一种基于深紫外LED的生物膜细菌灭活方法与流程

一种基于深紫外led的生物膜细菌灭活方法
技术领域
1.本发明涉及生物膜治疗领域，尤其涉及一种生物膜细菌灭活方法。


背景技术：

2.人工关节置换术将具有特定功能与构造的关节假体植入重度关节炎患者体内，替换原有受损严重的关节结构，部分或者全部恢复关节的功能。人工关节置换术主要分为两种：人工髋关节置换术、人工膝关节置换术。人工髋关节置换术能够有效改善晚期骨性关节病、股骨颈骨折、粗隆间骨折、髋关节发育不良、严重股骨头坏死等疾病患者的髋关节功能，消除患者髋关节疼痛、活动受限等。人工膝关节置换术目前已被公认为安全且有效的治疗终末期膝关节退行性骨关节病、类风湿性关节炎、创伤性关节炎等疾病的治疗措施。
3.常用的人工关节材料主要有金属材料、高分子材料、陶瓷材料和复合材料。其中，金属材料的机械强度高，韧度高，易于加工，常用来制作结构复杂和受力较大的关节假体，典型的金属材料主要有316l型不锈钢、钛、钛合金、钴铬钼合金以及钴基合金。
4.现有文献数据显示，初次人工全髋关节置换术后假体周围感染的发生率约在0.5％～ 3.0％，而二次置换术后发生假体周围感染的可能性高达4.0％～6.0％。
5.生物膜(biofilm,bf)在假体周围感染的发病机制和持久性起着重要的作用。生物膜是一种微生物衍生的复杂菌落，指细菌、真菌等嵌入自身分泌的胞外聚合物内形成的含多细胞的三维结构群体，并且具有改变生长速度和基因转录表型的能力。与自由漂浮的细菌、真菌即浮游细菌、真菌相比，形成生物膜细菌、真菌显示出影响致病微生物鉴定和抗微生物治疗的特征。
6.传统的细菌、真菌感染是用抗生素来治疗的，抗生素可以抑制感染部位的发展以及杀死细菌、真菌，但是，当细菌、真菌以生物膜形式存在时，抗生素不能进入生物膜有效杀灭细菌、真菌，抗生素的长期使用还会导致耐药性增加。目前，研究人员正在尝试使用新型的杀菌方式代替抗生素，已有报道证明紫外线辐射、光动力治疗、蓝光、近红外光等治疗方式可以灭活微生物以及生物膜、真菌。
7.生物膜的治疗更具挑战性，其对抗生素的浓度耐受性可提高100-1000倍，抗生素无法进入生物膜内杀死细菌。清创手术也不能有效彻底清除假体表面的生物膜，导致清创手术成功率不到30％。


技术实现要素：

8.针对现有技术中生物膜治疗方法的缺陷，本发明公开了一种深紫外线结合外科脉冲冲洗处理，以清除骨科假体材料上的生物膜的方法，具体步骤包括：
9.(1)深紫外辐射处理：使用深紫外led照射骨科假体材料上的生物膜；
10.(2)外科脉冲冲洗处理：外科脉冲冲洗骨科假体材料；
11.或者先执行步骤(2)，再执行步骤1。
12.进一步地，深紫外led的波长为200-350nm。
13.进一步地，深紫外led辐射剂量≥840mj/cm2。
14.进一步地，冲洗时所使用的液体为0.9％的氯化钠溶液。
15.进一步地，冲洗的水量为500ml/min。
16.进一步地，冲洗的出水压力为5psi。
17.进一步地，冲洗时间≥10min。
18.进一步地，产生生物膜的微生物包括金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，大肠杆菌，真菌等菌种。
19.进一步地，所述的假体材料选自金属材料、高分子材料、陶瓷材料或复合材料。
20.与现有技术相比，本发明具有以下优势：
21.1.传统方法以抗生素治疗细菌感染，无法有效杀灭生物膜形式存在的细菌，抗生素长期使用还会导致耐药性增加。本发明提供的方法杀灭生物膜的效率高，可消灭99.99998％的菌落，且不易复发，不产生耐药性问题。
22.2.本发明所述的方法操作简单，方法中涉及的设备均为医院中常用设备，易于操作。
附图说明
23.图1为本发明生物膜细菌灭活方法的步骤示意图，所述步骤的顺序可以颠倒；
24.图2为本发明实施例2中实验用深紫外模组图；
25.图3为本发明实施例2中的led电路板图；
26.图4为本发明实施例2中深紫外模组的仿真温度分布云图；
27.图5为本发明实施例2中包含周围环境的深紫外led模组温度仿真云图；
28.图6为本发明实施例3中深紫外led发光特性曲线；
29.图7为本发明实施例3的照度仿真结果；
30.图8为本发明实施例4的紫外辐射试验示意图；
31.图9为本发明实施例5中骨科假体材料表面菌落残留量的柱状图。
具体实施方式
32.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
33.实施例1 细菌生物膜培养
34.首先将钛金属片清洗、干燥、灭菌处理，随后将钛金属片置于24孔板中，并取适量的细菌溶液置于放有钛金属片的孔板中。将孔板放置于细菌培养箱24h后(细胞培养箱的维度为37度，co2浓度为5％)，钛金属上即可附着有细菌生物膜，钛金属片的大小为7*7mm。
35.实施例2 深紫外模组的设计
36.试验用深紫外模组如图2所示，由深紫外led阵列，铝散热器组成。深紫外模组中包含9颗相同的深紫外led，相邻两颗led之间的距离为3.1mm。为了保证9颗led点亮时电流一致，9颗led采用串联的方式连接，电路图如图3所示。
37.深紫外led长时间在高结温(》120℃)的情况工作，各方面的性能都会严重的下降，
严重时甚至会损坏深紫外led。因此，基于有限元理论，对深紫外模组的温度分布进行模拟仿真。仿真用到的参数如表1所示。深紫外led的热功率为电功率与紫外功率的差值。因为紫外功率远小于热功率，本实施例取深紫外led的电功率作为热功率。
38.图4为深紫外模组的仿真温度分布云图。在图中可以看出：由于热耦合效应的存在，9 颗led中最中间的一颗led的温度最高，为63.96℃。63.96℃远低于深紫外led规格书中给出的最高工作节温，因此该深紫外模组可以在被动散热的情况下，长时间正常的工作。
39.图5为包含周围环境的深紫外led模组温度仿真云图。在深紫外辐射实验中，钛金属片距离深紫外led 2cm。根据仿真结果可知，在辐射实验中，深紫外led的热量会造成钛金属片的温度上升，但是温度增量很少，只有不到1℃(0.43℃)。
40.表1有限元热仿真参数
[0041][0042]
实施例3 照度仿真试验
[0043]
本实施例通过蒙特卡洛光学追迹的方法，模拟了9颗深紫外led(实施例2)共同照射到距离为2cm的平面的上照度分布的情况。光学仿真需要用到深紫外led的发光特性曲线，如图6所示。辐射照度的仿真结果如图7所示，图中红色框框的面积为7*7mm，与钛金属片的尺寸相同。从图中可以看，深紫外模组作用到钛金属片(实施例1)上的照度基本上是均匀的。
[0044]
实施例4 紫外辐射试验：
[0045]
紫外试验设置如图8所示，主要包括散热器、pcb、uvc led灯珠、支撑铜柱、培养皿、附有生物膜的人工骨材料片组成。使用铜柱支撑散热器，使uvc led灯珠平行于试验台面。在实验时需要将孔板中的钛合金片取出，放置于开口较大的培养皿中，这样避免容器壁对深紫外线的遮挡。
[0046]
实施例5 生物膜细菌灭活处理
[0047]
活菌计数方法：
[0048]
在进行灭活处理后，首先使用磷酸缓释盐水清洗钛金属片，清洗掉钛金属片表面附着的游离细菌。重复3次使用35khz的超声波处理钛金属片，将钛金属片表面的细菌转移至 10ml磷酸缓释盐水中。将细菌溶液进行一系列的10倍稀释，并将溶液涂于琼脂平板上。并将琼脂平板在温度为37℃、co2浓度为5％的环境里面培养24h。其后观察不同稀释倍数琼脂平板上的细菌菌落数量。
[0049]
结果验证：
[0050]
表2设置了5种不同的灭活处理方式试验，其中处理方式1为未处理，作为对照组。处理方式3和处理方式4的区别为，处理方式3中先进行外科脉冲清洗然后进行紫外辐射处理，处理方式4正好相反。
[0051]
表2不同的灭活方式以及试验样本量
[0052]
[0053][0054]
表3不同处理方式的细菌灭活率
[0055]
序号12345处理方式未处理冲洗冲洗 紫外紫外 冲洗紫外log灭活率/3.233.886.771.47百分比灭活率(％)/99.9499.9899.9999896.61
[0056]
不同处理方式后，骨科假体材料表面上残余的细菌菌落数量如图9所示。表3计算了不同处理方式的细菌灭活率。可以看出，单纯的外科脉冲清洗以及紫外辐射均可以使骨科假体材料表面上的细菌下降10倍。因为骨科假体材料表面上的细菌菌落数量巨大，残留的菌落仍有很大的可能继续繁殖，“冲洗 紫外”以及“紫外 冲洗”处理方式均有超过100倍的灭活效果，其中“紫外 冲洗”处理方式的灭菌效果更佳，消灭了99.99998％的菌落，骨科假体材料表面上的菌落浓度仅为29.51cfu/mm-2
。“紫外 冲洗”方式的灭活细菌生物膜的效果最好，推测原因为：单纯紫外辐射的杀菌效果有限(1.47log)，但是紫外会降低细菌生物膜活力，降低其与骨科假体材料表面的结合力，使细菌生物膜更容易被脉冲水给冲洗下来。
[0057]
所述深紫外辐射处理方法为使用200-350nm的深紫外led照射骨科假体材料上生物膜，辐射剂量≥840mj/cm2以上。
[0058]
所述外科脉冲冲洗处理方法为冲洗时所使用的液体为0.9％的氯化钠溶液，冲洗的水量为500ml/min，出水压力为5psi，冲洗时间≥10min。