一种硫酸酯酶的水溶性荧光探针及其合成方法和应用与流程

1.本发明提供了一种可用于选择性检测硫酸酯酶的水溶性荧光探针。涉及一种硫酸酯酶的荧光探针及其合成方法和应用。


背景技术：

2.硫酸酯酶(sulfatase)在生物系统中裂解硫酸盐酯，在调节决定许多生理分子功能的硫酸盐状态中起关键作用。存在于人体的硫酸酯酶主要分为两类，一类是存在于微粒体的不溶性硫酸酯酶，另一类硫酸酯酶是广泛存在于哺乳动物所有组织中的溶酶体硫酸酯酶。它的底物范围从小的胞质类固醇，如硫酸雌激素，到复杂的细胞表面碳水化合物，如糖胺聚糖。这些分子的转化与重要的细胞功能有关，包括激素调节、细胞降解和信号通路的调节。硫酸酯酶也与各种病理生理条件的发病有关，包括激素依赖性癌症、溶酶体储存障碍、发育异常和细菌发病机制。因此，开发能够实时检测细胞中硫酸酯酶的探针具有重要意义。
3.荧光探针是有效检测生命体内硫酸酯酶的手段之一，相比吸光度法具有检测灵敏，作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。目前应用于检测方法是商业化硫酸酯酶探针：4-甲基伞形酮硫酸盐，最近检测硫酸酯酶的荧光探针虽然有一些新的发展，但是探针水溶性差，缺少检测亚细胞器中的硫酸酯酶(如溶酶体硫酸酯酶)，并且选择性仍局限于检测类固醇硫酸酯酶。同时硫酸酯酶有很多底物交叉现象，开发对其有选择性的新的代谢底物的探针具有很大创新。


技术实现要素：

4.本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内溶酶体硫酸酯酶的水溶性荧光探针，此探针可以在生理条件下选择性地与硫酸酯酶作用，作用后荧光显著增强。在小分子4-溴-1,8-萘二甲酸酐类作为荧光母体，引入n-(2-氨基乙基)吗啉定位于溶酶体，引入beta-葡萄糖作为活性位点，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测活细胞中的硫酸酯酶。
5.本发明提供所述硫酸酯酶的荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
6.(1)将4-溴-1，8-萘二甲酸酐(化合物1)和n-(2-氨基乙基)吗啉混合溶于乙醇中，90℃加热回流4小时，冷却过滤，减压浓缩得到化合物2(白色固体)。该步骤中，4-溴-1，8-萘二甲酸酐(化合物1)和n-(2-氨基乙基)吗啉以摩尔比1：(2-2.5)；4-溴-1，8-萘二甲酸酐与乙醇的摩尔体积比为1:(2-3)mmol/ml。
7.(2)将化合物2，碳酸钾和2-2-叔丁膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(t-buxphos)混合溶于n,n-二甲基甲酰胺和水(10：1)的混合溶液，加入醋酸钯。氮气保护，90℃加热回流搅拌16小时，冷却浓缩，粗品在乙醇和水(5:1)混合液中溶解过滤，得到化合物3(黄色固体)，命名为mn。该步骤中，化合物2、碳酸钾和2-2-叔丁膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(t-buxphos)以摩尔比1：(2-2.5)：(0.04-0.05)；化合物2与n,n-二甲基甲酰胺的摩尔体积比1:(1.5-2.5)；化合物2与醋酸钯摩尔比(20-25):1；化合物2与乙醇的摩尔体积比(0.5-0.6):
1mmol/ml。
8.(3)将化合物3、氧化银和2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-d-吡喃葡萄糖溴化物溶于乙腈，氮气保护，混合物在80℃加热回流16小时，冷却浓缩，柱层析分离，(二氯甲烷：甲醇＝50:1-20:1)得到化合物4(黄色固体)。该步骤中，化合物3、氧化银和2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-d-吡喃葡萄糖溴化物摩尔比1:(1.8-2.2):(1.4-1.6)；化合物3与乙腈的摩尔体积比1：(6-7)mmol/ml。(4)将化合物4和甲醇钠溶于甲醇，氮气保护，室温搅拌2小时，加入浓度2m的盐酸猝灭反应，调整ph至6.0，减压浓缩，制备型色谱分离得到最终产物(黄色固体)，命名为mng。该步骤中，化合物4和甲醇钠摩尔比1:(1.5-2.5)；化合物4与甲醇的摩尔体积比1：(3-4)mmol/ml。
9.探针的合成过程如下所示：
[0010][0011]
另外，分别通过核磁共振氢谱、碳谱、质谱、紫外光谱对产物mng进行表征，表明所述荧光探针mng成功合成。
[0012]
本发明提供这种硫酸酯酶的荧光探针，其结构式如ⅰ所示：
[0013][0014]
上述结构式ⅰ可对硫酸酯酶定性的检测。本发明所述的mng探针，在没有加入硫酸酯酶时，所述探针的最大吸收为360nm和荧光发射波长为444nm，当加入硫酸酯酶，最大吸收和最大发射均红移至450nm和568nm，反应生成具有结构式ii的化合物mn，从而导致荧光改变。
[0015][0016]
结构式ⅰ可对硫酸酯酶定量的检测。将结构式ⅰ的水溶液加入到浓度呈梯度变化的硫酸酯酶水溶液中，在酶促动力学线性反应时间内即可根据荧光强度从读出待测溶液中硫酸酯酶的含量。
[0017]
作为特异性的硫酸酯酶的荧光探针，根据荧光强度变化，用于硫酸酯酶抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价；还用于检测各种活细胞内硫酸酯酶的活性，借助其溶酶体靶向可以快速定位于溶酶体，并用于检测溶酶体硫酸酯酶的活性。
[0018]
本发明在小分子4-溴-1,8-萘二甲酸酐类作为荧光母体，引入n-(2-氨基乙基)吗啉定位于溶酶体，引入beta-葡萄糖作为活性位点，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测活细胞中的溶酶体硫酸酯酶。
[0019]
本发明的有益效果：该化合物作为高灵敏的硫酸酯酶探针，主要实现溶酶体的定位及显示活性，并且可以筛选药物抑制剂。
[0020]
1)廉价易得：可通过简单化学合成获得，合成原料廉价易得，合成工艺简单易行，
成本低，易于推广；
[0021]
2)高灵敏度：探针可以被硫酸酯酶特异性水解释放羟基，测定硫酸酯酶的检测限0.131mu/ml；
[0022]
3)抑制剂筛选：用于硫酸酯酶抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价；
[0023]
4)活细胞检测：该化合物可以借助其溶酶体靶向可以快速定位于溶酶体，并用于检测溶酶体硫酸酯酶的活性。尤其是，该化合物可用于人脑胶质瘤细胞内的溶酶体硫酸酯酶检测，这对于深入研究硫酸酯酶在生物体内生理和病理过程的动力学机理具有重要意义。
附图说明
[0024]
图1本发明提供的荧光探针mng检测硫酸酯酶的原理示意图；
[0025]
图2实施例1中合成的化合物2的1h nmr(a)，
13
c nmr(b)谱图；
[0026]
图3实施例1中合成的化合物3的1h nmr(a)，
13
c nmr(b)谱图；
[0027]
图4实施例1中合成的化合物4的1h nmr(a)，
13
c nmr(b)谱图；
[0028]
图5实施例1中合成的探针mng的1h nmr(a)，
13
c nmr(b)谱图；
[0029]
图6实施例2中荧光探针mng对硫酸酯酶响应的的紫外可见光谱(a)和荧光光谱(b-c)；
[0030]
图7实施例3中荧光探针mng对硫酸酯酶的选择性示意图；
[0031]
图8实施例4中荧光探针mng对不同浓度的硫酸酯酶响应的动力学示意图(a)及反应速率与酶浓度的线性关系(b)；
[0032]
图9实施例5中荧光探针mng被硫酸酯酶(a)和复杂体系(人肝细胞浆)(b)催化的反应速率的的动力学示意图；
[0033]
图10实施例6中荧光探针mng进行硫酸酯酶的抑制剂舒巴坦ic
50
测试示意图；
[0034]
图11实施例7中荧光探针mng在t98g细胞中成像示意图；
[0035]
图12实施例8中荧光探针mng在t98g细胞中溶酶体共定位成像示意图。
具体实施方式
[0036]
实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
[0037]
实施例1(探针mng的合成)：
[0038]
荧光探针mng的合成路线如下，具体包括以下步骤：
[0039]
(1)将18.1mmol 4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于40ml乙醇，加入n-(2-氨基乙基)吗啉36.2mmol，混合物在90℃回流加热4小时，出现大量白色固体，冷却至室温后过滤，过滤后固体减压浓缩得到化合物2(白色固体)，产率68.1％。
[0040]
对本实施例制备的化合物2进行核磁共振分析(图2(a-b))。其结果如下：1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.65(d,j＝7.3hz,1h),8.58(d,j＝8.5hz,1h),8.41(d,j＝7.8hz,1h),8.05(d,j＝7.8hz,1h),7.85(t,j＝7.9hz,1h),4.34(t,j＝6.8hz,2h),3.67(d,j＝4.8hz,4h),2.71(t,j＝6.9hz,2h),2.59(s,4h).
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ163.64,163.61,133.33,132.05,131.24,131.12,130.68,130.33,129.07,128.10,123.08,122.21,77.33,77.21,77.01,76.69,67.03,56.08,53.81,37.32,-0.00.
[0041][0042]
(2)将化合物2 10.2mmol，碳酸钾20.6mmol和2-2-叔丁膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(t-buxphos)0.5mmol溶于n,n-二甲基甲酰胺和水(体积分别为20ml与2ml)的混合溶液，加入醋酸钯0.5mmol。氮气保护下90℃回流加热16小时，冷却至室温，浓缩至固体，粗品在乙醇和水(体积分别为20ml与4ml)混合液中溶解过滤，得到化合物3(黄色固体)，命名为mn，产率63.1％。对本实施例制备的化合物3进行核磁共振分析(图3(a-b))。其结果如下：1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.31(d,j＝7.2hz,1h),7.89(d,j＝8.1hz,1h),7.82(d,j＝8.3hz,1h),7.14(t,j＝7.8hz,1h),6.35(d,j＝8.1hz,1h),4.47(s,2h),3.91(t,j＝4.7hz,4h),3.16(s,3h),0.85(d,j＝6.0hz,4h).
13
c nmr(101mhz,dmso)δ164.18,163.45,161.25,134.15,131.62,129.77,129.50,125.98,123.00,122.21,112.63,110.57,66.59,56.13,53.83,40.62,40.41,40.20,39.99,39.78,39.58,39.37,36.92.
[0043]
(3)将化合物3 3.1mmol，氧化银6.2mmol溶于20ml乙腈，加入2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-d-吡喃葡萄糖溴化物4.6mmol，氮气保护下混合物在80℃加热回流16小时，冷却至室温，浓缩成固体，柱层析分离得到化合物4(黄色固体)，命名为mng，产率45％。
[0044]
对本实施例制备的化合物4进行核磁共振分析(图4(a-b))。其结果如下：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.52(t,j＝7.8hz,2h),8.36
–
8.28(m,1h),7.91(t,j＝7.9hz,1h),7.46(d,j＝8.4hz,1h),5.99(d,j＝7.8hz,1h),5.54(t,j＝9.6hz,1h),5.36(dd,j＝9.8,7.9hz,1h),5.12(t,j＝9.7hz,1h),4.27(dd,j＝12.4,5.4hz,1h),4.18(s,2h),4.22
–
4.05(m,2h),3.53(t,j＝4.5hz,5h),3.18(d,j＝5.1hz,2h),2.47(d,j＝4.7hz,4h),2.04(d,j＝5.9hz,12h).
13
c nmr(101mhz,dmso)δ170.44,170.07,169.96,169.78,163.82,163.18,157.13,132.96,131.76,129.01,127.91,127.61,123.15,122.52,116.84,110.05,97.41,71.93,71.75,70.98,68.43,66.68,61.98,60.21,56.02,53.87,49.05,40.59,40.38,40.17,39.96,39.85,39.75,39.63,39.54,39.33,37.18,20.92,20.86,20.82,20.77,14.53.
[0045]
(4)将化合物4 1.1mmol溶于4ml甲醇，加入2.2mmol甲醇钠，室温搅拌2小时，加入浓度2m的盐酸调整ph至6.0，猝灭反应，，减压浓缩成固体，制备型色谱(kromasil c18(250*50mm*10mm)，a：水(10mm nh4hco3)，b:乙腈；线性洗脱梯度：10％-50％b；梯度时间：10分钟)分离得到最终产物mng(黄色固体)，产率33.7％。
[0046]
对本实施例制备的探针mng进行核磁共振分析(图5(a-b))，其结果如下：1h nmr(400mhz,deuterium oxide):δ7.42(d,j＝8.0hz,1h),7.20(dd,j＝18.7,7.5hz,2h),6.84(t,j＝7.6hz,1h),6.47(d,j＝8.3hz,1h),4.93(d,j＝7.4hz,1h),3.90(d,j＝10.7hz,1h),3.77
–
3.72(m,1h),3.68(t,j＝4.6hz,4h),3.56(dq,j＝16.6,9.2hz,3h),3.44(t,j＝9.3hz,3h),2.54
–
2.46(m,4h),2.16(t,j＝8.4hz,2h).
13
c nmr(101mhz,d2o):δ163.42,162.58,157.18,132.87,131.10,128.95,126.24,125.73,120.77,118.10,112.53,108.67,98.98,76.26,75.50,72.64,69.53,65.99,60.86,54.15,52.62,36.22.
[0047]
实施例2(荧光探针mng及产物mn水溶液的紫外可见吸收光谱(a)和发射光谱(b-c))：
[0048]
将mng溶于超纯水，mn溶于二甲基亚砜中，配置成1mm储备液，加入硼酸硼砂缓冲液(bb)(50mm,ph＝5)中，用储备液配置成20um的溶液。取200ul溶液加入96孔板中，测量该工作液的紫外可见吸收光谱(a)和发射光谱(b:激发波长360nm,c:激发波长450nm)；结果显
示:在水溶液中，探针mng的吸收波长为360nm，mn的吸收波长为450nm。探针mng最大发射波长为444nm,荧光团mn最大发射波长为568nm。
[0049]
实施例3(mng对硫酸酯酶的选择性)：
[0050]
分别配置乙酰胆碱酯酶(1mg/ml)，磷脂酶(1mg/ml)，脂酶a(1mg/ml)，硫酸酯酶(10u/ml)，羧酸酯酶1(1mg/ml)，羧酸酯酶2(1mg/ml)，beta-半乳糖苷酶(10u/ml)，beta-葡萄糖醛酸酶(10u/ml)，beta-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶(7.5u/ml)，alpha-葡萄糖苷酶(10u/ml)的水溶液，分别单独-80℃冷冻储存，使用前在冰上缓慢溶解。配置mng(1mm)的水溶液。每个反应体系总体积200ul，在硼酸硼砂缓冲液(50mm,ph＝5)中分别加入上述不同的酶液，37℃预孵育5分钟，加入探针起始反应，37℃孵育1小时，探针mng终浓度为20um，酶的终浓度分别为乙酰胆碱酯酶(0.2mg/ml)，磷脂酶(0.2mg/ml)，脂酶a(0.2mg/ml)，硫酸酯酶(0.2u/ml)，羧酸脂酶1(0.2mg/ml)，羧酸酯酶2(0.2mg/ml)，beta-半乳糖苷酶(0.2u/ml)，beta-葡萄糖醛酸酶(0.2u/ml)，beta-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶(0.2u/ml)，alpha-葡萄糖苷酶(0.2u/ml)，使用酶标仪及96孔酶标板进行测量，λex＝450nm，λem＝568nm。
[0051]
mng对硫酸酯酶的选择性实验结果如图7所示，纵坐标表示波长为568nm处的荧光强度(实验组与对照组(含有20um探针mng的硼酸硼砂缓冲液)的比值)。图7表明mng对硫酸酯酶具有较好的选择性，体系荧光显著增强。测定条件下，相比于硫酸酯酶，其他酶几乎没有响应，说明选择性良好。
[0052]
实施例4(mng量化硫酸酯酶)：
[0053]
配置5u/ml的硫酸酯酶，反应体系总体积200ul，在硼酸硼砂缓冲液(50mm，ph＝5)中分别加入1、2、3、4、5、6、7、8、9和10ul不同体积(5u/ml)的硫酸酯酶，预孵育5分钟，加4ul mng(1mm)起始反应，37℃，孵育1小时，使用96孔酶标板及酶标仪进行测量，测量该工作液的荧光发射光谱，λex＝450nm，λem＝568nm。结果显示：如图8，从0.025u/ml到0.25u/ml，随酶浓度的增长，反应体系的荧光强度逐渐增强，mn的生成速率成比例增长。
[0054]
实施例5(mng的酶学参数测定)：
[0055]
配置一系列浓度梯度(0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、5、7.5和10mm)的mng的水溶液，每个反应在192ul的硼酸硼砂缓冲液(50mm)中分别加4ul mng以及4ul的硫酸酯酶(10u/ml)，酶标仪及96孔酶标板进行测量。37℃孵育20分钟，测量该工作液的荧光发射光谱，λex＝450nm，λem＝568nm。结果显示：如图9(a)，探针mng被硫酸酯酶催化符合酶动力学(即米氏方程)中的模型，其中km＝21.60μm，v
max
＝70.93nmol/min/mg。
[0056]
每个反应在192ul的硼酸硼砂缓冲液(50mm，ph＝5)中加4ul mng(1.25、2.5、5、7.5、10、12.5、25和50mm)以及4ul的肝细胞浆(cytosol)混合体系(10mg/ml)，96孔酶标板及酶标仪进行测量。37℃孵育20分钟，测量该工作液的荧光发射光谱，λex＝450nm，λem＝568nm。结果显示：如图9(b)，探针mng被硫酸酯酶催化符合酶动力学中的模型(即米氏方程)，k
m＝
54.76μm，v
max＝
5.166nmol/min/mg。
[0057]
实施例6(mng的抑制实验)：
[0058]
筛选的抑制剂：舒巴坦。配置一系列浓度梯度工作液:舒巴坦(0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5和7.5mm)，每个反应在192ul的硼酸硼砂(bb)缓冲液(50mm，ph＝5)中分别加2ul上述舒巴坦工作液以及4ul的硫酸酯酶(10u/ml)，2ul探针mng(1mm)起始反应。使用酶标仪及96孔酶标板进行测量。37℃孵育30分钟，测量该工作液的荧光发射光谱，λex＝
450nm，λem＝568nm。结果显示：如图10，mng被硫酸酯酶的催化作用可以被硫酸酯酶抑制剂抑制,计算ic50是3.49um。
[0059]
实施例7(探针mng用于t98g细胞中硫酸酯酶的检测)：
[0060]
t98g细胞按照美国组织培养标本库(american type tissue culture collection)规定进行培养，接种于35mm
×
12mm(直径*高度)的培养皿中培养24h使之贴壁，使用前将培养液弃去，用50mm ph＝7硼酸硼砂缓冲液洗三次。空白组为：单纯含有硼酸硼砂缓冲液1ml的t98g细胞的培养皿，37℃孵育4小时，观察；实验组：于带有t98g细胞的培养皿中加入mng(终浓度40um)的1ml硼酸硼砂缓冲液(50mm ph＝7)，37℃孵育4小时观察；抑制剂组，于带有t98g细胞的细胞培养皿中加入硫酸酯酶抑制剂舒巴坦(终浓度3.5um)的硼酸硼砂缓冲液(50mm ph＝7)1ml孵育30min，再加探针mng(终浓度40um)孵育4小时.使用共聚焦显微镜olympus fv1000(ex.405nm,em.475-575nm)镜头(
×
60)进行观察以及图像采集。结果显示：如图11，第一行是亮场图像，第二行是荧光通道图像，最后一行是叠加图。实验组t98g细胞荧光图像亮度明显高于空白组，使用抑制剂抑制，抑制剂组荧光明显减弱。该实验证明探针mng可以用于细胞中硫酸酯酶的检测。
[0061]
实施例8(探针mng在t98g细胞中溶酶体共定位成像):
[0062]
t98g细胞按照american type tissue culture collection规定进行培养，接种于35mm
×
12mm(直径*高度)的培养皿中培养24h使之贴壁，使用前将培养液弃去，用50mm ph＝7硼酸硼砂缓冲液洗三次，mng探针和lyso-tracker red染色，置于共聚焦荧光显微镜下拍照。第一列是亮场图像，第二列是荧光通道图像，最后一列是叠加图。如图12第一行(最上面的一行)所示，探针mng(终浓度40um)染色，37℃孵育4小时，405nm激发通道。如图12第二行(中间的一行)所示，用商业化亚细胞器定位试剂lyso-tracker red(终浓度50nm)复染细胞，37℃孵育1小时，543nm激发通道，第三行(最下面的一行)是两个通道的叠加图，验证探针可以定位到细胞溶酶体。结果显示：与lyso-tracker red复染的皮尔森系数很高。