喹啉酮化合物作为骨髓间干细胞成骨分化促进剂的应用的制作方法

1.本发明属于干细胞促进剂技术领域，具体涉及喹啉酮化合物作为骨髓间干细胞成骨分化促进剂的应用。


背景技术：

2.牙周病是人类发病率最高的疾病之一，与心血管疾病和肿瘤被世界卫生组织(who)并列为人类重点防治的三大非传染性疾病。40岁以上的中老年患者多发此病。牙周炎尤其是重度牙周炎常伴发牙槽骨的吸收，引起牙齿的松动和脱落。严重影响患者的进食和美观。临床上，轻度(ⅰ度)牙周炎以基础治疗为主。中度及重度(ⅱ、ⅲ度)牙周炎常采用引导骨组织再生的方法促进牙槽骨的修复。引导骨组织再生是一种重要的治疗方法。骨髓间充质干细胞具有低免疫原性并具有多向分化的潜能，其成骨分化的能力在引导骨组织再生的过程中发挥决定性的作用。然而，骨髓间充质干细胞有限的成骨分化及易于老化的特性限制了骨再生。目前，尚未发现明显促进骨髓间充质干细胞成骨分化的有效成分。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供喹啉酮化合物作为骨髓间干细胞成骨分化促进剂的应用，能够显著促进骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因的mrna水平和蛋白水平的表达。
4.本发明所采用的技术方案是，喹啉酮化合物作为骨髓间干细胞成骨分化促进剂的应用。
5.本发明的特点还在于，
6.喹啉酮化合物为4-羟基-3-甲氧基-4-苯基-3,4-二氢喹啉-2(1h)-喹啉酮，其结构式如式(i)所示：
[0007][0008]
本发明所采用的另一技术方案是，4-羟基-3-甲氧基-4-苯基-3,4-二氢喹啉-2(1h)-喹啉酮的制备方法，具体为：在氮气保护下，将2-氨基二苯甲酮溶于dcm中，在碳酸钾的催化下，加入甲氧基乙酰氯室温反应半小时后加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相减压除掉溶剂，干燥后溶于thf中，加入t-buoh室温反应5小时，反应液用饱和氯化铵溶液萃取、乙酸乙酯萃取。减压除掉有机相后，残留物用硅胶柱色谱纯化，即可得到白色无定形粉末状化合物i。
[0009]
本发明的有益效果是，本发明的化合物能够显著促进骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因alp、ocn和runx2的mrna水平和蛋白水平的表达，可用作间充质干细胞成骨分化的促进剂，从而为治疗牙周病，骨质疏松，骨损伤等疾病提供更多的成骨细胞。
附图说明
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图1为本发明实施例中细胞活力的测试结果；
[0011]
图2为本发明实施例中细胞增殖的测试结果图；
[0012]
图3为本发明实施例中qrt-pcr检测成骨相关基因的测试结果图；
[0013]
图4为本发明实施例中茜素红染色结果图；
[0014]
图5为本发明实施例中alp染色结果图；
[0015]
图6为本发明实施例中alp活性检测结果图。
具体实施方式
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下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
[0017]
本发明以2-氨基二苯甲酮为原料，对其进行合成得到了一个新的式i结构活性衍生物，式i化合物能够显著促进骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因alp、ocn和runx2的mrna水平和蛋白水平的表达，可用作间充质干细胞成骨分化的促进剂，应用前景广泛。
[0018]
实施例
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式i化合物4-羟基-3-甲氧基-4-苯基-3,4-二氢喹啉-2(1h)-喹啉酮
[0020][0021]
在氮气保护下，将2-氨基二苯甲酮(50mg,0.25mmol)溶于dcm(5ml)中，碳酸钾催化下，加入甲氧基乙酰氯(45ul,0.5mmol,2eq)后室温反应半小时后加水淬灭，乙酸乙酯萃取。有机相减压除掉溶剂，干燥后，溶于thf(10ml)中，加入t-buoh(225mg,25mml)室温反应5小时。反应液用饱和氯化铵溶液萃取，乙酸乙酯萃取。减压除掉有机相后，残留物用硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯/石油醚(v/v)＝1/2)，得到白色无定形粉末状化合物i(63mg,95％)，产率92％。
[0022]
式i化合物的结构确认数据：
[0023]1hnmr(500mhz,cdcl3):δ3.54(s,3h),4.00(s,1h),6.85(d,j＝7.8hz,1h),7.07(t,j＝7.6hz,1h),7.26-7.34(m,7h),8.4(s,1h).
13
cnmr(125mhz,cdcl3):δ59.8,84.2,115.4,124.1,126.5,128.1,128.3,128.5,129.5,135.2,140.2,168.1.esims m/z 270.08[m h]

,292.04[m na]

。
[0024]
细胞增殖及活力检测
[0025]
1)实验材料
[0026]
鼠骨髓间充质干细胞取自两周大sd雌鼠的股骨和胫骨。
[0027]
大鼠用10％的水合氯醛麻醉后处死，酒精消毒。置于紫外照射后的操作台。取下大
鼠的股骨和胫骨，用含双抗的pbs洗两遍。去掉股骨和胫骨的两端，用5ml注射器将骨髓冲出，过滤，1000rpm离心3分钟，离心后的细胞置于培养瓶。
[0028]
2)细胞培养及受试化合物准备
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培养瓶中的细胞添加含10％胎牛血清、1％双抗的α-mem培养基，每3天换一次新鲜的培养基，至细胞长到80％-90％，将细胞消化传代，细胞传至2-3代用于实验(yang h,et al.j.neuroinflammation.2020,154)。
[0030]
所待测样品均溶解于dmso中。
[0031]
3)细胞增殖及活性检测
[0032]
骨髓间充质干细胞与不同浓度(0μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,2μg/ml及4μg/ml)的式i化合物的溶液进行培养。每三天换一次液。分别培养3天、5天和7天之后，使用cck-8试剂按照说明书对细胞增殖及活力进行检测(zhou l,et al.life sci.2020,118563)。
[0033]
4)检测结果
[0034]
细胞增殖及活力检测的实验结果如图1和图2所示，从图中可以看出，式i化合物在0.5μg/ml时具有促进细胞增殖的作用；在第3天及第5天，1μg/ml和2μg/ml的式i化合物对细胞增殖没有影响，但是从第7天开始，细胞增殖率开始下降。从第3天开始，4μg/ml的式i化合物表现出抑制细胞增殖的作用。
[0035]
qrt-pcr检测成骨相关基因
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1)细胞培养及rna提取
[0037]
骨髓间充质干细胞与不同浓度(0μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,2μg/ml及4μg/ml)的式i化合物溶液共同培养7天后，使用trizol试剂提取总的rna，使用primescript rt试剂合成cdna,sybr premix ex taq试剂和cfx96 real-time系统进行扩增。
[0038]
2)数据处理
[0039]
得到的数据与内参进行标准化，并使用2-δδct方法进行计算(zhang j,et al.int.j.oral.sci.2019,12)。
[0040]
3)实验结果
[0041]
实验结果如图3所示，结果显示，0.5μg/ml和1μg/ml浓度下，碱性磷酸酶(alp)、骨钙素(ocn)和runt相关转录因子2(runx2)mrna表达增加。其中1μg/ml对mrna表达的影响最强，是未处理组的2-3倍。2μg/ml和4μg/ml对mrna表达均无影响或抑制作用。
[0042]
茜素红染色实验
[0043]
1)实验操作
[0044]
骨髓间充质干细胞用不同浓度(0μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,2μg/ml及4μg/ml)的式i化合物及成骨诱导液诱导14天，4％的多聚甲醛进行固定30分钟，pbs冲洗3次，茜素红染色液染色30分钟，显微镜下观察(you wl,et al.j.gene med.2020,e3207)。
[0045]
2)实验结果
[0046]
实验结果如图4和图5所示。结果显示，在1μg/ml浓度下钙盐沉积比其他浓度下更多。
[0047]
alp染色及活性检测
[0048]
1)实验操作
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骨髓间充质干细胞用不同浓度(0μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,2μg/ml及4μg/ml)的式
i化合物及成骨诱导液诱导7天后，采用染色和定量分析方法检测alp活性。pbs洗3次，4％的多聚甲醛固定，pbs洗3次，碱性磷酸酶染色试剂按照说明书染色30分钟，显微镜下观察(you wl,et al.j.gene med.2020,e3207)。
[0050]
2)实验结果
[0051]
实验结果如图6所示。结果表明，与mrna表达和ars染色一致，在1μg/ml浓度下有显著的alp活性，在0.5μg/ml浓度下升高较低。
[0052]
结论：体外实验证明，式i化合物在1μg/ml时对骨髓间充质干细胞没有毒性作用，但是具有较强的促进细胞成骨分化的作用；此外，细胞增殖率的下降与细胞成骨分化有关。
[0053]
综上，本发明中式i化合物能够显著的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，具备进一步的研究价值和广阔的开发前景。
[0054]
最后，需要注意的是，还有其他方式用来实施本发明。相应地，本发明的实施例是将作为例证进行说明，但并不限于本发明所描述的内容，还可能是在本发明范围内所作的修改或在权利要求中所添加的等同内容。