中以立体定向注射150nl病毒进行，坐标如下：相对于前囟点而言，后1.0毫米，侧2.9毫米，腹侧0.7/0.45毫米。小鼠全身。对于成年小鼠的全身性注射，每只动物的眼眶后窦注射了大约10
11
个病毒颗粒。注射后五天进行术后监测。v1中大鼠局部。成年大鼠的局部注射在初级视觉皮层中使用立体定向引导注射670nl病毒进行，坐标如下：相对于前囟点而言，后5.4毫米、侧4.2毫米、腹侧2.0毫米。狨猴全身性注射。对于成年狨猴的全身性注射，将大约有10
12
个病毒颗粒的约0.7ml无菌pbs注入隐静脉，然后再输入约0.5ml生理盐水。最后一次输注后，对注射部位施加压力确保止血。将动物放回其饲养笼并密切监测麻醉后的正常行为。注射病毒后第51天对动物实施安乐死。v1中猕猴局部。成年猕猴的局部注射在左侧初级视皮层使用立体定向引导注射进行，坐标如下：相对于耳间线中心而言，后13毫米，侧19毫米，高23毫米(基于动物的核磁共振成相)。在4个深度(即距皮层表面1.8、1.3、0.8和0.3毫米)共注射了333nl。
[0411]
外科手术。对于立体定向引导病毒注射，将动物在异氟醚(氧气中占1-3％)下麻醉，并放置在控温加热垫上的立体定向头架中。在目标大脑区域上方进行开颅手术和硬脑膜切开术。使用锋利的玻璃移液管(直径25-35毫米)以10-25nl/分钟的速度向动物注射50-500nl指定病毒(raav)，移液管在注射后于原位放置5-15分钟，尽量减少回流。开颅部位用无菌骨蜡覆盖，手术开口用vetbond封闭，再将动物放回笼子至少1周。注射部位由以下坐标定义：躯体感觉皮层s1：相对于前囟点而言，后1.0毫米，侧3.0毫米，腹侧0.7/0.4毫米；海马ca1：相对于前囟点而言，后1.6毫米，侧1.8毫米，腹侧1.2毫米；纹状体：相对于前囟点而言，后0.5毫米，侧2.0毫米，腹侧3.2毫米。
[0412]
对于眶后静脉注射，动物在异氟醚(氧气中占1-3％)下麻醉，并放置在控温加热垫上。在眶后脉管丛中进行静脉内(iv)注射。更具体地，将动物(小鼠)置于与非重复呼吸装置(surgivet，都柏林，俄亥俄州)相连的漏斗形鼻锥中，在眼眶内角将针头斜向下插入眶后
窦。将多达150μl含有复制缺陷raav载体的上清液注入尾静脉或眶后脉管丛。注射后，眼睛至少闭上30秒以确保体内平衡。
[0413]
小鼠电生理记录：
[0414]
2至6周龄小鼠切片制备。用异氟烷麻醉注射了病毒的小鼠。反射消失后，小鼠经心脏灌注含有以下物质(以mm为单位)的冰冷含氧acsf：87nacl、75蔗糖、2.5kcl、1.25nah2po4、26nahco3、10葡萄糖、1cacl2和2mgcl2。然后将小鼠斩首，使用leica vt-1200-s振动切片机切制300μm厚的冠状切片，并在32
–
35℃的保温室中孵育15
–
30分钟，然后在室温20
–
23.5℃(68
–
74
°
f)下继续孵育至少45
–
60分钟，然后再进行生理记录。将含有注射部位的切片转移到记录室，该记录室被含氧acsf浸没，其中含有以下物质(以mm为单位)：125nacl、2.5kcl、1.25nah2po4、26nahco3、10葡萄糖、2cacl2和1mgcl2(ph＝7.4，冒着95％氧气和5％二氧化碳气泡)。6周龄及以上小鼠切片制备。急性冠状脑切片制备过程如下：小鼠用avertin溶液(20mg/ml，0.5mg/g体重)麻醉，并经心脏灌注15至20毫升含有以下物质的冰冷碳化(95％氧气和5％二氧化碳)切割溶液：194mm蔗糖、30mm nacl、4.5mm kcl、1.2mm nah2po4、0.2mm cacl2、2mm mgcl2、26mm nahco3和10mm d-( )-葡萄糖(渗透压为340-350mosm)。然后迅速取出大脑并置于冰冷的切割溶液中进行切片制备。制备冠状切片(300μm)，然后在32℃下与碳化人工脑脊液(acsf)孵育10至15分钟。然后将切片在含有以下物质的csf中于室温孵育至少1小时：119mm nacl、2.3mm kcl、1.0mm nah2po4、26mm nahco3、11mm葡萄糖、1.3mm mgso4和2.5mm cacl2(ph 7.4，渗透压为295-305mosm)。电流钳。对于中间神经元记录，还添加了10μm cnqx、25μm ap-5和10μm sr-95531以分别阻断ampa、nmda和gabaa受体，从而测量光遗传学和化学遗传学刺激的细胞内在效应。使用硼硅酸盐移液管(3
–
5mω)从视觉识别的表达病毒报告基因的细胞获得全细胞电流钳记录，移液管中包含(以mm为单位)：130k-葡萄糖酸盐、6.3kcl、0.5egta、10hepes、4mg-atp、0.3na-gtp和0.3％生物胞素(用koh将ph值调至7.3)。在闯入时，串联电阻(通常为15-25mω)得到补偿，并且只包括稳定的记录数据(变化《20％)。使用multiclamp 700b放大器(molecular devices)采集数据，以20khz采样并以10khz过滤。所有细胞都保持在-60mv的直流电流下，并应用电流步进协议来获得放电模式并提取基本的亚阈值和超阈值电生理特性。电压钳。根据ir-dic可视化下的锥体细胞形体细胞选择不表达病毒报告基因的细胞，并用包含以下物质的移液管记录(以mm为单位)：130cs-葡萄糖酸盐、0.5egta、7kcl、10hepes、4mg-atp、0.3na-gtp、5磷酸肌酸、5qx-314和0.3％生物胞素(用csoh将ph值调节至7.3)。细胞持续保持在0mv以进行基线和光遗传学或化学遗传学刺激。对于电流和电压钳记录，在刺激前记录至少2分钟的基线。在整个基线和cno应用中施加小脉冲(-20pa或-5mv，0.2hz或0.5hz时为100ms)以监测串联电阻变化。使用clampfit 10.2软件(molecular devices)离线分析数据。
[0415]
体内钙成像。出生后第10天注射大约100nl的aav-e2-gcamp6病毒到动物的桶状皮层。p27-p34阶段在注射部位植入开颅手术，从开颅手术中恢复后进行宽场钙成像。简而言之，麻醉(1.5％异氟醚)小鼠在3-4hz和4倍放大率下成像(thorlabs ccd相机
–
1501m-usb，thorlabs led刺激
–
dc4104)，同时以特定间隔(5-20秒)朝对侧胡须吹气(持续100-200毫秒，picospritzer iii)。进行了多次记录，然后对小鼠进行灌注以进行组织学分析。计算每个记录和同步晶须刺激的f/f(荧光/平均荧光的变化)，在imagej中分析记录。(5％)f/f阈值被设置为刺激和自发钙信号响应。
[0416]
人类电生理记录：
[0417]
组织制备、培养方案和病毒接种。四名参与者(2名男性/2名女性；年龄范围22-57岁)接受了手术，切除了脑组织(颞叶和海马)以治疗耐药性癫痫。在所有情况下，每位参与者之前都曾接受过放置硬膜下和/或深度电极的初步手术，该电极用于颅内监测以确定癫痫发作的位置。ninds机构审查委员会(irb)批准了研究方案(clinicaltrials.gov识别号nct01273129)，并获得了参与者对切除组织实验使用的知情同意。神经外科切除术后30分钟内在基于冰冷含氧蔗糖的切割溶液(100mm蔗糖、80mm nacl、3.5mm kcl、24mm nahco3、1.25mm nah2po4、4.5mm mgcl2、0.5mm cacl2和10mm葡萄糖，用95％氧气和5％二氧化碳使其饱和)中获得来自海马和颞叶的300μm切片(leica 1200s震动切片机；徕卡微系统公司，班诺克本，伊利诺伊州)。然后将切片在蔗糖切割溶液中在33℃下孵育30分钟，然后冷却至室温15-30分钟。将切片转移到培养基中(eug
è
ne等，2014年)并置于35℃的培养箱(5％二氧化碳)中平衡15分钟。然后将每个单独的切片转移到30mm millicell插入式细胞培养皿(millipore公司，产品编号：picm0rg50)上进行界面培养，并如上孵育。12小时后更换培养基，将1-2μl含有或不含paav_s5e2_c1v1-eyfp的paav_s5e2-dtomato直接移液到每个切片上并放回培养箱中。对于海马切片，病毒针对下叶亚区。培养基每2-3天定期更换，直到进行电生理分析为止。电生理记录。接种病毒后7至14天对培养的人体切片进行电生理记录。将培养的人类切片转移到33℃且以3-4ml/min的速率灌注有细胞外溶液(130mm nacl、3.5mm kcl、24mm nahco3、1.25mm nah2po
4-h2o、10mm葡萄糖、2.5mm cacl2和1.5mm mgcl2，使用95％氧气/5％二氧化碳(ph 7.4；300-310mosm)的记录室。来自感染了paav_s5e2-dtomato或paav_s5e2_c1v1-eyfp神经元的全细胞膜片钳记录使用含有以下成分的细胞内溶液进行：130mm葡萄糖酸钾、10mm hepes、0.6mm egta、2mm mgcl2、2mm na2atp、0.3mm nagtp和0.5％生物胞素(ph调节至7.4；渗透压调节至285-300mosm)。在一些记录中，130mm葡萄糖酸钾被90mm葡萄糖酸钾/40kcl替代。本征膜和放电特性的测定基本上如前文所述(tricoire,l.等,2011,j.neurosci,31(30):10948-70)。使用coolled pe-4000照明系统(英国安多佛)将550nm光刺激的c1v1光遗传激活通过40x水浸物镜递送到切片。生物胞素重建和免疫细胞化学。电生理记录后，切片在0.1m pb中的4％多聚甲醛中滴固定过夜。切片在0.1m pb中洗涤(3x 15分钟)，并在室温下在0.1m pb中的0.5％triton x-100/10％山羊血清中渗透/封闭至少2小时。为了结合生物胞素回收和免疫细胞化学，在以1:1000稀释的一抗中进行初始孵育(4℃，40小时)(兔抗pv，abcam产品编号：ab11427；豚鼠抗rfp，sysy产品编号：390005)。切片在室温下于0.1m pb中洗涤4x 30分钟，然后于4℃下在二抗(1:1000山羊抗豚鼠alex-flour 555，赛默飞世尔科技公司产品编号a21435；1:500山羊抗兔alex-flour 647，赛默飞世尔科技公司产品编号a32733；和1:1000链霉亲和素alexa fluortm488，赛默飞世尔科技公司产品编号s1123)中孵育过夜。在最后的洗涤程序(4x 30分钟)之后，将切片安装在带有prolong gold抗褪色剂(赛默飞世尔科技公司产品编号p36930)的显微镜载玻片上，用于随后的共聚焦显微镜分析。
[0418]
免疫组织化学(ihc)。注射了病毒的动物用euthasol((美国virbac公司))安乐死，并用4％多聚甲醛(pfa)经心脏灌注。将大脑置于4％pfa中过夜，然后使用leica vts1000振动切片机在50
–
60μm(特别是50μm)处切片。浮动脑切片用0.1％triton x-100和磷酸盐缓冲盐水(pbs)透化30分钟，再用pbs洗涤3次，然后在封闭缓冲液(pbs中5％的正常驴血清)中孵
育30分钟。然后将切片在封闭缓冲液中与以下一抗的指定组合在4℃下孵育过夜：鸡抗gfp浓度为1:1,000(美国abcam公司，ab13970)；1:1000的兔抗dsred(美国clontech公司，632496)；1:1,000的山羊抗pv(美国swant公司，pvg-213)；1:1,000的豚鼠抗pv(美国swant公司，gp-72)；1:2000的兔抗sst(美国peninsula公司，t-4103.0050)；1:250的小鼠抗synaptotagmin-2(美国zfin公司，#zdb-atb-081002-25)。然后将切片用pbs洗涤3次，用alexa fluor偶联的二抗以1:1000(美国invitrogen公司)孵育，用dapi(美国sigma公司)复染，并使用fluoromount-g(美国sigma公司)固定在载玻片上。使用蔡司(zeiss)lsm800共聚焦显微镜或蔡司axioimager a1落射荧光显微镜获取大脑区域的图像。人类脑组织中pv ihc的染色变化很大；因此，病毒特异性的估计是在皮层和下托的区域内进行的，该些区域内的染色密度反映了这些细胞的已知分布和密度。鉴于人类脑组织的可变性，该方法无法获得准确的量化。
[0419]
原位杂交。
[0420]
本文所述研究中使用的原位杂交探针(gad1，产品编号400951；pvalb，产品编号421931；vip，产品编号415961)由advanced cell diagnostics公司(纽华克，加州，美国)设计。multiplex fluorescent reagent kit v2(产品编号323100)、probe diluent(产品编号300041)、hybez
tm
烘箱(产品编号321710/321720)、湿度控制托盘(产品编310012)和hybez加湿纸(产品编号310025)也来自advanced cell diagnostics。tsa plus荧光素、tsa plus cyanine 3和tsa plus cyanine 5(产品编号分别为nel741、nel744和nel745)来自perkinelmer公司。如上文“免疫组织化学”所述处理脑组织。脑切片在pbs中洗涤1次，然后在0.1％triton x-100和pbs中洗涤3次，安装在superfrost plus载玻片(fisher scientific公司，产品编号12-550-15)上，并在hybez烤箱中于60℃下烘烤25分钟。然后将载玻片浸入4％pfa中30分钟，然后在h2o中洗涤3次。在室温下将rnascope h2o2涂到每个切片上5分钟。然后将载玻片在h2o中洗涤3次，浸入预热的90℃h2o中15秒，再浸入预热的90℃rnascope target retrieval中15分钟。在将rnascope protease iii涂到每个切片之前，将载玻片在h2o中洗涤3次，然后在hybez烤箱中于40℃下孵育15分钟。将载玻片在h2o中洗涤3次，然后在hybez烤箱中与用探针稀释剂稀释至1:50的探针溶液一起在40℃下孵育2小时。接下来，切片在rnascope洗涤缓冲液中洗涤3次，然后进行荧光扩增。值得注意的是，针对报告基因rna的探针揭示了可能归因于病毒dna的非特异性染色。为了揭示病毒报告基因，使用dtomato的ihc扩增来执行rnascope方案。将切片在封闭溶液(0.3％triton x-100加pbs中5％的正常马血清)中孵育30分钟。此后，将切片在1:250的抗体溶液(0.1％triton x-100加pbs中5％的正常马血清)和兔抗dsred(美国clontech公司，产品编号632496)中于4℃下孵育过夜。然后将切片用pbs洗涤3次，用与alexa fluor偶联的二抗以1:500(美国invitrogen公司)孵育，用dapi(美国sigma公司)复染，并使用fluoromount-g(美国sigma公司)固定在载玻片上。
[0421]
量化和统计。对于表达强度，以标准化的放大倍数和曝光时间拍摄荧光图像。记录表达病毒报告基因的每个细胞的细胞体的平均像素强度，并报告为每个增强子所有细胞的平均值。为了量化共定位，仅使用相应的颜色通道对表达指定报告基因的细胞进行计数，然后在这些细胞中计数共表达目标标记物的细胞数量。如果相应信号高于背景荧光，则认为
细胞对给定标记物呈阳性。然后计算共表达两种标记物的细胞与仅表达报告基因的细胞总数的比率，在本文中报告为平均值
±
平均值标准误差(例如，在本文中图式中以柱状图表示)。使用最少两个独立的生物学复制物进行量化(每个单独量化涉及的细胞、动物和条件的具体编号列于图11的表格中，和/或描述于图示说明中)。有需要时会使用来自同一个动物的多个切片。收集和分析数据时不会忽略实验条件，相反，量化由来自不同研究小组的实验人员进行。未使用统计方法来预先确定样本量，但本文所述样本量与先前文献中报告的样本量相似。
[0422]
实施例9：从小鼠到人类的功能各异的神经元的病毒操作
[0423]
本文描述了通过靶向和操作特定神经元细胞群和亚型来了解和治疗神经元和神经精神疾病的方法和途径。访问非人类灵长类动物和人类体内的这些细胞群已变得至关重要。虽然aav可用于神经系统中的基因递送，但也存在基因组有效载荷有限和对特定神经元群缺乏固有选择性的问题。本文描述了能够将病毒表达限制到广泛的神经元类别的调控元件的识别。为了聚焦本文所述增强子的选择，特别检视了scn1a的调控景观，scn1a是一种在不同神经元群中表达的基因，其遭受的破坏与严重的癫痫相关。
[0424]
将单细胞atac-seq数据与跨物种序列保守性相结合，在scn1a基因附近识别出了十个候选调控序列。通过研究这些元件中每一个指导病毒表达的能力，确定了三个增强子(e2、e5、e6)，它们一起锁定了表达scn1a的神经元群的广度。其中，发现一个特定的短调控序列(本文中的e2)能够将病毒表达限制到表达小清蛋白的皮层中间神经元(pv cin)中。为了充分评估该元件在报告基因表达之外的效用，在各种各样的情况下验证了该增强子元件，包括突触标记、钙成像以及体外和体内的光遗传和化学遗传方法。此外，该增强子元件允许在发育过程中和跨物种(包括啮齿动物、非人类灵长类动物和人类)时选择性靶向pv cin。为证明该方法为增强子发现提供了一种通用策略，在富含pv in的7个基因附近选择了25个额外的调控元件(图15a-1、15a-2、16a-1和16a-2)，从其中识别出了另外四个具有pv特异性的调控元件(e11、e14、e22和e29)，每个都在特定大脑区域内具有显著的选择性表达。总之，证明了可以在多种动物模型中使用的各种功能性测试工具的实用性。此类“病毒试剂”包括含有编码一个或多个本文所述增强子元件的多核苷酸以及一种或多种目标多核苷酸的病毒递送载体，可用于厘清当非人类灵长类动物患上神经系统、神经发育和神经退行性疾病时，功能各异的神经元细胞类型将受到何种影响。最终，含有增强子的病毒性载体可以作为药剂使用，以治疗性的方式使特定神经元细胞群里病态的神经元活动或基因表达正常化。
[0425]
本文中识别出和描述的增强子提供了访问具有特定临床相关性的神经元群的途径。这些增强子可用于缓解德拉韦综合征令患者衰弱的方面，例如，通过使用基因疗法或通过调节神经元活性。如上文“实施例”一节中所述，使用局部和全身性注射将病毒性载体有效地递送至脑部。通过局部注射可以治疗或改善诸如局灶性癫痫、前额叶皮层功能障碍或海马记忆障碍等神经系统疾病和病状。或者，全身性引入病毒性载体可用于需要全局干预的情况，例如，纠正全身性癫痫发作，或治疗精神疾病和神经退行性疾病。本文所述的调控元件提供了针对治疗环境特异性地访问特定细胞类型的途径。
[0426]
事实上，本文所述的增强子选择方法和方式因可推广到其他基因而具有其优势。无意进行任何限制，本发明确定了包含七个代表性增强子(例如，本文的e1、e5、e6、e11、
e14、e22、e29)的子集，并证明它们对中枢神经系统不同的神经元群和区域具有独特的特异性。即使应用严格的标准(对目标神经元群的选择性》90％)，本文所述增强子选择方法也有很高的成功率(》20％)。此外，正如高度序列保守性所预测的那样，增强子的代表性子集证明其在包括人类在内的多个物种中具有同等的选择性和有效性。因此，本文所述方法提供了一种可靠的方法，用来系统性地识别在多个物种中均能发挥作用的细胞类型特异性增强子。
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其他实施方案
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根据上文的描述，对本文所述实施例进行变更和修改以便将它们用于各种用途和条件是显而易见的。此类实施方案也在本文权利要求书的保护范围内。
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本文对变量定义中所列元件的记载包括将该变量定义为任意单个元件或所列元件的组合(或子组合)。本文对实施方案的记载包括将其作为任意单个实施方案或与其他任意实施方案或其部分的组合，例如本文一个或多个小节中记载的实施方案。本说明书中提及的所有专利和出版物均以引用方式并入本文，相当于其中每个独立的专利和出版物均具体且单独地以引用方式并入本文。