一株无色素黄单胞菌及其在发酵生产无色素黄原胶中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种微生物多糖黄原胶新型生产菌株，尤其涉及一株无色素黄单胞杆菌及其在发酵生产无色素黄原胶中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.黄原胶(xanthan gum，xg)又称黄胶、黄胞胶或汉生胶，是一种天然多糖和重要的生物聚合物，由黄单胞杆菌(xanthomonascampestris)以淀粉等为主要原料，经好氧发酵而来。黄原胶具有安全、无毒，低浓度高粘性，良好的触变性、增稠性、乳化稳定性，以及对酸、碱、盐的高度稳定性等优点，是目前国际上公认的性能最优越的生物胶，已在食品、石油、医药、日化及农业开发等领域得到广泛应用。
4.近年来，随着经济快速发展，对黄原胶工业发酵生产能力与产品品质的要求逐年提高。目前的专利技术主要通过优化发酵条件来提高发酵生产黄原胶能力，降低发酵成本，对提高黄原胶产量帮助不大。黄单胞杆菌还产生黄色的菌黄素，是黄原胶生产过程的杂质。目前工业生产上为了除去这些菌黄素，专门有一道工序是“脱黄”，生产成本偏高。
5.现有技术专利cn110016480a公开了一种菌黄素合成相关基因xc_4092，通过将野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的野生菌株xcc8004基因组中的该基因失活获得生产无色黄原胶的工程菌。但该工程菌是基于一个低产黄原胶菌株，黄原黄胶发酵效价低，生产成本高。专利cn110777105a公开了经基因工程方法敲除群体感应退出关键基因rpfb和菌黄素关键合成基因xank构建得到高产无菌黄素白原胶的菌株，但该工程菌株构建与产业化应用过程复杂，成本较高。


技术实现要素：

6.针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一株不产菌黄素的适用于工业化黄原胶高效发酵生产的非基因工程菌种——无菌黄素黄单胞杆菌及其在发酵生产无色素黄原胶中的应用。
7.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供了一株无色素黄单胞菌，所述无色素黄单胞菌为黄单胞杆菌xanthomonas sp.110，其保藏编号为cctcc no.m20211419。
9.本发明的第二个方面，提供了上述的无色素黄单胞菌在生产无色素黄原胶中的应用。
10.本发明的第三个方面，提供了一种无色素黄单胞菌生产无色素黄原胶的方法，包括：
11.将上述的无色素黄单胞菌依次进行活化培养，液体种子培养，黄原胶发酵生产，即
得。
12.本发明的第四个方面，提供了上述的方法制备的无色素黄原胶。
13.本发明的有益效果在于：
14.(1)本发明公开了一株能够发酵生产无色素黄原胶的黄单胞杆菌，即黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110 cctcc no.m20211419。
15.(2)采用本发明所述的黄单胞杆菌及其应用方法可高效发酵生产无色素黄原胶，显著提高黄原胶产品的品质，增强国内黄原胶产品的市场竞争力。
16.(3)与当前国内工业生产菌种比较，本发明公开菌株除能够以淀粉、豆粉等为原料高效发酵产黄原胶外，还能够以葡萄糖、酵母粉等全可溶性物质为原料高效发酵生产黄原胶，丰富了黄原胶生产的原料并提供产品品质。
17.(4)本发明公开菌株为工业生产菌株诱变获得的稳定突变菌株，可直接用于工业化生产，不存在稳定性与安全性问题。
18.(5)本技术的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
19.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
20.图1：本发明所述菌株黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110与出发菌株发酵生产黄原胶发酵液比较图；
21.图2：本发明所述菌株黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110与出发菌株所产黄原胶产品比较图。
具体实施方式
22.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
23.本发明所述适用于工业生产无色素黄原胶的黄单胞杆菌，该菌株名为黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110，菌株已于2021年11月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(china center for type culture collection，简称cctcc，地址：中国.武汉.武汉大学)，其保藏编号为cctcc no.m20211419。
24.上述黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110是发明人在筛选黄原胶高产菌株过程中，由黄原胶工业生产菌株黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)101经多轮等离子体与微波复合诱变筛选获得，其优点如下：
25.所述菌株在lb培养基上生产快，菌落白色，稍粘稠，革兰氏染色菌体形态与出发菌株无显著差异。
26.对本发明所述黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110菌株进行全基因组测序，通过序列比对，该菌株与菌黄素合成相关的基因xanm和xank发生了序列点突变，具体核苷酸序列及突变点如seq id no.1和2所示。
27.本发明所述黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110菌株，与出发菌株黄单胞杆菌
(xanthomonas sp.)101进行摇瓶试验发酵生产黄原胶的比较。
28.(1)种子液制备：将斜面培养好的两株菌挑取两环分别接种于种子培养基里，28～34℃培养18～26h，获得用于黄原胶发酵生产的种子液；
29.(2)黄原胶发酵生产：将培养好的种子液按10％(v/v)分别接种于发酵培养基里，28～34℃发酵50～72h，不同的黄原胶发酵液。
30.其中，所述发酵液分别有如下质量分数的组分组成：(单位：g/l)
31.发酵培养基(一)：玉米淀粉30～60、豆粉3～6、碳酸钙00～0.8、硫酸镁0.5～1.0，其他为蒸馏水，ph7.0～7.2；
32.发酵培养基(二)：葡萄糖40～60、酵母粉2～5、碳酸钙0～0.8、硫酸镁0.5～1.0，其他为蒸馏水，ph7.0～7.2。
33.(3)发酵结果如下表：
[0034][0035][0036]
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
[0037]
实施例1：黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110的选育
[0038]
以黄原胶工业生产菌株黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)101为出发菌株，连续两轮室温等离子体(artp)与微波复合诱变，无菌操作将诱变菌体涂布于lb平板培养基上，28～34℃静置培养2～3天，挑取所有白色单菌落接种于lb斜面培养基上，28～34℃静置培养1～2天，待菌株生长完成。
[0039]
将所有生长好的白色单菌落接种于lb液体培养，28～34℃、220～280r/min摇瓶培养24h，按接种量10％(v/v)接种于发酵培养基中，28～34℃、240～300r/min摇瓶发酵60～72h。
[0040]
所述发酵液分别有如下质量分数的组分组成：(单位：g/l)
[0041]
发酵培养基(单位：g/l)：玉米淀粉40～60、豆粉3～6、碳酸钙0.2～0.8、硫酸镁0.5～1.0，其他为蒸馏水，ph7.0～7.2。
[0042]
选取发酵液粘度高、多糖产率高的菌株进行重复筛选，最终选育得到一株遗传性
质稳定、不产菌黄素、黄原胶多糖产率高的黄单胞杆菌，该菌株命名为黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110菌株。
[0043]
上述菌株黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110，已于2021年11月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(china center for type culture collection，简称cctcc，地址：中国.武汉.武汉大学)，其保藏编号为cctcc no.m20211419。实施例2：黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110菌株与出发菌株基因组比较分析
[0044]
将实施例1选育得到的黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110菌株即cctcc no.m20211419菌株与出发菌株黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)101委托华大基因进行菌株全基因组测序，获得菌株基因组框图。
[0045]
实验方法：
[0046]
(1)挑取斜面培养好的菌株接种于液体lb培养基里，28～34℃、220～280r/min摇瓶培养16～18h，收集菌液。
[0047]
(2)将收集菌液标记后，干冰保藏送测序公司测序全基因组。
[0048]
通过使用美国生物工程信息中心(national center for biotechnology information,ncbi)blast程序进行两菌株全基因组序列比对，并结合相关黄单胞杆菌菌黄素合成相关基因进行分析，得本发明菌株黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110与出发菌株比较，其菌黄素合成相关基因xanm和xank发生了点突变，具体核苷酸序列及突变点如seq id no.1和2所示，已报到的其他菌黄素合成相关基因为发现序列改变，说明本发明菌株是通过上述两基因的突变导致不能合成菌黄素。
[0049]
xanm(seq id no.1)
[0050]
atggccccggtcgccatcaccgccttcaccgccaccaccgcgctcggcgccggattggacgcccaggccagcgcgctgcgcgagcgccgcagcggcatgcgccgcaacgacttcggcccacagccgctggaatgctggatcggccgggttgccggcgtagaagacgtggtgctaccagacgcgctgcaaggctgggactgccgcaacaaccagctggcctggctggccctacaacaggacggcatggccgccgccgtgcaggccgccgcgcagcgctatggcgccgagcgcgtggcggtggtgatgggcacgtccacctccagcgtgggcgccagcgaagaggcctacacgcgcctggtcgaagacgcccacggcctgcgcttcccgggcgacctgcagc
[0051]
a-g(asp-gly)
[0052]
gcccgatcgtgcataccccgcattcgctgggcgatttcgtgcagcacgccaccggcctgcgcgggccggcgatcaccgtggccacggcgtgttcgtccagcgccaaggtgttcgcccaggccgcgcggttgatggcggccggcgtggtcgacgcggccttggtcggcggcgtggataccttgtgcggcagcgtgttgttcggcttcaactcgttgcaggtggtggcaccgcagctgtgccagccgttcgacgcacgccgggtcggcctgagcctgggcgaggccggcggctttgccctgctcgaacgccccgccgccgcgccggacgccgcgcagtggctgtacggctatggcgaatccagcgatgcccaccacatgtccgccccgcacccgcagggcctgggcgcgcagttggcgatgcgtggcgcgctggacaccgccgggctggatgccgcggcggtgggctatctcaacctgcacggcaccgccacgccggccaacgacagcgtcgaggcggccgcggtggcggcgatcttccccgacaccttgcatgccagttccaccaaggcctggatgggccacacgctgggtgcggccggcattgtggagtcggtgattgcgctgctcgcgctgcgcgacggcctgctgccgggcacgctcaacagtgcggtgcccgaccccgcctgcggcccgcagatccgcttcgataacgcccattcccggattcagtacgcaatgaacaactcctttggcttcggcggcaacaactgctcgctgctgttcgggctggcacgctga
[0053]
a-t(gln-leu)
[0054]
xank(seq id no.2)
[0055]
atgagccgcatcccgctgagccgcgacgacaccgcgatcctggtgccggccttgaacgagtcgctgcgcatccgcgaggtggtcaacgacgcgctgacctattgctcgcaagtgatcgtgatcgacgacggctccgatggcggcaccgcc
[0056]
a-g(asp-gly)
[0057]
gattgcatcgccgatttgccggtcaccctgatccgccacccgcagcgcatgggcaagggtgccgcactgcgcagcggctttgccgaagcccagcggcagggcatgcgcgcggtgatgaccatggacggcgatggccagcacaaggccgccgatttcccgcgcctgctggctgcggcgaaccgccacccgggcgcggtgatcgtcggcgcgcgcatgcgcaagcgggccacccagcccaccatccgccgcatcggcaacgacttcggcgactggggcatcgcctgggcctgcggcttccggctggtcgacagccaaagcggccagcgcctgtatccggcctcggtgttcaccctgcccaacgtacccggcgaaggcttcgtgttcgaagcacaactgctgatctccgccgcgcgccaggccggtgcacgcgtggtcgctgtgccgatcgaaacccggtacgcgggcacctcgcccggcaccttccgcaagagccatttccggctggttcgcgatctgtggaacatcacctcgcacgtggtcaagcaggtgtgggcttacggccacatctggcgcgaataccgccgcgtgcgcgcacacccggtgctgattgacgacccggacggcgaatttgctactgtgcccgcggtcaccaagagcaatccatccacatga
[0058]
实施例3：黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110发酵产黄原胶
[0059]
以实施例1选育得到的黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110菌株即cctcc no.m20211419菌株作为实验菌株；
[0060]
(1)挑取斜面培养好的菌株两环接种于液体种子培养基里，32℃、240r/min摇瓶培养28h，获得成熟发酵种子。
[0061]
(2)将培养成熟的种子按10％(v/v)转接入摇瓶发酵培养基里，270r/min摇床发酵65h。
[0062]
(3)本实施例中黄原胶的产率为41.1g/l，发酵液粘度7106mpa.s，发酵液为白色(见图1中a)、提取黄原胶产品为白色(见图2中a)、多糖黄原胶分子量为1.78
×
107da，1％(w/v)产品粘度为1308mpa.s。
[0063]
上述种子培养基组成为(单位：g/l)：葡萄糖10.0，蛋白胨5.0，酵母粉3.5，氯化钠2.0，其他为蒸馏水，ph 7.0～7.2。
[0064]
上述发酵培养基组成为(单位：g/l)：玉米淀粉50、豆粉5、碳酸钙0.5、硫酸镁0.5，其他为蒸馏水，ph7.0～7.2。
[0065]
实施例4：黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110发酵产黄原胶
[0066]
以实施例1选育得到的黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)110菌株即cctcc no.m20211419菌株作为实验菌株；(1)挑取斜面培养好的菌株两环接种于液体种子培养基里，28℃、220r/min摇瓶培养24h，获得成熟发酵种子。
[0067]
(2)将培养成熟的种子按10％(v/v)转接入摇瓶发酵培养基里，260r/min摇床发酵60h。
[0068]
(3)本实施例中黄原胶的产率为39.1g/l，发酵液粘度6896mpa.s，发酵液为白色、提取黄原胶产品为白色、多糖黄原胶分子量为1.69
×
107da，1％(w/v)产品粘度为1260mpa.s。
[0069]
上述种子培养基组成为(单位：g/l)：葡萄糖10.0，蛋白胨5.0，酵母粉3.5，氯化钠2.0，其他为蒸馏水，ph 7.0～7.2。
[0070]
上述发酵培养基组成为(单位：g/l)：葡萄糖55、酵母粉15、碳酸钙0.2、硫酸镁0.6，其他为蒸馏水，ph7.0～7.2。
[0071]
对比例1：黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)101发酵产黄原胶
[0072]
以实施例1筛选的出发菌株黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)101为实验菌株，
[0073]
(1)挑取斜面培养好的菌株两环接种于液体种子培养基里，32℃、240r/min摇瓶培养28h，获得成熟发酵种子。
[0074]
(2)将培养成熟的种子按10％(v/v)转接入摇瓶发酵培养基里，270r/min摇床发酵65h。
[0075]
(3)本实施例中黄原胶的产率为41.8g/l，发酵液粘度7116mpa.s，发酵液为白色(附图1-b)、提取黄原胶产品为白色(附图2-b)、多糖黄原胶分子量为1.81
×
107da，1％(w/v)产品粘度为1318mpa.s。
[0076]
上述种子培养基组成为(单位：g/l)：葡萄糖10.0，蛋白胨5.0，酵母粉3.5，氯化钠2.0，其他为蒸馏水，ph 7.0～7.2。
[0077]
上述发酵培养基组成为(单位：g/l)：玉米淀粉50、豆粉5、碳酸钙0.5、硫酸镁0.5，其他为蒸馏水，ph7.0～7.2。
[0078]
对比例2：黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)101发酵产黄原胶
[0079]
以实施例1筛选的出发菌株黄单胞杆菌(xanthomonas sp.)101为实验菌株，
[0080]
(1)挑取斜面培养好的菌株两环接种于液体种子培养基里，28℃、220r/min摇瓶培养24h，获得成熟发酵种子。
[0081]
(2)将培养成熟的种子按10％(v/v)转接入摇瓶发酵培养基里，260r/min摇床发酵60h。
[0082]
(3)本实施例中黄原胶的产率为18.8g/l，发酵液粘度2216mpa.s，发酵液为白色、提取黄原胶产品为白色、多糖黄原胶分子量为0.571
×
107da，1％(w/v)产品粘度为485mpa.s。
[0083]
上述种子培养基组成为(单位：g/l)：葡萄糖10.0，蛋白胨5.0，酵母粉3.5，氯化钠2.0，其他为蒸馏水，ph 7.0～7.2。
[0084]
上述发酵培养基组成为(单位：g/l)：葡萄糖55、酵母粉15、碳酸钙0.2、硫酸镁0.6，其他为蒸馏水，ph7.0～7.2。
[0085]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。