海马提取物的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于药物研发技术领域，涉及一种海马提取物的制备方法及其应用。


背景技术：

2.衰老指机体对环境的生理和心理适应能力进行性降低、逐渐趋向死亡的现象，属于一种无法避免的生理现象，衰老型疾病多存在潜伏期长、病程长等病理特征，多属于慢性疾病的范畴。衰老可分为两类：生理性衰老和病理性衰老，不论是生理性衰老亦或是病理性衰老，最根本的便是机体功能衰退，免疫力低下，也就面临着无法抵御疾病的局面。同时有许多疾病多发于老年人，如阿尔兹海默症等属于老年中枢神经系统的退行性疾病。目前，随着全球老龄化的增加，发病率也在逐年增加。基于我国的基本国情而言，高昂的医护费用与不显著的治疗效果则不仅仅严重影响着病人与家属的身心健康，也对其家庭产生了巨大的压力。衰老已成为了十分严峻的老年健康问题和严重制约公众生活品质及幸福感提升的社会问题。
3.中药海马hippocampus，是我国常用的名贵动物药材，始载于《本草拾遗》，常用于肾阳不足所致之症，主治肾虚阳痿、遗精遗尿，肾虚作喘，跌扑损伤，痈肿疔疮。近年来研究表明，中药海马水提物中含有丰富的化学成分，如氨基酸、脂肪酸、活性多肽、甾体类和微量元素等多种化学成分，基于丰富的化学成分，中药海马具有广泛的药理作用，主要的药理活性有性激素样表达、抗氧化、抗肿瘤、抗炎消肿及提高免疫力等作用。
4.现阶段市面上大多是以安理申药物用于治疗老年中枢神经系统退行性疾病，但安理申药物用于中度或轻度的老年中枢神经系统退行性疾病治疗。且安理申药物为国外进口药物，价格昂贵，不易取得，因此亟需研究开发出新的治疗老年中枢神经系统退行性疾病的药物。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种海马提取物的制备方法及其应用，本发明通过分析中药海马中的多肽组分，采用抗衰老模型进行验证海马提取物的抗衰老能力，明确海马提取物在治疗老年中枢神经系统退行性疾病药物中有较好的效果，为寻找和发现抗衰老药物的先导化合物和新药研发奠定基础。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
7.一种海马提取物的制备方法，包括如下步骤：
8.步骤一、称量海马粉末于圆底烧瓶中，按照料液比1:3～5加入95％乙醇溶液，加热回流提取2～4次，每次2～4h，过滤并收集药渣；
9.步骤二、将步骤一收集的药渣按照料液比1:3～5入蒸馏水，加热回流提取2～4次，每次2～4h，过滤并收集滤液；
10.步骤三、将步骤二收集的滤液减压浓缩，得到海马提取物浸膏，其可用于制备治疗老年中枢神经系统退行性疾病阿尔茨海默病药物。
11.相比于现有技术，本发明具有如下优点：
12.1、本发明通过药理实验研究，发现了在中药海马提取物组小鼠的脑组织病理切片中，细胞结构完整，着色均匀，细胞排列整齐紧密，且未见明显的空泡区域及细胞核深染现象，发现了中药海马提取物能够对小鼠脑部细胞起到保护作用。
13.2、本发明所提供的海马提取物相较于现阶段用于治疗老年中枢神经系统退行性疾病的安理申而言，作用效果显著且相对安全。
14.3、本发明所提供的海马提取物中氨基酸和活性多肽的含量丰富，且含有多种与解毒作用、代谢、单组织进程、细胞连结细胞外基质、细胞器、催化活性及金属络合行为等抑制细胞凋亡，保护神经细胞的功能相关的蛋白质，具有一定程度的抗衰老活性。
附图说明
15.图1为中药海马提取物的制备流程示意图；
16.图2为病理切片示意图；
17.图3为多肽频率分布示意图；
18.图4为多肽功能分类示意图。
具体实施方式
19.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
20.实施例1：
21.本实施例提供了一种海马提取物的制备方法，所述方法主要选取中药海马药材，通过水提取以得到中药海马的提取物。如图1所示，具体制备步骤如下：
22.取完全干燥的海马药材于低温磨粉机内制为药材粗粉，过2号筛后称重，置于干燥器中保存。称量海马药材粉末480g于圆底烧瓶中，按照料液比1:3加入95％乙醇溶液，加热至100℃回流提取3次，每次3h，过滤并收集药渣。将所收集的药渣中按照料液比1:3加入蒸馏水，加热至100℃回流提取3次，每次3h，过滤并收集滤液，减压浓缩制备浸膏，置于广口瓶中，密封后4℃保存。其中，海马药材购于海南广安堂药店，经鉴定为小海马(海蛆)(hippocampus japonicuskaup)的干燥体。
23.实施例2：
24.目前最常见的致衰老模型是d-半乳糖衰老损伤模型，d-半乳糖衰老模型动物会出现免疫力低下、基因表达和调控功能障碍、细胞繁殖能力下降、细胞退行性病变、记忆巩固与再现障碍、寿命缩短等病理表现，且建模操作简单易行，故本实施例选用d-半乳糖致小鼠衰老来建立病理模型，以此探索海马提取物对d-半乳糖致衰老模型小鼠的药理作用。
25.1、动物分组及饲养条件
26.昆明种雌性小鼠60只(体重18～25g，长沙天勤生物技术有限公司提供，动物合格证号：43006700004586)，饲料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司，产品编码：swc9101)按1天1次，每只小鼠喂5g进行喂养。鼠笼垫料与饮水壶定时换洗，保持清洁，室温控制在25℃。随机选取10只，作为空白对照组，将其余的50只小鼠进行衰老造模。将进行衰
老造模的50只小鼠以每组10只随机均分成5组：模型组、安理申药组及海马提取物组，海马提取物组按高剂量、中剂量、低剂量分为三组。
27.2、模型制备及给药方法
28.采用d-半乳糖致小鼠衰老模型方法：除空白对照组外，其余各组按800mg/kg/d，给予8％d-半乳糖皮下注射，连续7周。
29.小鼠给药方法：空白对照组与模型组灌胃给予生理盐水，安理申组灌胃安理申药物(卫材(中国)药业有限公司，产品批号140324a)，海马提取物组则根据浓度高剂量(12.0g/kg)、中量(6.0g/kg)、低剂量(3.0g/kg)灌胃给与相应浓度的海马提取物水溶液，所有小鼠均正常喂食喂水。海马提取物组的高剂量组、中剂量组、低剂量组及安理申组每只小鼠按体重计算药量分别灌胃相应药物1mg/kg，一日一次灌胃给药，空白对照组及模型对照组均灌服等量的生理盐水，连续给药49天。49天后以上各组动物进行行为学测试。
30.3、行为学检测(morris水迷宫实验)
31.morris水迷宫实验由圆型水池、平台和记录系统组成，水池直径150cm，高50cm，池壁为黑色，随意将其分为一、二、三、四4个象限，实验时保持水温在室温，将平台置于任一象限的中央，保持水面高于平台0.5～1.0cm，摄像头至于水池上方2m处用于采集图像，整个水池及摄像头用黑帘包围。
32.实验时将小鼠从四个不同方向面朝池壁轻轻置于水面，用图像采集系统观测其游泳路径，并分析在每一象限停留时间、逃避潜伏期、游泳路径等参数。每只小鼠先训练五天。第六天进行行为学测试，方法与训练过程相同。
33.4、试剂盒检测
34.完成水迷宫实验后的小鼠，经摘眼球取血，4000rpm/min离心10min，取血清，测小鼠血清中乙酰胆碱酯酶(以下简称ache)和胆碱乙酰转移酶(以下简称chat)含量。眼球取血后，颈椎脱臼处死小鼠，剥离小鼠大脑，用生理盐水洗净组织上的血液、污物及粘液，用4％甲醛溶液固定。
35.5、统计学处理
36.实验数据采用mean
±
sd表示，采用spss13.0统计软件进行多样本均数单因素方差分析。p＜0.05为差异具有统计学意义。
37.6、质谱分析检测方法
38.将海马提取物样品采用纳升流速hplc液相系统ultimate 3000进行分离。缓冲液：a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.08％甲酸/80％乙腈水溶液。色谱柱以94％的a液平衡。样品由自动进样器上样到质谱预柱c18trap column(c18 3m 0.10
×
20mm)，再经分析柱c18 column(c18 1.9m 0.15
×
120mm)分离，流速为600nl/min。海马提取物样品分离后用q-exactive hf质谱仪(thermo finnigan)进行质谱分析。
39.7、结果与讨论
40.(1)海马提取物对d-半乳糖衰老模型小鼠药理作用分析
41.a、病理组织观察
42.将制备好的病理切片置于光镜下观察，结果如图2所示。
43.光镜下可见空白组小鼠脑组织结构紧密，组织间隙无异常，细胞结构完整，细胞核清晰，胞浆着色均匀呈透亮或淡染。d-半乳糖衰老模型组小鼠病理组织与空白组相比较，脑
组织中细胞排列混乱，细胞周围组织疏松、水肿，组织间隙明显增加，出现大量空泡区域，因细胞凋亡后所致，还出现了大量细胞核深染。安理申组小鼠病理组织可见少量细胞空泡，少量细胞核深染，组织结构清晰，组织间隙较空白组差异不明显，着色相较模型组均匀且透亮。海马提取物组小鼠的病理结构观察可见大量细胞排列整齐且紧凑，细胞着色均匀，颜色较周围组织偏深，细胞团外侧排列稍疏松，可见明显组织间隙，但未发现细胞核深染及细胞凋亡后留下的空泡。综上可见，海马提取物对d-半乳糖衰老模型小鼠脑细胞具有明显的保护作用，且作用较安理申更加显著。
44.b、海马提取物对d-半乳糖衰老模型小鼠记忆能力、ache、chat的影响
45.海马提取物对d-半乳糖衰老模型小鼠记忆能力、ache、chat的影响结果如表1所示。
46.表1中药海马对d-半乳糖衰老模型小鼠记忆能力、ache、chat的影响(mean
±
sd，n＝10)
[0047][0048][0049]
(注：*表示与模型组比较:p《0.05；#表示与空白组比较:p《0.05)
[0050]
与空白对照组相比，模型组小鼠水迷宫测试的潜伏期时间明显增加；与模型组比较，安理申组、中药海马提取物组中的高剂量组和中剂量均能降低小鼠水迷宫实验潜伏期，说明中药海马提取物组具有抗老年痴呆作用，而海马提取物组的低剂量组各方面数据不佳，未达到实际的治疗效果。
[0051]
与模型组比较，中药海马提取物组中的高剂量组和中剂量均能降低ache含量，抑制ache活性，同时chat的含量也有小幅度的下降。ache为水解乙酰胆碱(以下简称ach)的必需酶，能使ach水解成胆碱和乙酸。chat功能是将乙酰辅酶a转移到胆碱上，导致神经递质ach的形成。研究表明人体内ach物质含量增多与阿尔兹海默病(以下简称ad)的症状改善显著相关，因此，海马提取物通过降低ache含量来减少ach的水解，使得体内的ach含量上升治
疗ad患者的症状，同时chat含量的小幅度降低也避免了ach的大量增加而导致ach在人体内堆积而产生的一系列副作用，例如m样症状、n样症状及cns症状。海马提取物实现了ache和chat二者相辅相成共同维持脑内ach含量的动态平衡。
[0052]
将模型组与安理申组进行对照可以发现，安理申药物的作用机理为显著降低了ache的含量，抑制了ache的对ach的水解，提高了chat的含量，使得ach的合成量增加。因此，安理申对ad患者的药效作用显著，但极容易造成ach在体内的大量堆积而产生一系列的副作用。而在实际临床试验中，安理申药物也具有腹泻、头痛、恶心、肌肉阵挛、乏力、失眠等副作用。另对海马提取物组进行组内不同浓度间比较可见，高剂量(剂量12g/kg)对于潜伏期、ache含量、chat含量的影响更加显著。
[0053]
(2)海马提取物成分分析
[0054]
对海马提取物进行质谱分析检测，发现其中氨基酸、活性多肽含量丰富，对其氨基酸及多肽分析发现，其中多肽频率分布如图3所示，肽段长度居于6～26肽之间，肽段数多居于0～2500之间，且8～12肽的肽段数均在2000以上。
[0055]
根据功能差异可将海马提取物中的氨基酸及多肽分为三大类，如图4所示，分别为生化反应、细胞结构及分子功能，且可以细分为46种，其中与解毒作用、代谢、单组织进程、细胞连接、细胞外基质、细胞器、催化活性、金属络合行为等抑制细胞凋亡，保护神经细胞的功能相关的蛋白质数量均在100～150之间。
[0056]
8、结论
[0057]
本发明通过药理实验研究，了解了中药海马对d-半乳糖致衰老模型小鼠的药理作用。
[0058]
(1)中药海马提取物能够对小鼠脑部细胞起到保护作用，且相较于现阶段用于治疗老年中枢神经系统退行性疾病的安理申而言，作用效果显著且相对安全。
[0059]
(2)海马提取物成分中含有丰富的氨基酸和活性多肽，使得海马提取物拥有了抑制细胞凋亡，保护神经细胞的功能，且具有一定程度的抗衰老活性。