一种纤维二糖水解酶及其编码基因与应用的制作方法

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种纤维二糖水解酶及其编码基因与应用。


背景技术：

2.纤维素广泛存在于自然界，是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素是由葡萄糖分子以β
‑
1,4葡萄糖苷键连接而成的高分子聚合物，每个分子所含葡萄糖残基从100～10,000不等。纤维素经过纤维素酶的降解便能在工业生产中实现有效利用，如发酵生产乙醇等有机化学品，因此纤维素酶活性的高低以及对恶劣反应条件的耐性会直接影响到纤维素的降解以及其在工业上的应用前景。
3.纤维素酶是分解纤维素而最终形成葡萄糖的复合酶类的总称，它主要由内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶(外切葡聚糖酶)以及β
‑
葡萄糖苷酶三大类酶组成。内切葡聚糖将纤维素水解成纤维素片段，纤维二糖水解酶从内切葡聚糖酶水解产生的游离末端进一步将纤维素片段水解成为纤维二糖，最后通过β
‑
葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成为葡萄糖，三者协同作用完成纤维素的降解，任何一种酶的缺乏均会导致降解效率的下降。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素无定形区，而结晶区只有纤维二糖水解酶能够降解，因此纤维二糖水解酶对于纤维素降解有着重要意义。
4.现在工业上应用的纤维二糖水解酶普遍存在酶活低、不耐高温、稳定性差等缺点，现有技术中通常是通过对纤维二糖水解酶氨基酸进行改造从而获得各方面性能改善的纤维二糖水解酶突变体，例如：cn107236719b公开了一种耐热性纤维二糖水解酶，是由氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的具有以磷酸溶胀微晶纤维素为底物的水解活性的多肽；cn104870642a公开了一种纤维二糖水解酶的突变体，是由一个或多个氨基酸残基被置换和/或缺失产生。而从自然环境中获取的天然的、具有较高活性和优良酶学特性的纤维二糖水解酶，目前仍然比较匮乏，因此需要提供更多的纤维二糖水解酶以供工业应用选择。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种新的、天然的、具有较高活性和优良酶学特性的纤维二糖水解酶cbh2124及其编码基因和应用。
6.本发明的第一个目的在于提供一种纤维二糖水解酶基因cbh2124。
7.本发明的第二个目的在于供一种纤维二糖水解酶cbh2124。
8.本发明的第三个目的在于提供编码所述纤维二糖水解酶的制备方法。
9.本发明第四个目的是提供所述纤维二糖水解酶的应用。
10.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
11.广东地区红树林分布广泛，环境特殊，其土壤常覆盖落叶，内部植物根系发达，并且被海水浸泡，具备了盐渍化、沼泽化等特点，拥有丰富而独特的微生物资源，其中很有可
能存在耐盐碱、能够在极端条件下工作、满足工业应用的新型纤维二糖水解酶。常规大量获得纤维二糖水解酶的方式需要首先获得产纤维二糖水解酶的菌株，再进行基因的克隆和表达，但能在实验室中培养的微生物仅占全部微生物种类的不到1％，因此以常规方法获得新型纤维二糖水解酶极有可能在前期富集菌种时出现遗漏，需要耗费大量的人力、财力及时间。而通过构建宏基因组文库并进行功能筛选的方法具有文库含有的微生物dna的种类多、筛选高通量等优点，能在较短时间内从基因层面上获得编码新型纤维二糖水解酶的基因，并将其构建到原核或真核表达系统上进行表达，因而节省了大量菌种分离、培养菌株和克隆基因的时间。
12.本发明通过使用宏基因组功能筛选的方法获得一种具有纤维二糖水解酶活性的多肽，命名为纤维二糖水解酶cbh2124；所述纤维二糖水解酶基因cbh2124，其核苷酸序列如seq id no：1所示，其编码的纤维二糖水解酶cbh2124，氨基酸序列如seq id no：2所示。
13.需要说明的是，本发明所述seq id no：1和seq id no：2的核苷酸序列或氨基酸序列可以人工合成，也可以通过生物技术的方法合成，但人工合成的成本远高于生物技术方法合成的成本。
14.本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有所述纤维二糖水解酶基因cbh2124。
15.本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌含有所述纤维二糖水解酶基因cbh2124的重组表达载体。
16.优选地，所述的重组菌采用大肠杆菌菌株bl21(de3)。
17.本发明还提供了一种纤维二糖水解酶cbh2124的制备方法，包含以下步骤：
18.s1.在原核表达载体的多克隆位点插入权利要求1所述纤维二糖水解酶基因cbh2124获得重组表达载体，再将重组表达载体转化宿主菌，得重组菌株；
19.s2.培养重组菌株，诱导表达重组纤维二糖水解酶；
20.s3.诱导表达后收集菌体，超声破碎，收集上清液，即得。
21.优选地，所述重组表达载体为cbh2124
‑
pet32a( )。
22.更优选地，步骤s2中诱导表达的条件为：加入iptg使其终浓度为0.8mm，于22℃、200rpm诱导14h。
23.本发明还提供了一种纤维二糖水解酶cbh2124在纤维素降解或在制备降解纤维素的产品中的应用。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.本发明提供了一种具有纤维二糖水解酶活性的多肽cbh2124。本发明研究表明，cbh2124属于弱酸性纤维二糖水解酶，在30℃下反应5h仍能保持100％左右的活性，在ph 6.2下孵育5h活性仍保持在90％以上；且大多数金属离子对其酶活性起促进作用，而低浓度的mn
2
(1mm)可使cbh2124的酶活性提升到210％；纤维二糖水解酶cbh2124对于部分有机溶剂及重金属离子有较好的耐受性，在工业上有良好的应用前景。
附图说明
26.图1为红树林土壤宏基因组dna提取的产物的电泳检测图。
27.图2为对宏基因组文库进行功能筛选时所获得的具有纤维二糖水解酶活性的阳性
克隆子图。
28.图3为不同iptg浓度下cbh2124相对酶活性的变化情况图。
29.图4为不同诱导温度下cbh2124相对酶活性的变化情况图。
30.图5为不同诱导时间下cbh2124相对酶活性的变化情况图。
31.图6为cbh2124的最佳反应温度测定图。
32.图7为在不同温度条件下cbh2124酶活性随时间变化图。
33.图8为cbh2124最佳反应ph的测定图。
34.图9为在不同ph条件下cbh2124酶活性随时间变化的图。
35.图10为不同金属离子对cbh2124酶活性影响的测定图。
具体实施方式
36.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
37.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
38.实施例1纤维二糖水解酶的制备
39.(1)红树林土壤总dna提取：
40.在珠海市淇澳岛红树林采集深度为10～20cm的土壤，使用hipure soil dna kit提取dna，1％琼脂糖凝胶电泳检测提取质量，检测结果如图1所示。
41.(2)宏基因组文库的构建及筛选：
42.将使用bamhⅰ酶切后的片段连接至puc118，转化至e.coli dh5α中。将阳性克隆子转移至含有0.2g/l 4
‑
甲基伞形酮基
‑
β
‑
d
‑
纤维二糖苷的lb培养基，培养2～3d，在365nm紫外灯下观察是否有荧光产生。结果如图2所示，获得一个产生荧光圈的克隆子。测序后获得seq id no：1的核酸序列，命名为cbh2124，其氨基酸序列如seq id no：2所示。
43.(3)cbh2124
‑
pet32a( )表达载体的构建方法：
44.设计一对pcr引物f1(cgg ggtacc atg gcc ccg cgt gaa cgc gct gcc aat g)和r1(cgc ggatcc aag att gac tac gac ggt cga gcc gcc ct)用于从阳性克隆子中扩增cbh2124基因。f1和r1中的下划线部分分别为限制性内切酶kpni和bamhi的切位点。pcr条件为94℃变性1分钟，60℃复性1分钟，72℃延伸2分钟。共进行30个循环。回收pcr产物，用kpni和bamhi酶切后，用连接酶连接到被同样两种酶酶切过的pet32a载体上，即构建成功cbh2124
‑
pet32a( )表达载体。
45.(4)纤维二糖水解酶的制备方法：
46.将构建好的cbh2124
‑
pet32a( )表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)，获得携带cbh2124基因的bl21(de3)转化菌株。将该菌株接种于5ml lb液体培养基中(含100μg/ml amp)中，于37℃、220rpm培养至od
600
＝0.8。在超净工作台中加入iptg使其终浓度为0.8mm，于30℃、200rpm诱导18h。
47.取诱导后的菌液离心收集菌体，用超纯水洗涤后重悬。使用超声破碎仪破碎菌体，离心后收集上清，上清即为纤维二糖水解酶粗酶液。所制备的纤维二糖水解酶可用以下方法检测其酶活性：检测所用酶促反应底物为4
‑
硝基苯基
‑
β
‑
d
‑
纤维二糖苷，反应体系如表1
所示，反应30min后加入200μl 1m na2co3终止反应，检测405nm波长的吸光值，定义酶活性最高值为100％，每个反应设置三个平行试验和一组对照试验。
48.表1测定酶活性的反应体系
[0049][0050]
实施例2最佳iptg诱导浓度的筛选
[0051]
接种带有cbh2124
‑
pet32a( )的bl21菌株于5ml lb液体培养基中(100μg/ml amp)中，于37℃、220rpm培养至od
600
＝0.8。在超净工作台中加入iptg使其终浓度分别为0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm、1.0mm、1.2mm，于30℃、200rpm诱导18h。
[0052]
取诱导后的菌液离心收集菌体，用超纯水洗涤后重悬。使用超声破碎仪破碎菌体，离心后收集上清测定酶活。检测所用酶促反应底物为4
‑
硝基苯基
‑
β
‑
d
‑
纤维二糖苷，反应体系如表1所示，反应30min后加入200μl 1m na2co3终止反应，检测405nm波长的吸光值，定义酶活性最高值为100％，每个反应设置三个平行试验和一组对照试验。
[0053]
结果如图3所示，iptg终浓度为0.8mm时，相对酶活性最高，因此确定最佳iptg诱导浓度为终浓度0.8mm。
[0054]
实施例3最佳诱导温度的筛选
[0055]
接种带有cbh2124
‑
pet32a( )表达载体的bl21(de3)菌株于5ml lb液体培养基中(100μg/ml amp)中，于37℃、220rpm培养至od
600
＝0.8。在最佳iptg诱导浓度下分别于20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃下200rpm诱导18h。酶活性测定方法同实施例1。
[0056]
结果由图4可知，诱导温度为22℃时，相对酶性活最高，因此确定最佳诱导温度为22℃。
[0057]
实施例4最佳诱导时间的筛选
[0058]
接种带有cbh2124
‑
pet32a( )的bl21菌株于5ml lb液体培养基中(100μg/ml amp)中，于37℃、220rpm培养至od
600
＝0.8。在最佳iptg诱导浓度及最佳诱导温度下分别诱导10h、12h、14h、16h、18h。酶活性测定方法同实施例1。
[0059]
结果由图5可知，诱导时间为14h时，相对酶活性最高，因此确定最佳诱导时间为14h。
[0060]
实施例5温度对酶活性和稳定性的影响
[0061]
在表1反应体系的条件下，分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下水浴反应30min后加入200μl 1m na2co3终止反应，每个反应设置3组重复和1组对照组，检测405nm波长的吸光值，定义酶活性最高值为100％，以相对酶活性结果逐步缩小温度区间，最终确定最适反应温度。
[0062]
温度对纤维二糖水解酶稳定性的影响则分别于20℃、30℃、40℃下水浴1h、2h、3h、4h、5h后加入表1反应体系，在最适反应温度下反应30min，加入200μl 1m na2co3终止反应，
每个反应设置3组重复和1组对照组，检测405nm波长的吸光值，定义酶活性最高值为100％。
[0063]
结果由图6和图7可知，最佳反应温度为22℃；20℃、30℃、40℃下放置5h酶活性相较于放置1h酶活性没有出现明显下降，表明该多肽在20℃～60℃反应温度区间有较好的稳定性，可以长时间发生反应并保持酶活。
[0064]
实施例6 ph对酶活性和稳定性的影响
[0065]
在表1反应体系的条件下，分别于ph 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0条件下在最适温度下水浴反应30min后，加入200μl 1m na2co3终止反应，每个反应设置3组重复和1组对照组，检测405nm波长的吸光值，定义酶活性最高值为100％，以相对酶活性结果逐步缩小温度区间，最终确定最适反应ph。
[0066]
温度对纤维二糖水解酶稳定性的影响则分别于ph为5.6、6.2、7.0条件下水浴1h、2h、3h、4h、5h后加入表1反应体系，在最适反应温度下反应30min，加入200μl 1m na2co3终止反应，每个反应设置3组重复和1组对照组，检测405nm波长的吸光值，定义酶活性最高值为100％。
[0067]
结果由图8和图9可知，最适ph为6.2，cbh2124属于弱酸性纤维二糖水解酶；在三种ph条件下放置5h酶活性相较于放置1h酶活性没有出现明显下降，且在ph 6.2下放置3h后出现活性提高的现象。
[0068]
在最佳iptg诱导浓度0.8mm，最佳诱导温度22℃，最佳诱导时间14h，以及最适ph为6.2条件下，测定最佳酶活为18.2u/ml。
[0069]
实施例7金属离子对酶活性的影响
[0070]
在表1反应体系下，分别加入金属离子(k

、ca
2
、mg
2
、cu
2
、fe
2
、ni

、zn
2
、mn
2
、co
2
)至终浓度为1mm、5mm、15mm，于最适温度和最适ph下应30min后加入200μl 1m na2co3终止反应，每个反应设置3组重复和1组对照组，检测405nm波长的吸光值，定义酶活性最高值为100％。
[0071]
结果由图10可知，大多数离子对酶活性有促进作用，其中低浓度的mn
2
(1mm)对酶活性的促进作用最为明显，酶活性提升到210％；中、高浓度fe2、zn
2
酶活性抑制作用较为明显，中浓度(5mm)时，酶活性分别下降至58％、46％，高浓度(15mm)则下降至22％、13％；cu
2
对酶活性的抑制最为明显，低浓度时酶活性下降至14％，高浓度时无法检测到酶活性。
[0072]
实施例8有机溶剂对酶活性的影响
[0073]
在表1反应体系下，分别加入有机溶剂乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、dmso(终浓度1％、15％、30％)，金属离子螯合剂edta(终浓度10mm、25mm、50mm)、表面离子活性剂sds(1％、5％、10％)于最适温度和最适ph下应30min后加入200μl 1m na2co3终止反应，每个反应设置3组重复和1组对照组，检测405nm波长的吸光值，定义酶活性最高值为100％，结果如表2所示。
[0074]
表2有机溶剂对酶活性的影响
[0075][0076][0077]
注：nd代表未检测到活性
[0078]
结果如表2有机溶剂对酶活性的影响可知：在有机溶剂中，随着甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇浓度的增加，酶活性均下降，且下降趋势相似，尽管随着有机溶剂浓度增加，酶活下降，但是依然表现出较好的酶活力，体现其耐受性好。而随着dmso浓度的增加对酶活性并无影响。而在edta的浓度增加中，低浓度下酶活性下降至76％，但edta浓度增加时，酶活性并没有进一步下降。sds对酶活性影响最为明显，在低浓度下cbh2124已经失去活性。