一种可用于线虫培养及即时固定的微流控芯片装置的制作方法

1.本发明属于微流控芯片分析技术领域，涉及微流控芯片对线虫的操控技术、线虫液态培养基培养技术、线虫光学成像分析技术，具体涉及一种可进行线虫培养及即时固定的微流控芯片装置。


背景技术：

2.模式动物秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)具有生长繁殖迅速，易于培养，个体微小，结构简单，方便进行分子生物学操作等优势。线虫取自土壤环境，其生命力顽强，易于培养，线虫培养可以分为固体培养基和液体培养基。固定培养基上培养有大肠杆菌是线虫的主要食物，液体培养基又分为含菌和无菌培养基，其中无菌培养基不含细菌培养基中含有盐类、氨基酸、核苷酸、维生素、能量物质等线虫生长发育必须的营养成分，例如由lu和goetsch提出的c.elegans maintenance medium(cemm)液态培养基。液体培养基培养线虫需要对其进行驯化，其个体形态会更为细长，寿命延长1倍。液体培养基培养方法使得线虫可以被培养在封闭的环境中，例如，微流控芯片通道内。液体培养基中添加线虫食物op50型大肠杆菌可以加快线虫生长速度。
3.线虫体微小，成虫体长1毫米，宽约80微米，对其进行捕获操作、固定观察操作等有一定难度，蓬勃发展的微流控芯片技术以其在微纳尺度出色的操控能力，已经广泛应用于线虫的操控。使用微流控芯片固定线虫，实验完毕线虫被释放还可以再培养，并能保持较好活性，是一种无伤害的线虫固定技术。使用常规固定技术，例广泛使用的胶水粘附法固定线虫后将无法再回收。培养中的线虫各项生理功能处于自然状态，进行即时固定进行光学成像分析，可以最大程度降低固定操作对其自然生理状态的影响。
4.本发明公开了一种在微流控芯片上利用薄膜下压法联合芯片上线虫培养技术进行培养中线虫的即时固定方法。


技术实现要素：

5.发明目的：为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种可用于线虫培养及即时固定的微流控芯片装置，使用微流控芯片实现培养中线虫的即时无伤害固定。
6.技术方案：一种可用于线虫培养及即时固定的微流控芯片装置，包括玻璃基片，所述的玻璃基片上设有线虫培养室，所述的线虫培养室为栅栏结构围成的圆形空间，圆形栅栏的外侧分别设有液态培养基(cemm)进样出样的通道和线虫进样与出样的通道，所述的线虫培养室的上方设有一圆形气腔室，培养室与圆形气腔室之间为一层pdms薄膜，所述的圆形气腔室内施加气压迫使pdms薄膜下压，推挤线虫，将线虫挤向圆形栅栏，将细长的虫体平行于栅栏压紧，实现对线虫的固定。
7.作为优化：所述的线虫被圈养在一个直径为8毫米，高为100微米的圆形栅栏内，采用长方体的柱子围成圆形栅栏，圆形栅栏的间缝隙宽度为20微米。
8.作为优化：液态培养基(cemm)及水可以自由通过圆形栅栏，但线虫不能穿过圆形
栅栏，被约束在圆形栅栏内饲养。
9.作为优化：新鲜的液态培养基(cemm)可以从圆形栅栏的一端培养基进样通道通过圆形栅栏进入线虫培养室中，从另一端流出，液态培养基(cemm)的进样速度为50微升每分钟。
10.作为优化：所述的pdms薄膜的厚度为100微米。
11.作为优化：所述的圆形气腔室内施加气压下压pdms薄膜的具体方式如下：圆形气腔室内先充满水，pdms薄膜允许气体分子通过，水分子无法通过，将圆形气腔室充满水后，调控压力实现对pdms薄膜的压紧，压紧过程需缓慢进行，将线虫推到边缘后可进一步实施压紧，完成线虫的固定。
12.作为优化：线虫压紧固定好后，可以进行光学成像分析；分析结束后，撤去气压，即可恢复线虫培养腔室，线虫可以继续活动。
13.作为优化：所用的线虫为液态培养基(cemm)驯化后的线虫，培养温度为21℃，所使用cemm培养基含op50型大肠杆菌(109个每毫升)。
14.有益效果：本发明的装置结构原理简单，操作方便，可以实现线虫培养中的即时无伤害固定，最大程度降低固定操作对其自然生理状态的影响。使用圆形栅栏，方便线虫培养，线虫进出栅栏可以实现零丢失，进样及回收率为100％。
15.本发明可以实现线虫肠细胞钙离子动态变化的成像检测分析，对肠细胞带有钙离子荧光探针的线虫进行芯片上培养，固定后可以实时观察肠细胞钙离子变化水平。
附图说明
16.图1是本发明的结构示意图；其中，左图为芯片结构示意图：上图灰色结构为圆形栅栏线虫培养室及培养基进出通道、线虫进出通道。下图，黑色圆为气压腔位于线虫培养室上方。右图：圆栅栏是线虫培养室，内有数条线虫成虫，图片20倍放大。
17.图2，微流控芯片上pdms薄膜下压固定线虫示意图(截面图)；上图为芯片结构截面图，下图为pdms薄膜下压固定线虫示意图。
18.图3，使用本技术方法进行线虫肠细胞钙离子动态变化的成像检测分析实验。左图为肠细胞钙离子荧光探针标记的荧光图，右图为检测到的左图方框区域荧光亮度变化趋势，即为钙离子浓度变化。
具体实施方式
19.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例
21.一种可用于线虫培养及即时固定的微流控芯片装置，包括玻璃基片，所述的玻璃基片上设有线虫培养室，所述的线虫培养室为栅栏结构围成的圆形空间，圆形栅栏的外侧分别设有液态培养基(cemm)进样出样的通道和线虫进样与出样的通道，所述的线虫培养室
的上方设有一圆形气腔室，培养室与圆形气腔室之间为一层pdms薄膜，所述的圆形气腔室内施加气压迫使pdms薄膜下压，推挤线虫，将线虫挤向栅栏，将细长的虫体平行于栅栏压紧，实现对线虫的固定，如图2的下图所示。
22.圈养是饲养动物常用的方式。微流控芯片技术的出现可实现微尺度生物线虫的圈养。如图1所示，线虫被圈养在一个直径为8毫米，高为100微米的圆形栅栏内，采用长方体的柱子围成圆形栅栏，圆形栅栏的间缝隙宽度为20微米。
23.液态培养基(cemm)及水可以自由通过圆形栅栏，但线虫不能穿过圆形栅栏，被约束在圆形栅栏内饲养。
24.如图1所示，圆形栅栏的外侧设有液态培养基(cemm)进样出样的通道和线虫进样与出样的通道。新鲜的液态培养基(cemm)可以从圆形栅栏的一端培养基进样通道通过圆形栅栏进入线虫培养室中，从另一端流出，液态培养基(cemm)的进样速度为50微升每分钟。
25.所述的圆形栅栏上方为一层pdms薄膜，厚度为100微米。pdms薄膜的上方为一圆形气腔室，圆形气腔室与圆形栅栏结构中心同轴，上下层结构。圆形气腔室的面积大于圆形栅栏结构的面积。
26.所述的圆形气腔室内施加气压下压pdms薄膜的具体方式如下：圆形气腔室内先充满水，pdms薄膜允许气体分子通过，水分子无法通过，将圆形气腔室充满水后，调控压力实现对pdms薄膜的压紧。压紧过程需缓慢进行，将线虫推到边缘后可进一步实施压紧，完成线虫的固定。
27.线虫压紧固定好后，可以进行光学成像分析；分析结束后，撤去气压，即可恢复线虫培养腔室，线虫可以继续活动。
28.所用的线虫为液态培养基(cemm)驯化后的线虫，培养温度为21℃，所使用cemm培养基含op50型大肠杆菌(109个每毫升)。
29.本发明的装置结构原理简单，操作方便，可以实现线虫培养中的即时无伤害固定，最大程度降低固定操作对其自然生理状态的影响。使用圆形栅栏，方便线虫培养，线虫进出栅栏可以实现零丢失，进样及回收率为100％。
30.本发明可以实现线虫肠细胞钙离子动态变化的成像检测分析，对肠细胞带有钙离子荧光探针的线虫进行芯片上培养，固定后可以实时观察肠细胞钙离子变化水平，如图3所示。