用于检测猫疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于检测猫疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法。


背景技术：

2.猫疱疹病毒(fhv)属于大型的病毒，直径在100-130nm，具有封套及双股的dna，在细胞核内进行增殖，并形成核内包涵体。猫感染fhv后表现出猫鼻性支气管炎，也简称猫鼻支，是猫最常见的病毒感染，其典型症状为以病毒引起的猫呼吸道感染为主，类似感冒的流鼻涕、咳嗽、发烧、打喷嚏、精神差，废食。由于病毒侵害猫的眼结膜，所以，患病的猫会出现流眼泪以及脓性分泌物，形成结膜水肿，严重时会导致角膜溃疡甚至失明。猫在患有几种主要疾病时临床症状相似，并常有混合感染，给诊断造成困难。传统的病毒诊断需要进行病毒分离、细胞培养、电镜观察及免疫检测等方法，缺乏对病毒进行快速、准确、敏感的检测方法。目前针对猫疱疹病毒检测的试剂盒大多存在操作复杂、特异性差、灵敏度低及检测结果准确性不高等缺陷。鉴于此，本发明建立了一种快速检测fhv的方法，为临床检测提供了保障。


技术实现要素：

3.本发明的目的是克服现有技术中对猫疱疹病毒检测操作复杂、特异性差、灵敏度低及检测结果准确性不高的问题。
4.为此，本发明提供了一种用于检测猫疱疹病毒的引物探针组合物，包括：
5.正向引物，其序列为：5
’‑
ccacaataacaggatatca-3’；
6.反向引物，其序列为5
’‑
tgatatcctgttattgt-3’；
7.探针，其序列为：5
’‑
ccctaatcatagatagacaccctctc-3’。
8.具体的，上述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
9.具体的，上述荧光报告基团包括fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种；所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2或bhq3中的一种。
10.具体的，上述pcr反应液包括权利要求1-3任意一项所述的用于检测猫疱疹病毒的引物探针组合物。
11.具体的，上述pcr反应液包括：1-5mm的mgcl2、20-50mm的tris、100-500mg/l的bsa、10-100μm的dntps、0.1-1.0μm的正向引物、0.1-1.0μm的反向引物、0.1μm的探针。
12.具体的，上述用于检测猫疱疹病毒的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
13.具体的，上述阳性对照为利用猫鼻气管炎病毒605株构建的质粒；所述阴性对照为超纯水。
14.本发明还提供了一种用于检测猫疱疹病毒的方法，包括以下步骤：
15.(1)提取待测样本的dna；
16.(2)以待测样本的dna为模板，进行荧光定量pcr反应，所述pcr反应体系包括上述
任意一项所述的用于猫疱疹病毒的引物探针组合物；
17.(3)pcr反应结束后，根据ct值判定检测结果。
18.具体的，上述步骤(2)中pcr反应程序为：95℃，3min；94℃，10s，58℃，20s，40个循环。
19.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
20.本发明提供的这种以用于检测猫疱疹病毒的引物探针组合物作为主要成分的试剂盒耗时短、特异性高、重复性好、灵敏度高，接近现有技术中检测猫疱疹病毒的最高水平，为诊断猫疱疹病毒提供可靠的实验依据。
21.以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
22.图1是本发明实施例2中pcr反应结果。
具体实施方式
23.下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
24.本发明提供了一种用于检测猫疱疹病毒的引物探针组合物，包括：
25.正向引物，其序列为：5
’‑
ccacaataacaggatatca-3’；
26.反向引物，其序列为5
’‑
tgatatcctgttattgt-3’；
27.探针，其序列为：5
’‑
ccctaatcatagatagacaccctctc-3’。
28.探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。其中，荧光报告基团包括fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种；所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2或bhq3中的一种。
29.本发明还提供了一种用于检测猫疱疹病毒的试剂盒，包括pcr反应液、阳性对照和阴性对照。
30.其中，pcr反应液包括上述任意一项所述的用于检测猫疱疹病毒的引物探针组合物。具体的，pcr反应液包括：1-5mm的mgcl2、20-50mm的tris、100-500mg/l的bsa、10-100μm的dntps、0.1-1.0μm的正向引物、0.1-1.0μm的反向引物、0.1μm的探针；
31.阳性对照为利用猫鼻气管炎病毒605株构建的质粒；阴性对照为超纯水。
32.本发明还提供了一种用于检测猫疱疹病毒的方法，包括以下步骤：
33.(1)提取待测样本的dna；
34.(2)以待测样本的dna为模板，进行荧光定量pcr反应，所述pcr反应体系包括上述任意一项所述的用于猫疱疹病毒的引物探针组合物；pcr反应程序为：95℃，3min；94℃，10s，58℃，20s，40个循环；
35.(3)pcr反应结束后，根据ct值判定检测结果。
36.下面通过具体实施例对本发明的用于检测猫疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒
及方法的效果进行研究。
37.实施例1：
38.本实施例提供了一种用于检测猫疱疹病毒的试剂盒，包括如下组分：
39.(1)pcr反应液：2mm的mgcl2、50mm的tris、500mg/l的bsa、100μm的dntps、0.1μm的正向引物、0.1μm的反向引物、0.1μm的探针。
40.其中，正向引物序列为：5
’‑
ccacaataacaggatatca-3’；
41.反向引物序列为5
’‑
tgatatcctgttattgt-3’；
42.探针序列为：5
’‑
ccctaatcatagatagacaccctctc-3’。
43.探针的5’端标记有fam荧光报告基团，3’端标记有bhq1荧光淬灭基团。
44.(2)阳性对照：分离辉瑞三多疫苗605构建的质粒；阴性对照：超纯水。
45.实施例2：
46.本实施例提供了一种使用实施例1中试剂盒检测猫疱疹病毒的方法，包括以下步骤：
47.(1)在试管中加入3μl的pcr反应液，瞬时离心后作为一份pcr-mix备用；
48.(2)取患猫样本，使用商品化的核酸提取试剂盒，进行dna提取，作为待测样本备用；
49.(3)取三份pcr-mix，向其中分别加入2μl待测样本、2μl阴性对照、2μl阳性对照，将加样后的试管放入q3 plus荧光定量pcr仪，进行pcr扩增，反应程序为：95℃，3min；94℃，10s，58℃，20s，40个循环。
50.阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。
51.阳性对照ct值小于38，阴性对照ct无数值；在阈值以上的荧光曲线应当是具有明显的s型曲线，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。
52.采用本发明提供的方法检测猫疱疹病毒时，判断标准如下：
53.1、检测样本ct≤38.0者判为阳性。
54.2、38.0＜ct≤40的检测样本建议重做，重做结果中ct值《40者为阳性，否则为阴性。
55.以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。