一种提升解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽fengycin产量的方法与流程

1.本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种提升解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽fengycin产量的方法。


背景技术：

2.随着绿色健康、环保可持续发展理念的推广，以及抗生素滥用引起致病菌抗药性的增强，抗生素替代品成为人们的研究热点。fengycin是解淀粉芽孢杆菌通过非核糖体途径合成的具有强烈抑制丝状真菌的脂肽，因其稳定性好，安全性高且不易产生耐药性等优势而被认为具有开发为新型防腐剂、抗菌药物，也被视为未来抗生素替代品之一，有望弥补当今普遍存在的抗生素耐药性难题。最新研究也表明，fengycin的环状氨基酸和链状脂质结构与致病菌金黄色葡萄球菌群体感应系统中产生的自身诱导肽(aip)化学结构相似，其可通过竞争性抑制，与其细胞表面的aip结合，扰乱金黄色葡萄球菌的群体稳定性，抑制其在肠道的定植，研究也表明fengycin能抑制肿瘤细胞的增殖与扩散。综上所述，fengycin具有广谱的抑菌活性，fengycin在食品防腐保鲜、农业应用生产和临床医学治疗等方面将有广阔应用前景。现如今阻碍fengycin应用的最大阻力源于其较低的产量，但低产量阻遏了其进一步的开发使用，因此提高fengycin产量是亟待解决的问题。大多研究者已报到通过优化培养基组分或者基因工程分子操作手段提高其产量，而关于生物催化剂法提高其产量的鲜有报道。
3.蒙脱石粉是含双八面体的蒙脱石粉微粉，具有层状结构及非均匀性电荷分布，因具有较强的吸附性和固定性能而被开发为益生菌包被制剂，其可促进益生菌的肠道定植，同时对消化道黏膜还具有很强的覆盖保护能力，修复、提高點膜屏障对攻击因子的防御功能。而关于蒙脱石粉在微生物代谢过程中的相互作用至今未有相关报道。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种提升解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽fengycin产量的新方法。与常规的培养基优化法和基因工程改造菌株提高脂肽fengycin的方法相比，该发明的成本低且可操作性强，稳定性高等优点，具有扩展fengycin市场应用的潜力。
5.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种提升解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽fengycin产量的方法，将解淀粉芽孢杆菌接种到含有蒙脱石粉的发酵培养基中进行发酵培养，提升抗菌脂肽fengycin产量。
6.作为优选，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌cgmcc no.18719或者cgmcc no.18720。
7.其中，所述方法包括如下步骤：
8.(1)将解淀粉芽孢杆菌活化培养得到种子培养液；
9.(2)将步骤(1)得到的种子培养液按照体积比1％-5％的接种量接种于发酵培养基
中，随后添加蒙脱石粉，在30-37℃进行培养；
10.(3)将步骤(2)得到的发酵液于离心，弃除菌体和蒙脱石粉的沉淀混合物，得到无细胞上清液；
11.(4)将步骤(3)得到的无细胞上清液调节ph过夜酸沉；
12.(5)将步骤(4)得到的沉淀物离心，收集沉淀物，加水调节为中性，冻干后用甲醇萃取，将甲醇的萃取混合物旋蒸制得fengycin粗提物冻干粉；
13.(6)将步骤(5)得到的脂肽粗提物干粉溶解过滤，利用hplc进行鉴定。。
14.其中，步骤(1)所述活化培养的液体活化培养基组分为：每1l包括牛肉浸膏5-10g，蛋白胨5-20g，酵母浸膏5-10g，nacl 5-10g，葡萄糖5-10g；麸皮1-5g，ph 6.5-7.0。
15.其中，步骤(1)所述活化培养条件为30～37℃，150rmp～220rmp，培养8～16h，待检测od600＝0.5～1时备用，即制得种子液。
16.其中，步骤(2)所述发酵培养基每1l包括：牛肉浸膏1-5g，谷氨酸钠5-20g，kcl 0.5-1g，nacl 1-3g，kh2po
4 1-2g，mgso
4 0.5-1g，mnso
4 1-5mg，cuso
4 0.05-0.16mg，feso4·
7h2o 0.05-0.19mg，znso
4 0.05-0.5g，果糖10-50g，葡萄糖10-30g。
17.其中，步骤(2)所述蒙脱石粉暴露于紫外灯下照射再加入发酵培养基中。
18.其中，步骤(2)所述蒙脱石粉的添加量为0.01-1g每100ml发酵培养基。
19.其中，步骤(2)所述发酵条件为29-37℃条件下培养50-74h。
20.本发明通过在解淀粉芽孢杆菌发酵过程中添加大表面积固体基质，发现其对fengycin产量有显著的影响，可能是蒙脱石粉的添加增加了菌体的浓度或者吸附了菌种发酵过程中的一些信号物质，通过酸沉图片的展示和高效液相色谱检测、对比蒙脱石粉添加对解淀粉芽孢杆菌fengycin产量的影响，随后通过fengycin抑菌试验验证其抑菌效果。
21.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
22.本发明在向解淀粉芽孢杆菌发酵体系中添加蒙脱石粉，可以显著提高次生代谢产物fengycin产量。
23.本发明的操作成本低，可重复性高，应用范围广泛。
附图说明
24.图1为本发明为酸沉后的沉淀比较(添加0.1g蒙脱石粉后酸沉的试图比较，蒙脱石粉组(左)，未添加蒙脱石粉组(右))；
25.图2为fengycin标准品hplc图；
26.图3为解淀粉芽孢杆菌液态发酵产物hplc图(添加蒙脱石粉组发酵液的fengycin hplc检测)；
27.图4为解淀粉芽孢杆菌液态发酵产物hplc图(未添加蒙脱石粉发酵组的fengycin hplc检测)；
28.图5、图6、图7、图8、图9为fengycin粗提物一级质谱图(质荷比1450.2、1464.3、1478.4、1492.1、1506.5)。
具体实施方式
29.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
30.本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
31.其中解淀粉芽孢杆菌cgmcc no.18719、cgmcc no.18720，由淮阴工学院提供，申请人在先专利cn110951667a中已经公开保藏。
32.蒙脱石粉购自淮安贝特生物科技有限公司。
33.固体活化培养基的组分为：牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，nacl5g，葡萄糖10g，麸皮2g，琼脂粉1.5g，蒸馏水定容至1l，ph＝7.0，115℃灭菌30min；液体活化培养基不含琼脂粉。
34.实施例1
35.将保存的解淀粉芽孢杆菌cgmcc no.18719在固体活化培养基上划线，挑去单菌落接至液体活化培养基中。活化培养条件为35℃，180rmp，培养12h，待检测od600＝1.0左右时备用，即制得种子液。
36.实施例2
37.解淀粉芽孢杆菌的发酵
38.(1)蒙脱石粉的称取及紫外灭菌
39.准确称取0.05g、0.1g、0.5g和1g蒙脱石粉，并暴露与紫外灯下照射60min；
40.(2)发酵培养基的制备及高温灭菌
41.准确称取牛肉浸膏1g，谷氨酸钠14g，kcl 0.5g，nacl 2.5g，kh2po
4 1g，mgso
4 0.5g，mnso
4 5mg，cuso
4 0.16mg，feso4·
7h2o 0.15mg，znso4 0.12g，果糖40g，葡萄糖25g，蒸馏水定容至1l，ph＝7.0，115℃灭菌30min；
42.实施例1中种子液以体积比5％的接种量接种于发酵培养基(100ml)中，再准确称取0.1g蒙脱石粉加入上述发酵液中，每组设定3个平行，以未添加蒙脱石粉的培养瓶为空白对照。添加完成后将培养瓶于33℃，180rmp下培养72h。
43.实施例3
44.fengycin的分离与含量检测
45.(1)无细胞上清液的制备
46.将实施例2的发酵液分装500ml离心杯中，低温冷冻离心机，4℃，5,000
×
g离心20min；弃除菌体和蒙脱石粉的沉淀混合物，得到无细胞上清液；
47.(2)fengycin粗提物的制备
48.将(1)得到的无细胞上清液用6mol/l hcl调节ph值至2.0，放置冰箱中静止过夜。将酸沉后的体系再次进行离心，4℃，5,000
×
g离心20min，弃上清，加蒸馏水低温搅拌调节ph值7.0，冻干成粉末后用甲醇萃取，将甲醇的萃取混合物在45℃下用旋转真空蒸发器中制得脂肽粗提物干粉，于冰箱中保存备用；
49.添加0.1g蒙脱石粉后酸沉的结果如图1所示，研究结果显示，过夜酸沉的物质主要为脂肽类物质，而蒙脱石粉的添加，显著增加了发酵液中脂肽类物质的含量(图1，右)。
50.(3)fengycin的hplc检测
51.将(2)制得的脂肽粗提物(添加0.1g蒙脱石粉)用甲醇溶解，使得终浓度为0.5mg/ml，经0.22μm有机滤膜过滤后通过hplc鉴定。色谱柱为：agilentc18柱，流动相a：乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流动相b：去离子水(含0.1％三氟乙酸)，流速：0.6ml/min，205nm紫外检
测，洗脱程序见表1，每个样品平行进样3次。
52.表1 hplc梯度洗脱程序
[0053][0054]
经过hplc检测，该发酵物质的峰形与fengycin标准品的峰型一致(图2，周振.解淀粉芽孢杆菌fengycin合成酶基因表达调控的研究[d]:淮阴工学院；2020)，其中1-6为fengycin的特征峰，相比于图4(未添加蒙脱石粉组的发酵体系)，图3的峰面积变化显著，这与酸沉、干燥粉末的称重结果相吻合，其中最大产量高达5.89g/l，较未添加蒙脱石粉组的fengycin提高了2.65倍。
[0055]
(4)fengycin质谱验证
[0056]
用飞行时间质谱法测定粗提物中脂肽类同源物的分子量。fengycin有许多同源化合物，相同分子量的风霉素的结构可能不同。通过esi/cid进一步分离风霉素各阶段的质谱离子峰，得到的质谱离子峰具有一定的规律性。通过fengycin特征m/z结果(质荷比1450.2、1464.3、1478.4、1492.1、1506.5)，鉴定该抗菌脂肽为fengycin及同系物(图5-图9)。
[0057]
同时将0.05g、0.5g和1g蒙脱石粉分别按上述相同的方法进行发酵实验，也可以有效提高fengycin产量，但是效果反而不如0.1g蒙脱石粉显著，说明蒙脱石粉不能过量或者过少添加。
[0058]
实施例4
[0059]
实施例1中种子液以体积比1％的接种量接种于发酵培养基(100ml)中，再准确称取0.1g蒙脱石粉加入上述发酵液中，每组设定3个平行，以未添加蒙脱石粉的培养瓶为空白对照。添加完成后将培养瓶于29℃，180rmp下培养74h。
[0060]
实施例5
[0061]
实施例1中种子液以体积比3％的接种量接种于发酵培养基(100ml)中，再准确称取0.1g蒙脱石粉加入上述发酵液中，每组设定3个平行，以未添加蒙脱石粉的培养瓶为空白对照。添加完成后将培养瓶于37℃，180rmp下培养50h。