一种针对人错配修复蛋白PMS2的单克隆抗体及其制备方法、免疫检测试剂及应用与流程

一种针对人错配修复蛋白pms2的单克隆抗体及其制备方法、免疫检测试剂及应用
技术领域
1.本发明属于单克隆抗体领域，具体涉及一种针对人错配修复蛋白pms2的单克隆抗体及其制备方法、免疫检测试剂及应用。


背景技术：

2.错配修复(mismatch repair，mmr)是指在含有错配碱基的dna分子中，使核苷酸序列恢复正常的修复方式。当mmr基因发生胚系突变或甲基化时将导致mmr功能下降，致使 dna序列中的碱基错配、缺失或插入不能被修复。因此，mmr系统是体内的一个安全保障体系，它可以维持遗传物质的完整性和稳定性。
3.mmr系统在参与dna修复时可涉及到多个错配修复蛋白，包括muts(msh2、msh3 和msh6等)和mutl(mlh1、mlh3、pms1和pms2)两大家族。其中，mlh1、msh2、 msh6及pms2是mmr的主导蛋白。
4.pms2基因缺陷是导致一小部分但意义重大的结直肠癌和大部分伴有微卫星不稳定性的肿瘤的原因。开发pms2单克隆抗体对该类肿瘤的病理诊断、药物开发等具有重要意义。
5.在pms2单克隆抗体的开发领域，据nordiqc(目前病理业界、世界范围内质控水平最高的质控委员会)的评比结果显示(如图1所示)，关于pms2的单克隆抗体，包括克隆号为 a16-4、mor4g、mrq-28、ep51、epr3947、qr009等进口产品，其中ep51的使用效果最为优异，ep51也是目前国际上最为广泛应用的单克隆抗体之一。但进口产品ep51的价格昂贵，这显然不利于国内本领域日常病理诊断工作的开展。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种针对人错配修复蛋白pms2的单克隆抗体，具有较好的特异性和亲和力，可作为进口产品ep51的替代产品使用。
7.本发明的第二个目的是提供含有上述单克隆抗体的免疫检测试剂。
8.本发明的第三个目的是提供上述单克隆抗体的应用。
9.本发明的第四个目的是提供上述单克隆抗体的制备方法。
10.为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
11.一种针对人错配修复蛋白pms2的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含氨基酸序列如seqid no:1-3所示的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，和氨基酸序列如seq id no:4-6所示的 vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。
12.本发明的针对人错配修复蛋白pms2的单克隆抗体，具有较好的特异性与亲和力，能够准确识别石蜡组织与冰冻组织中表达的pms2蛋白，在临床诊断与替代进口试剂上具有重要的意义。
13.优选地，所述单克隆抗体包含氨基酸序列如seq id no：7所示的重链可变区，和氨
基酸序列如seq id no：8所示的轻链可变区。采用以上序列更进一步保证了单克隆抗体的应用效果。
14.一种含有上述单克隆抗体的免疫检测试剂。
15.在以上单克隆抗体的基础上，可参考本领域公知技术构建免疫检测试剂。以免疫组化试剂盒为例，其他配套试剂，例如缓冲液、二抗试剂等，均可使用现有商品或参考现有技术进行制备。以上试剂盒属于针对国际优秀单克隆抗体ep51的替代产品，染色背景与ep51效果相当甚至更好。同时，较对照试剂而言，低浓度条件下即可达到优秀染色效果(特异性、强度)，预示相对于ep51具有更高的亲和力。
16.一种上述针对人错配修复蛋白pms2的单克隆抗体在免疫组化方面的应用。
17.通过实验验证，本发明的单克隆抗体在人错配修复蛋白pms2的免疫组化检测方面具有良好的应用效果，可以替代进口产品，从而大幅降低同类试剂的应用成本。
18.一种针对人错配修复蛋白pms2的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
19.(1)使用pms2免疫原免疫兔子，采集兔外周血，收集兔外周血单个核细胞，分离出抗原特异性b淋巴细胞；
20.(2)针对步骤(1)得到的抗原特异性b淋巴细胞，经过培养鉴定筛选出阳性细胞孔，进而获取抗体重链、轻链基因，扩增抗体重链、轻链目的基因，经重组、表达获得兔源单克隆抗体。
21.本发明的针对人错配修复蛋白pms2的单克隆抗体的制备方法，以兔子为免疫动物，兔子个体较大，在免疫效果评价与验证方面较好，可以方便筛选得到优势抗体。
22.可以使用单一pms2免疫原进行动物免疫，为提高单克隆抗体的开发效率，优选地，所述pms2免疫原包括pms2(错配修复蛋白pms2)、msh6(错配修复蛋白msh6)、inhibin-α (抑制素α)、mlh1(错配修复蛋白mlh1)和ck19(细胞角质蛋白19)。
23.优选地，步骤(2)中，在抗体重链、轻链基因5’端均增加一段如seq id no：13所示的核苷酸序列，然后进行所述扩增。通过增加以上序列，可提高目的基因的表达量。
24.优选地，步骤(2)中，扩增抗体重链目的基因时，重链上游引物的核苷酸序列如seq idno：9所示，重链下游引物的核苷酸序列如seq id no：10所示；扩增抗体轻链目的基因时，轻链上游引物的核苷酸序列如seq id no：11所示；轻链下游引物的核苷酸序列如seq id no： 12所示。
附图说明
25.图1为nordiqc关于pms2单克隆抗体的最佳克隆号及其使用效果汇总；
26.图2为实施例的e23抗体在结直肠癌组织中的免疫组化结果；
27.图3为对照抗体ep51在结直肠癌组织中的免疫组化结果；
28.图4为实施例的e23抗体在肺癌组织中的免疫组化结果；
29.图5为对照抗体ep51在肺癌组织中的免疫组化结果。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明的实施过程进行详细说明。
31.以下实施例中，为进一步改善动物免疫效果，添加了csf2细胞因子作为免疫伴侣
进行免疫(此方案为优选实施方案)。csf2蛋白可采用包括以下步骤的方法制得：
32.1)首先通过查阅uniprot数据库，确定天然csf2蛋白的全长基因，含启动子与终止密码子。
33.2)利用传统基因扩增与载体构建手段，将csf2基因构建到pcdna3.1等哺乳动物表达系统载体上，同时需要保证csf2构建成功后不含其它非自身基因(例如标签蛋白基因)。
34.3)利用瞬转表达方法将构建测序正确的目的载体(pcdna3.1-csf2)转染至经wb验证无相关蛋白表达的兔肾细胞rk-13等兔源哺乳动物表达系统。利用常规wb手段检测表达水平。
35.4)待表达水平达到要求后，利用免疫亲和层析手段，将抗cfs2抗体偶联至纯化基质上，利用抗原抗体结合特点，将破碎及上清离心过滤的目标溶液经该方法纯化，将洗脱下来的 cfs2依据等电点调保存ph，储存在pbs缓冲体系条件下分装，-80℃条件保存。
36.实施例1针对人错配修复蛋白pms2的单克隆抗体
37.本实施例的针对人错配修复蛋白pms2的单克隆抗体，重链可变区的氨基酸序列如seqid no：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：8所示。重链可变区vhcdr1、 vhcdr2和vhcdr3的氨基酸序列分别如seq id no：1、seq id no：2、seq id no3所示；轻链可变区vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的氨基酸序列分别如如seq id no：4、seqid no：5、seq id no：6所示。
38.实施例2针对人错配修复蛋白pms2的单克隆抗体的制备方法
39.本实施例对实施例1的单克隆抗体的制备过程进行说明：
40.2.1、动物免疫
41.将5种免疫原(免疫原i、ii、iii、iv、v分别为pms2、msh6、inhibin-α、mlh1和ck19) 和免疫伴侣(csf2蛋白)加入水溶性佐剂中，得到免疫试剂，控制免疫伴侣在免疫试剂中的浓度为50μg/ml，5种免疫原的免疫剂量均为100μg/只。然后采用免疫试剂免疫新西兰大白兔，在评估免疫效果达到预期后，对兔子进行免疫原冲击免疫，以达到调动兔子机体针对目标免疫原的b淋巴细胞快速激活。
42.动物免疫时以腿部肌肉方式进行免疫，周期为两个月。免疫完成后，利用e(pms2)蛋白对该兔的耳缘静脉采集血液进行抗体滴度检测，以检测结果达到1
×
105以上为合格。效价达到要求之后，对兔子进行e(pms2)免疫原冲击免疫，待第3天通过耳缘静脉采集10ml 血液。
43.2.2、兔外周血采集与pbmcs分离、b淋巴细胞分离与培养
44.从冲击免疫后兔子的外周血中先利用淋巴细胞分离液分离获得pbmcs细胞(即外周血单个核细胞；可利用商品化兔外周血淋巴细胞分离试剂盒实现)，随后利用b淋巴细胞表面标志物cd4、cd8、cd14、cd28、cd80进行负筛，去除t、单核等细胞，提高b淋巴细胞的丰度。
45.然后利用荧光染料fitc标记的山羊抗兔igg挑选表达识别免疫原的b淋巴细胞。
46.再利用商品化的生物素标记试剂盒，按照说明书分别对免疫原i、ii、iii、iv、v进行标记，各免疫原按摩尔量1：1：1：1：1进行混合，混匀后与商品化的亲和素标记偶联荧光素 (fitc)试剂，在2～8℃条件下孵育1h(期间需要晃动搅拌)，得到生物素-亲和素筛选试剂。将孵育完成的生物素-亲和素筛选试剂分装放在2～8℃条件下保存，使用时按照细胞量(1
×
106个细胞/5μl)进行添加。利用生物素-亲和素筛选试剂再次对b淋巴细胞进行正筛，得到识别各种免疫原的b淋巴细胞群。
47.2.3、b淋巴细胞培养上清elisa检测
48.对于分选出的b淋巴细胞群进行铺板培养，按照1～2个细胞/孔铺入预先含有滋养层细胞的96板中，同时添加il-2、il-10细胞因子进行共培养，待培养时间达到7～14天后，分别利用5种免疫原(免疫原i、ii、iii、iv、v)分别进行elisa检测，选择免疫前兔子采集的血清为阴性对照孔，以大于阴性对照孔2.1倍定义为阳性，选择阳性孔。通过该步骤可以筛选出分别针对各免疫原的抗体，一次分选培养可以得到识别多种免疫原的细胞阳性孔。
49.利用间接elisa检测方法对上清进行检测，以e(pms2)蛋白包被elisa检测板筛选出分泌有目标抗体的细胞培养孔。
50.2.4、cdna获取、重轻链基因扩增并测序
51.对筛选获得的抗体细胞株孔进行细胞裂解，提取rna并通过rt-pcr方法获得cdna，利用pcr扩增方法对重轻链基因分别进行扩增，经测序确定序列。具体序列信息如实施例1 所示。
52.在获得抗体重链、轻链目的基因之后。通过pcr的方法在两条抗体完整基因上游5’端均同时增加一段可增加表达量的信号区碱基序列，如seq id no：13所示： aaaccacaagacagacttgcaaaagaaggc。然后设计抗体重链与轻链上下游引物进行目的基因扩增，从而在目的基因上游增加一段信号区，方便提高后期目的基因表达量。
53.设计抗体重链与轻链的上下游引物分别为：
54.重链上游：gtttaaacggatctctagcgaattcaaaccacaagacaga，如seq id no： 9所示；
55.重链下游：agaggtcgaggtcgggggatccctatttacccggagagcg，如seq id no：10所示；
56.轻链上游：gtttaaacggatctctagcgaattcaaaccacaagacaga，如seq id no： 11所示；
57.轻链下游：agaggtcgaggtcgggggatccctagcagtcacccctatt，如seq id no： 12所示。
58.pcr扩增循环设定为：i:95℃5min；ii：95℃10s；iii:56℃10s；iv：72℃60s；ii～iv：循环35次；72℃：5min。1％核酸电泳目的条带并切胶回收目的片段，该操作参考axygen 切胶回收试剂盒说明书要求进行操作。
59.2.5、构建重链抗体重组质粒、轻链抗体重组质粒
60.扩大培养ptt5阳性dh5α菌株，进行质粒(ptt5质粒)提取及双酶切(ecori与bamhi) 操作。质粒提取按照axygen质粒提取试剂盒说明书操作要求进行。双酶切反应体系为：ptt5 质粒2μg，ecori 1.5μl，bamhi 1.5μl，buffer 5μl，ddh2o 40μl；酶切条件为37℃水浴，酶切时间为2h。对酶切后的体系进行核酸电泳并切胶回收双酶切质粒片段，该操作参考axygen切胶回收试剂盒说明书要求进行操作。
61.将目的基因片段和双酶切质粒片段利用无缝克隆试剂盒进行同源重组，该步骤参考近岸无缝克隆试剂盒(货号：nr005-01a)说明书操作要求进行。
62.无缝重组后转dh5α感受态细胞，涂氨苄抗性的lb平板。37℃条件下温箱培养过夜。第二日挑单克隆5个进行基因测序，对测序结果正确的扩大培养提取重轻链质粒。
63.2.6、质粒转染
64.分别将经过扩大培养获得的高浓度质粒，按照pei转染试剂操作说明书进行操作，抗体重链与轻链按照摩尔质量1：1进行预先混合，利用cho(或293f)细胞基础培养基稀释质粒，同时等体积的该培养基稀释pei，质粒：pei＝1：2，w/w。转染到培养至对数生长期的 cho细胞(或293f细胞)中。待培养至48h后，经过间接elisa方法对上清分泌的抗体滴度进行检测，确定表达量相对较高的细胞系。
65.2.6、抗体工程化表达、纯化
66.对确定的细胞系进行扩大培养至500ml培养基，调整细胞生长状态至对数生长期，转染质粒并培养48～72h后，收集细胞。上清通过离心去细胞后，经过protein g柱进行亲和层析纯化，对结合吸附获得的抗体通过ph3.0的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，利用ph8.8 的tris-hcl溶液迅速中和到ph7.2～7.4之间。纯化得到的抗体再经过透析处理浓缩至1mg/ml 浓度以上。
67.实施例3免疫组化检测试剂
68.本实施例的免疫组化检测试剂为pms2免疫组化检测试剂，为实施例1的单克隆抗体的工作液，其抗体浓度为0.5μg/ml，溶剂为tbs缓冲液，添加保护性蛋白bsa(牛血清白蛋白，含量为10mg/ml)，添加防腐剂proclin-300与proclin-950(均按1:1000(v/v)的比例添加)。
69.在实施例的单克隆抗体基础上，配套试剂为酶标检测板、辣根过氧化物酶标记二抗、标准品、标准品稀释液、tmb显色底物、终止液，则可构建elisa检测试剂盒。
70.实施例4在免疫组化方面的应用
71.4.1、在结直肠癌组织中的应用
72.以上述实施例的单克隆抗体工作液为一抗，对结直肠癌组织进行染色，染色过程如下：
73.1、结直肠癌石蜡组织样本3μm切片，65℃条件下烤片2h。
74.2、脱蜡与水化：石蜡切片以下经以下处理：二甲苯15min-二甲苯15min-无水乙醇5min
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无水乙醇5min-90％乙醇5min-80％乙醇5min-70％乙醇5min，纯化水浸泡5min。
75.3、抗原修复：利用ph9.0的edta溶液加热煮沸20min，自然冷却5min后，用自来水使之冷却，液体冷却后取出切片，纯水浸泡5min，tbs冲洗浸泡5min共2次。
76.4、加过氧化物酶封闭剂100μl/张，室温下孵育5min，tbs冲洗浸泡5min共2次。
77.5、一抗孵育：加入上述制备抗体的工作液，37℃条件下孵育30min，tbs冲洗浸泡2次， 5min/次。
78.6、二抗孵育：先滴加100μl二抗，37℃孵育30min，tbs冲洗浸泡2次，5min/次。
79.7、显色：除去tbs溶液，滴加100μl dab显色液，室温孵育5min，纯化水浸泡2次， 5min/次。
80.8、复染：滴加100μl苏木素复染液室温孵育3min，纯化水浸泡2次，5min/次。
81.9、脱水透明：常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明。
82.10、中性树胶封片观察。
83.上述实施例所制备的抗体e23与进口产品ep51的染色结果分别如图2和图3所示。
84.由以上对比结果可知，与对照抗体ep51对比，e23具有较好的特异性与亲和力，抗体浓度在0.5μg/ml(ep51的抗体浓度约为1μg/ml)即可达到较强的染色效果与较佳的背景。
85.4.2、在肺癌组织中的应用
86.参考4.1的过程在肺癌组织中观察应用效果，e23与进口产品ep51的染色结果分别如图 4和图5所示。
87.结果表明，在肺癌组织中，与对照抗体ep51对比，e23具有较好的特异性与亲和力，抗体浓度在0.5μg/ml即可达到较强的染色效果与较佳的背景。
88.4.3、一致性评价
89.参照以上实施例的方式，将对照抗体ep51与抗体e23在多个组织中进行检测结果评价，结果如下表1所示。评价组织包括结直肠癌组织、肺癌组织、扁桃体、阑尾(急性坏疽性阑尾炎)、胎盘、正常脾脏、正常结肠、肝脏-中分化肝细胞癌、胰腺、肺(支气管，肺泡)、正常肾脏、甲状腺(滤泡)、混合性生殖细胞肿瘤、卵巢浆液性癌、右侧卵巢囊肿、嗜铬细胞瘤、左前臂恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、胶质母细胞瘤、滑膜肉瘤、乳腺纤维腺瘤、孤立性纤维瘤、浆液性癌、输尿管-小细胞肿瘤、胚胎性肿瘤、梭型细胞肿瘤、弥漫型星形细胞瘤、急性化脓性阑尾炎、宫颈、胸腺、弥散性大b细胞淋巴瘤、精原细胞癌、胸腺瘤、神经鞘瘤、宫颈-鳞状细胞癌等，评价数量共98个。
90.表1对照抗体ep51与抗体e23的组织评价统计
[0091][0092]
由表1可知，在检测结果评价方面，实施例的抗体与对照抗体ep51无差异。