红火炬郁金醇提取物在制备抗紫外光老化药物中的应用的制作方法

1.本发明属于植物醇提取物领域，具体涉及红火炬郁金醇提取物在制备抗紫外光老化药物中的应用。


背景技术：

2.皮肤是人体最大的器官，并作为人体的第一道防线，保护着人体免受外界理化因素及微生物的侵袭。但与此同时，它也是最容易受外界环境影响的器官，其中紫外线、寒冷、风吹及化学暴露均可导致皮肤受损及老化，而紫外线是诱发人类皮肤光老化所有因素中最重要的一个。
3.紫外线照射下，特别是中波紫外线(uvb)可引起皮肤的一系列损伤，诱发皮肤外观出现红斑、皮肤粗糙、水疱、炎症、异常增生、皱纹加深并伴有色素沉着、皮肤基质构成的改变如表皮角化不良伴异常增生、真皮变薄、胶原成分的减少、异常弹性纤维沉积等光老化一系列急、慢性反应，并可导致各类细胞因子的产生与分泌，局部及系统免疫抑制，细胞dna损伤及突变频率增加，细胞周期阻滞、凋亡和坏死，最终诱发皮肤癌。其主要机制表现为：
①
dna损伤：dna链断裂、交链、dna-蛋白质交链，使皮肤产生过多的活性氧自由基(ros),ros抑制了皮肤自身抗氧化的防御功能，打破了氧化与抗氧化间的平衡，形成氧化应激反应。正常情况下表皮角质形成细胞产生的抗ros酶，如超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽过氧化酶(cpx)等能够对抗一定的ros,但不能对抗过多的ros、阻止皮肤癌的发生。
②
引起皮肤的炎症及免疫抑制：炎症能诱导生长因子、前炎症细胞因子的释放，炎性细胞的浸润和ros的产生，能诱导皮肤中的环氧化酶(cox)水平升高，结果导致前列腺素水平升高，使炎性细胞进一步浸润、激活，产生更多的氧化产物。
4.红火炬(curcumapetiolata roxb.)分布区域广泛，具有抗炎、镇痛、抑菌、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗氧化等作用，作为药食已有上千年的历史。


技术实现要素：

5.本发明在实验中制备了红火炬郁金醇提取物，并建立了由uv-b辐射诱导的皮肤光老化动物模型，以评估其抗光老化性能。将稀释的醇提取物于紫外照射前30min涂抹于小鼠背部无毛皮肤，用功率密度100mj/cm2中波段紫外线uvb照射无毛鼠背部皮肤，周期照射结束后取皮肤组织，采用光学显微镜观察老鼠皮肤组织病理的变化情况，免疫组化及elisa检测相关蛋白如丝聚蛋白filaggrin(flg)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,tnf-α)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,cox-2)、白细胞介素-6(interleukin-6)和白细胞介素-1β(interleukin-1β)的含量变化。
6.本发明的第一个目的是提供红火炬郁金醇提取物在制备抗紫外光老化药物中的应用。
7.优选地，所述的红火炬郁金醇提取物为5％质量分数的红火炬郁金醇提取物；更优选地，所述的醇为乙醇。
8.优选地，所述红火炬郁金醇提取物的制备步骤如下：将干燥的红火炬郁金种球材料打粉后过筛后称取粉末置于烧瓶中，加入乙醇充分浸润后，在水浴锅加热回流提取，趁热过滤分离滤液和滤渣，回收溶剂，取上清液合并滤液，合并滤液于旋转蒸发仪中浓缩至无醇味，水浴蒸干，冷冻干燥以获得萃取物即得红火炬郁金醇提取物。
9.更优选地，所述的加入乙醇是按物料比为1：10(g/ml)加入无水乙醇。
10.更优选地，所述的在水浴锅加热回流提取是在水浴锅以60℃恒温加热回流提取3次，每次3h。
11.本发明的第二个目的是提供红火炬郁金醇提取物在制备减少促炎细胞因子产生的药物中的应用。
12.优选地，所述的红火炬郁金醇提取物为5％质量分数的红火炬郁金醇提取物；更优选地，所述的醇为乙醇。
13.优选地，所述的减少促炎细胞因子产生是减少il-6、tnf-α、cox-2和il-1β中的一种或多种促炎细胞因子产生。
14.本发明的第三个目的是提供红火炬郁金醇提取物在制备促进flg表达的药物中的应用。
15.优选地，所述的红火炬郁金醇提取物为5％质量分数的红火炬郁金醇提取物；更优选地，所述的醇为乙醇。
16.与现有技术相比，本发明有益效果如下：
17.1.本发明证实红火炬郁金醇提取物能使uvb照射后小鼠受试皮肤中的cox-2、il-6、il-1β和tnf-α表达含量明显下调；
18.2.本发明证实红火炬郁金醇提取物能促进uvb照射后小鼠受试皮肤中的flg表达；
19.3.相比uvb照射组，红火炬郁金醇提取物给药组皮肤粗糙和表皮角化不良伴异常增生等表观症状得到明显改善。
附图说明
20.图1为小鼠给药周期中的第1天、第7天和第14天背部皮肤宏观表征图。
21.图2为小鼠受试皮肤he染色结果(a)和小鼠受试皮肤的表皮层厚度(b)。
22.图3为小鼠受试皮肤cox-2检测结果(a)和小鼠受试皮肤中的cox-2表达含量(b)。
23.图4为小鼠受试皮肤il-6检测结果(a)和小鼠受试皮肤中的il-6表达含量(b)。
24.图5为elisa分别检测小鼠受试皮肤flg(a)、il-6(b)、tnf-α(c)和il-1β(d)的含量。
具体实施方式
25.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
26.下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段；实验材料和试剂如无特殊说明，均可从商业渠道中获得。
27.实施例1小鼠受试皮肤宏观表征
28.(一)测试对象
29.本次测试所用动物为实验spf级昆明km小鼠(5周龄)，雌性，体重34-38g。
30.(二)试剂耗材
31.称量纸、药勺、100ml烧杯、玻璃棒、移液枪头(1ml、100μl、10μl)、动物剃毛器、脱毛膏、棉签、耳标、耳标钳、离心管(无热源、无内毒素含50ml、15ml)、试管架、1.5ml ep管(无热源、无内毒素)、ep管架、去离子水、生理盐水、纱布、医用胶布、4％多聚甲醛、无水乙醇、二甲苯、中性树胶、花生植物油(基质油)、红火炬郁金乙醇提取物、he染色试剂盒(g1005，武汉赛维尔生物科技有限公司)、小鼠白细胞介素1β(il-1β)elisa试剂盒、小鼠白细胞介素6(il-6)elisa试剂盒、小鼠丝聚蛋白filaggrin(flg)elisa试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,tnf-α)试剂盒(购于江苏酶标生物科技有限公司)、anti-cox-2rabbit pab(gb11077，武汉赛维尔生物科技有限公司)、anti-il-6rabbit pab(gb11117，武汉赛维尔生物科技有限公司)、hrp标记的山羊抗兔igg(gb23303，武汉赛维尔生物科技有限公司)等。测试样品信息如表1所示。
32.表1
[0033][0034]
(三)主要设备
[0035]
电子分析天平、紫外可见分光光度计、高速离心机、电热恒温水浴锅、漩涡震荡仪、恒温磁力搅拌器、倒置显微镜、酶标仪、恒温箱、分析天平、真空干燥器、脱水机、包埋机、病理切片机、冻台、组织摊片机、烘箱、微波炉、烧瓶，冷凝管，水浴锅，纱布，蓝口瓶铁架台等固定装置等。
[0036]
(四)5％质量分数的红火炬郁金乙醇提取物的制备
[0037]
将干燥的红火炬郁金种球材料打粉后过80目筛后称取50g粉末置于1l烧瓶中，并加入物料比约1：10(g/ml)的无水乙醇充分浸润30分钟后，在水浴锅中以60℃恒温加热回流提取3次，每次3h，趁热过滤分离滤液和滤渣，回收溶剂，取上清液合并滤液，合并滤液于旋转蒸发仪中浓缩至无醇味，水浴蒸干，冷冻干燥以获得萃取物即得红火炬郁金醇提取物，基质油溶解至5％浓度(质量分数)。
[0038]
(五)动物实验
[0039]
适应性喂养：从广东省实验动物中心购买实验spf级km小鼠(5周龄)，雌性，体重34-38g。使小鼠在22℃下以12小时的光照/黑暗循环适应性饲养1周，随机分为空白对照组、模型组、模型-基质组、红火炬郁金醇提取物组，每组6只，各组处理方式如表2所示。
[0040]
表2
[0041]
[0042]
紫外光老化模型：
[0043]
实验前1天用脱毛膏去除小鼠背部皮肤的毛备用。实验分为为期三周的uvb光老化造模阶段及给药阶段。每天给药一次，模型-基质组在背部去毛部位涂抹等体积的基质花生油(200μl/只)；红火炬郁金醇提取物组小鼠在背部去毛部位涂抹5％质量分数的红火炬郁金乙醇提取物(200μl/只)；以上组别均一天给药一次。除空白组以外，其他组别小鼠每三天给予一次uvb照射，是在小鼠给药结束30min后，给予uvb照射2min(100mj/cm2)，为期21天。之后以颈椎脱臼法处死小鼠，取背部皮肤组织于4％多聚甲醛中固定及冻存，进行后续指标测定。
[0044]
在所有组别小鼠给药周期中第1天、第7天和第14天分别拍照记录小鼠背部皮肤表观变化情况。结果如图1所示，与未处理的空白组相比，uvb照射后会引发小鼠皮肤出现红斑、皮肤粗糙、水疱、异常增生、皱纹加深并伴有色素沉着等表观特征。与模型组和模型-基质组相比，红火炬郁金醇提取物组小鼠皮肤的表观症状明显得到改善。
[0045]
实施例2 he染色石蜡切片
[0046]
皮肤粗糙和表皮角化不良伴异常增生是uvb引起的皮肤光老化损伤的特征之一。本实施例用he染色实验检测各组小鼠皮肤表皮角化不良伴异常增生情况(样品为实施例1的4％多聚甲醛固定及冻存的背部皮肤组织)，实验步骤如下：
[0047]
1.取材：受试皮肤组织用4％多聚甲醛固定液固定24h之后，将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
[0048]
2.脱水浸蜡：将脱水盒放进脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h，85％酒精2h，90％酒精2h，95％酒精1h，无水乙醇i 30min，无水乙醇ii 30min，醇苯5-10min，二甲苯i 5-10min，二甲苯ii 5-10min，65
°
融化石蜡i1h，65
°
融化石蜡ii 1h，65
°
融化石蜡iii 1h。
[0049]
3.包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20
°
冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
[0050]
4.切片：将修整好的蜡块，放入-20℃冻台冷却，再将冷却的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
[0051]
5.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ20min-二甲苯ⅱ20min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。
[0052]
6.苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。
[0053]
7.伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。
[0054]
8.脱水封片：切片依次放入无水乙醇i5min-无水乙醇ii 5min-无水乙醇ⅲ5min-二甲ⅰ5min-二甲苯ⅱ5min透明，中性树胶封片。
[0055]
9.显微镜镜检，图像采集分析，并用graphpadprism收集数据并作图。
[0056]
实验结果：
[0057]
由测试皮肤的组织学分析如图2所示，与未处理的空白组相比，uvb照射后会引发小鼠皮肤出现表皮角化不良伴异常增生。模型组小鼠受试皮肤的表皮层厚度显著高于空白组(p《0.01)。相比模型组，红火炬郁金醇提取物组的小鼠受试皮肤的表皮层厚度明显降低，说明红火炬郁金醇提取物对皮肤光老化损伤中具有一定的抑制表皮增生的作用。
[0058]
实施例3小鼠受试皮肤免疫组化实验
[0059]
皮肤出现炎症也是uvb引起的皮肤光老化损伤的特征之一。炎症能诱导生长因子、前炎症细胞因子的释放，炎性细胞的浸润和ros的产生，能诱导皮肤中的环氧化酶(cox)水平升高，结果导致前列腺素水平升高，uvb照射后能上调了促炎介质(cox-2和ils)的表达水平，使炎性细胞进一步浸润、激活，产生更多的氧化产物，最终导致皮肤损伤。本实施例进行小鼠受试皮肤免疫组化实验以检测各组别的皮肤炎症情况，具体实验步骤如下：
[0060]
取实施例1处理好的小鼠进行实验，每组6只均取皮肤进行检测，每只小鼠取材2.0cm
×
0.8cm长条状背部受试皮肤，置生理盐水中充分漂洗残余血液，铺展于滤纸上，室温晾干，用锡箔纸上包好；免疫组化脱蜡前的所有步骤同he染色(同实施例2步骤1-4)，其余实验步骤如下所示。
[0061]
1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ15min-二甲苯ⅱ15min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。
[0062]
2.抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(ph6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min至沸，停火8min，再转中低火7min，次过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
[0063]
3.阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
[0064]
4.血清封闭：在组化圈内滴加3％bsa均匀覆盖组织，室温封闭30min。(一抗是羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用bsa封闭)
[0065]
5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加pbs按一定比例配好的一抗(anti-cox-2rabbit pab和anti-il-6rabbit pab)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
[0066]
6.加二抗：玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(hrp标记的山羊抗兔igg)覆盖组织，避光室温孵育50min。
[0067]
7.dab显色：玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
[0068]
8.复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
[0069]
9.脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min-85％酒精5min
‑‑
无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-二甲苯ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
[0070]
10.显微镜镜检，图像采集分析。使用image-pro plus软件测量免疫组化染色后的小鼠皮肤cox-2、il-6的iod值，并用graphpadprism收集数据并作图。
[0071]
实验结果：
[0072]
如图3所示，与未处理的空白组相比，模型组小鼠受试皮肤中的cox-2表达含量显著高于空白组(p《0.01)，而模型-基质组并不能改善炎症因子表达上调的情况。相比模型组，红火炬郁金醇提取物组的小鼠受试皮肤中的cox-2表达含量明显下调。
[0073]
如图4所示，与未处理的空白组相比，模型组小鼠受试皮肤中的il-6表达含量显著高于空白组(p《0.05)，而基质花生油组并不能改善il-6表达上调的情况。相比模型组，红火炬郁金醇提取物组的小鼠受试皮肤中的il-6表达含量有所下调。
[0074]
实施例4 elisa检测小鼠受试皮肤il-1β、il-6、tnf-α和flg的含量
[0075]
保持皮肤保湿的关键因素是改善皮肤屏障功能。皮肤屏障功能障碍可能会受到一些因素的影响，如外皮蛋白(involucrin)和丝聚蛋白(filaggrin,flg)。uvb辐射可导致皮肤屏障功能障碍，并通过改变involucrin和filaggrin的表达而导致水分流失，长期暴露于uvb会导致真皮结构和弹性的改变。测定促炎细胞因子il-6、il-1β和tnf-α的产生，进一步评价提取物抗uvb诱导的炎症作用。具体实验步骤如下：
[0076]
取实施例1处理好的小鼠进行实验，分别将各组的6只小鼠经解剖采集的背部皮肤组织，制备组织匀浆，按小鼠白细胞介素1β(il-1β)elisa试剂盒、小鼠白细胞介素6(il-6)elisa试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,tnf-α)试剂盒和小鼠丝聚蛋白filaggrin(flg)elisa试剂盒说明书上的方法检测il-1β、il-6、tnf-α和flg的含量。具体实验步骤如下：
[0077]
(1)标准样品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50ul。
[0078]
(2)加样：分别设置空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40ul，然后再加待测样品10ul(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不接触及孔壁，轻轻晃动混匀，并设置3个复孔。
[0079]
(3)加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
[0080]
(4)温育：将微孔板用贴膜封板后，用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
[0081]
(5)配液：将20倍浓度缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
[0082]
(6)洗涤：撕掉封板膜，弃去微孔板中的液体，甩干后每孔加入200μl洗涤液，静置半分钟后倒掉，重复5次，甩干。
[0083]
(7)显色：先往每孔加入50μl显色剂a，再加入50μl显色剂b，轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。
[0084]
(8)终止：往每孔加入50μl终止液，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
[0085]
(9)测量：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
[0086]
(10)结果分析：复孔的值通常在20％的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值；每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值(如果没有做校正孔，则不需要减去)；以标准品浓度为横坐标，以a450值或以结合率(每个标准品对应的od值除以零浓度对应的od值)为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。
[0087]
实验结果：
[0088]
如图5a所示，与未处理的空白组相比，模型组小鼠受试皮肤中的flg表达含量显著低于空白组(p《0.05)，说明uvb辐射显著下调了与经皮失水相关蛋白的表达；与模型组的小鼠皮肤相比，红火炬郁金醇提取物组的小鼠受试皮肤中的flg表达含量明显上调。
[0089]
如图5b所示，与空白组相比，模型组小鼠受试皮肤中的il-6表达含量显著上调(p《0.01)，相比模型组，红火炬郁金醇提取物组的小鼠受试皮肤中的il-6表达含量有所下调，而模型-基质组并不能降低il-6表达上调的情况。
[0090]
如图5c所示，与空白组相比，模型组小鼠受试皮肤中的tnf-α表达含量明显增高，相比模型组组，红火炬郁金醇提取物组的小鼠受试皮肤中的tnf-α表达含量明显降低，几乎与空白组表达水平相近。
[0091]
如图5d所示，与空白组相比，模型组小鼠受试皮肤中的il-1β表达含量明显增高，相比模型组，红火炬郁金醇提取物组的小鼠受试皮肤中的il-1β表达含量有所降低。
[0092]
这些结果表明，施予红火炬郁金醇提取物可以有效抑制uvb诱导的皮肤炎症反应。