具有改善的稳定性的经设计的锚蛋白重复结构域的制作方法

具有改善的稳定性的经设计的锚蛋白重复结构域
1.相关专利申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年6月04日提交给欧洲专利局的欧洲专利申请ep19178282的权益和优先权。欧洲专利申请ep19178282的内容全文以引用方式并入本文，包括所有表、图和权利要求。
技术领域
3.本发明涉及对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，以及具体地讲，涉及具有改善的稳定性的此类经设计的锚蛋白重复结构域。本发明还涉及包含此类经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白、编码此类经设计的锚蛋白重复结构域或蛋白质的核酸、包含此类蛋白质的药物组合物以及此类蛋白质或药物组合物在治疗疾病中的用途。


背景技术：

4.对于其中活性组分通常为蛋白质和/或多肽的生物药物产品，分子构象以及因此生物活性的维持取决于非共价力以及共价力。这些产品对环境因素诸如温度变化、氧化、光、离子含量和剪切特别敏感。为了确保保持生物活性，关键的是此类药物产品的活性组分承受它们在制造、运输和储存期间所暴露的条件。需要尽可能地避免降解和其他形式的分子变化。因此，稳定活性组分的开发对于成功开发商业产品是至关重要的。
5.已经描述了对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且它们对于产生具有延长的终末半衰期的重组结合蛋白而言特别有用(参见例如，wo2012/069654)。与不包含对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质相比，血浆中此类半衰期延长对于治疗用途而言是高度有利的。例如，wo2016/156596描述了一种治疗上有用的锚蛋白重复蛋白，其包含对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。
6.尽管开发了此类对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，但仍然需要并面临挑战来改善当今药物产品(该药物产品一般具有对血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域)的稳定性特性，并且具体地讲贮存稳定性特性。


技术实现要素：

7.我们已经惊讶地发现，本发明的对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域提供进一步改善的稳定性特性，并且具体地讲改善的贮存稳定性特性。因此，据发现，本发明的经设计的锚蛋白重复结构域不仅导致在液体制剂中的改善的贮存稳定性，而且还导致在此类液体制剂中在升高的温度下(例如在60℃下)在热处理期间的有利稳定性特性。后者特别有利于允许纯化包含此类经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。此外，本发明的经设计的锚蛋白重复结构域在升高的温度下在ph偏移期间示出改善的稳定性，这在纯化包含此类经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白时同样是高度有利的。
本发明的经设计的锚蛋白重复结构域的稳定性的改善通过更低程度的假定为降解产物的经鉴定的较低分子量物质而尤其易见，例如在升高的温度下温育和sds page分析之后。继而，在将包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白储存在较低ph下之后，通过尺寸排阻色谱法鉴定出与现有技术产物相比量增加的较高分子量物质，并因此鉴定出量较少的假定降解产物。重组结合蛋白在较低ph下的储存通常可导致不期望的较低分子量物质的出现。此外，应当注意，本发明的经设计的锚蛋白重复结构域的稳定性的改善不减弱其对血清白蛋白的结合特异性。
8.因此，在一个方面，本发明提供对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)。在另一方面，本发明涉及对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含seq id no:13的氨基酸序列。
9.在另一个方面，本发明提供了包含本发明的至少一个、通常且优选地一个或两个经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。
10.在另一方面，本发明提供了编码本发明的经设计的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白的核酸。
11.在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域、本发明的重组结合蛋白或本发明的核酸，以及任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂。
12.在具体实施方式中，本发明的其他方面和实施方案将变得显而易见。
附图说明
13.图1：对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的序列对比。seq id no:3和4表示与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，对血清白蛋白具有结合特异性并具有改善的稳定性的经设计的锚蛋白重复结构域。残基编号在序列上方示出
14.图2：与seq id no:2的序列基序进行比对的，在对血清白蛋白具有结合特异性的不同的经设计锚蛋白重复结构域的残基编号77至79处的序列基序。相应蛋白质的seq id no在比对的左侧处示出。
15.图3：sds-page比较了对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的稳定性。如实施例2中所述制备蛋白质#2、#3和#4(分别由seq id no:2、3和4组成；在n末端处另外具有seq id no:1)，然后如实施例3中所述，在60℃(对于参考而言为-80℃)、ph 7.4、ph 6和ph 5下温育1周，之后如实施例4中所述使用sds-page进行贮存稳定性评估。三张sds page照片代表在ph 7.4、ph 6和ph 5下的测量，如上文相应凝胶所指示的。蛋白质由其seq id no.表示。o:-80℃温育的参考样品。i:60℃温育的样品。mw：分子量标记，其中kda值在左侧示出。
16.图4：对血清白蛋白具有结合特异性的经设计锚蛋白重复结构域的稳定性的labchip分析。如实施例2中所述制备蛋白质#2、#3、#4、#5和#6(分别由seq id no:2至6组
成；全部在n末端处另外具有seq id no:1)，然后如实施例3中所述，在60℃、ph 6、ph 7.4和ph 8.5下温育1周，之后如实施例5中所述使用labchip进行贮存稳定性评估。对于3个不同的ph值，labchip数据以3组显示。分子量标记水平在每组的左侧和右侧示出(以kda为单位)。
17.图5：对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的尺寸排阻色谱。如实施例2中所述制备蛋白质#2、#3和#4(分别由seq id no:2、3和4组成；在n末端处另外具有seq id no:1)，然后如实施例3中所述，在60℃(对于参考而言-80℃)、ph 7.4、ph 6和ph 5下温育1周，之后如实施例6中所述使用尺寸排阻色谱法进行贮存稳定性评估。在图5a中示出了对于ph 7.4，在60℃和-80℃下获得的每种蛋白质的色谱图的叠加，图5b中示出了对于ph 6的所述色谱图叠加，图5c中示出了对于ph 5的所述色谱图叠加。空隙体积在2.18分钟时洗脱，总体积在5.28分钟时洗脱。od：在280nm处的光密度(以360nm处的光密度为参考)，以mau[]为单位；t：时间，以[min]为单位。
[0018]
图6：以1mg/kg静脉内给药的对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在小鼠(a)和食蟹猴(b)中的药代动力学特征。如实施例2中所述制备蛋白质#2、#3和#4(分别由seq id no:2至4组成；全部在n末端处另外具有seq id no:1；符号在附图中示出)，并且如实施例9中所述测定小鼠药代动力学特征，并且如实施例10中所述测定食蟹猴药代动力学特征。示出了来自三只小鼠或两只猴的平均蛋白质浓度，包括相应的标准偏差。c：浓度，以[nm]为单位；t：时间，以[小时]为单位。
[0019]
图7：以1mg/kg静脉内给药的，包含对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白在小鼠中的药代动力学特征。如实施例2中所述制备蛋白质#7、#8、#9、#10、#11和#12(分别由seq id no:7至12组成；全部在n末端处另外具有seq id no:1；符号在附图中示出)，并且如实施例11中所述测定小鼠药代动力学特征。示出了来自三只小鼠的平均蛋白质浓度，包括标准偏差。为了便于比较，蛋白质#7、#9和#11(a)以及蛋白质#8、#10和#12(b)在两个单独的图中显示。c：浓度，以[nm]为单位；t：时间，以[小时]为单位。
具体实施方式
[0020]
本发明提供了对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域、包含此类经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，和编码此类经设计的锚蛋白重复结构域和重组结合蛋白的另外的核酸，以及包含所述经设计的锚蛋白重复结构域、结合蛋白或核酸的药物组合物。本发明还提供了此类重组结合蛋白或药物组合物在治疗疾病中的用途。
[0021]
因此，在一个方面，本发明提供对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)和/或所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)。
[0022]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)。
[0023]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)。因此，在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少93％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含seq id no:3或4的氨基酸序列。
[0024]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)。因此，在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，优选地至少90％，还优选地至少93％，再次还优选地至少95％，并且还优选地至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)。
[0025]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有丝氨酸(s)。因此，在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，优选地至少90％，更优选地至少93％，再次还优选地至少95％，并且还优选地至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有丝氨酸(s)。
[0026]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)。因此，在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，优选地至少90％，还优选地至少93％，再次还优选地至少95％，并且还优选地至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)。
[0027]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列kdfagktplhlaax1x2g(seq id no:13)，其中x1表示选自a、d和i的氨基酸残基；并且x2表示选自a和d的氨基酸残基。优选地，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的
氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，优选地至少90％，还优选地至少93％，再次还优选地至少95％，并且还优选地至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0028]
在一个实施方案中，所述x1和x2中的至少一者是天冬氨酸(d)。在一个实施方案中，所述x1和x2中的至少一者是丙氨酸(a)。在一个实施方案中，所述x1和x2中的至少一者是天冬氨酸(d)，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，优选地至少90％，还优选地至少93％，再次还优选地至少95％，并且还优选地至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述x1和x2中的至少一者是天冬氨酸(d)，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域与所述seq id no:3或4相差最多9、8、7、6、5、4、3、2或一个氨基酸。
[0029]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列kdfagktplhlaax1x2g(seq id no:13)，其中x1和x2各自独立地为选自a和d的氨基酸残基，其中优选地所述x1和x2不相等。优选地，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，优选地至少90％，还优选地至少93％，再次还优选地至少95％，并且还优选地至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0030]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自seq id no:3至6的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自seq id no:3或seq id no:4的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含seq id no:3的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含seq id no:4的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含seq id no:5的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含seq id no:6的氨基酸序列。
[0031]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列kdfagktplhlaaadg(seq id no:14)或kdfagktplhlaadag(seq id no:15)。在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列kdfagktplhlaaadg(seq id no:14)。在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列kdfagktplhlaadag(seq id no:15)。优选地，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，优选地至少90％，还优选地至少93％，再次还优选地至少95％，并且还优选地至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0032]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自seq id no:3至6、或优选地选自seq id no:3和seq id no:4的基酸序列，其中seq id no:3至6、优选地seq id no:3和seq id no:4的至多12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸被其他氨基酸置换。此类氨基酸置换优选地使得它们不显著影响所述经设计的锚蛋白重复结构域的功能，优选地对血清白蛋白的特异性结合。此类氨基酸置换可例如包括经设计的锚蛋白重复结构
域中的氨基酸置换，诸如用于对重复结构域进行封端的氨基酸置换，如wo2012/069655中所述。当置换氨基酸时，可将任何其他氨基酸视为替换氨基酸。优选地，此类其他氨基酸选自a、d、e、f、h、i、k、l、n、p、q、r、s、t、v、w或y。优选地，此类其他氨基酸不是c、g或p。在一些实施方案中，与包含选自seq id no:3至6或优选地选自seq id no:3和seq id no:4的氨基酸序列的经设计的锚蛋白重复结构域的kd值相比，置换不使与人血清白蛋白结合的kd值改变超过1000倍、超过100倍或超过10倍。在某些实施方案中，置换是根据表x的保守置换。在某些实施方案中，置换在锚蛋白重复结构域的结构核心残基之外进行，例如在连接α-螺旋的β环中进行。在某些实施方案中，置换在锚蛋白重复结构域的结构核心残基内进行。
[0033]
表x：氨基酸置换
[0034]
初始残基保守置换示例性置换ala(a)valval；leu；ilearg(r)lyslys；gln；asnasn(n)glngln；his；asp、lys；argasp(d)gluglu；asncys(c)serser；alagln(q)asnasn；gluglu(e)aspasp；glngly(g)alaalahis(h)argasn；gln；lys；argile(i)leuleu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leu(l)ile正亮氨酸；ile；val；met；ala；phelys(k)argarg；gln；asnmet(m)leuleu；phe；ilephe(f)tyrleu；val；ile；ala；tyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyrtyr；phetyr(y)phetrp；phe；thr；serval(v)leuile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸
[0035]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自(1)seq id no:3和(2)seq id no:3的氨基酸序列，其中seq id no:3的在选自seq id no:3的第1-76位和第79-124位的任何位置处的至多12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸被其他氨基酸交换。
[0036]
在一个实施方案中，本发明涉及对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自以下的氨基酸序列：(1)seq id no:4，和(1)seq id no:4，其中seq id no:4的在选自seq id no:4的第1-76位和第79-124位的任何位置处的至多12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸被其他氨基酸交换。
[0037]
在上述本发明的所有经设计的锚蛋白重复结构域中，倒数第二位置可以为“a”或“l”，和/或最后位置可以为“a”或“n”。因此，在一些实施方案中，经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)，和/或所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)，并且其中任选地，在倒数第二位置处的a被l置换和/或在最后位置处的a被n置换。因此，在一个示例性实施方案中，经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)，和/或所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l置换和/或最后位置处的a被n置换。在另一个示例性实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)，和/或所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l置换，和/或最后位置处的a被n置换。
[0038]
此外，所有上述本发明的经设计的锚蛋白重复结构域还可任选地在其n-末端处包含“g”、“s”或“gs”序列。因此，在一些实施方案中，经设计的锚蛋白重复结构域(i)包含与seq id no:3或4具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)，和/或所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)，并且(ii)在其n末端处还包含g、s或gs。在一个示例性实施方案中，经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)，和/或所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在其n-末端处还包含g、s或gs。在另一个示例性实施方案中，经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)，和/或所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在其n-末端处还包含g、s或gs。在另一个示例性实施方案中，经设计的锚蛋白重复结构域包含与seq id no:3或4具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)，和/或所述经设计的锚蛋白重复结构域在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域在其n-末端处任选地还包含g、s或gs，并且其中任选地在倒数第二位置处的a被l置换和/或在最后位
no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在尺寸排阻色谱中表现出较少的较高分子量峰，其中所述尺寸排阻色谱法在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行。
[0046]
在一个实施方案中，与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述经设计的锚蛋白重复结构域在labchip分析中表现出少至少10％的较高分子量条带。在一个实施方案中，与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述经设计的锚蛋白重复结构域在labchip分析中表现出少至少10％的较高分子量条带，其中所述labchip分析在100微摩尔、60℃以及ph 6.0或7.4下温育之后进行。
[0047]
在一个实施方案中，与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述经设计的锚蛋白重复结构域具有改善的稳定性，其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比的所述改善的稳定性选自：
[0048]
(i)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在sds-page上表现出较少的降解条带，其中优选地所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；
[0049]
(ii)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在sds-page上表现出较少的较高分子量的条带，其中优选地所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；
[0050]
(iii)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在尺寸排阻色谱中表现出较少的较高分子量峰，其中优选地所述尺寸排阻色谱法在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；以及
[0051]
(iv)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在labchip分析中表现出少至少10％的较高分子量条带，其中优选地所述labchip分析在100微摩尔、60℃以及ph 6.0或7.4下温育之后进行。
[0052]
在一个实施方案中，与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述经设计的锚蛋白重复结构域具有改善的稳定性，其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比的所述改善的稳定性选自：
[0053]
(i)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在sds-page上表现出较少的降解条带，其中所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；
[0054]
(ii)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在sds-page上表现出较少的较高分子量条带，其中所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；
[0055]
(iii)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在尺寸排阻色谱中表现出较少的较高分子量峰，其中所述尺寸排阻色谱法在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；以及(iv)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在labchip分析中表现出少至少10％的较高分子量条带，其中所述labchip分析在100微摩尔、60℃以及ph 6.0或7.4下温育之后进行；
[0056]
在一个实施方案中，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域以低于1nm的ec
50
结合pbst-c中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域以低于20nm的ec
50
结合pbst-c中的食蟹猴
血清白蛋白。在一个实施方案中，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域以低于30nm的ec
50
结合pbst-c中的小鼠血清白蛋白。在一个实施方案中，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域以低于100nm的ec
50
结合pbst-c中的人血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白和小鼠血清白蛋白。
[0057]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域在小鼠中的终末半衰期为由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域在小鼠中的终末半衰期的至少70％，优选地75％、80％、85％、90％、95％、96％，最优选地97％。在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域在小鼠中的终末半衰期与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域在小鼠中的终末半衰期相差小于30％，优选地25％、20％、15％、10％、5％、4％，最优选地3％。优选地，通过将所述经设计的锚蛋白重复结构域以1mg/kg的剂量通过静脉内注射到balb/c小鼠的尾静脉中来测定所述小鼠中的终末半衰期。
[0058]
在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域在食蟹猴中的终末半衰期为由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域在食蟹猴中的终末半衰期的至少70％，优选地75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％，最优选地92％。在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域在食蟹猴中的终末半衰期与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域在食蟹猴中的终末半衰期相差小于30％，优选地25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％，最优选地8％。优选地，食蟹猴中的所述终末半衰期通过以1mg/kg的剂量通过30分钟静脉内注射施用所述经设计的锚蛋白重复结构域来测定。
[0059]
在一个实施方案中，与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述经设计的锚蛋白重复结构域具有改善的稳定性，其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比的所述改善的稳定性为在sds-page分析中出现较少的较高分子量产物，通常且优选地在60℃下温育该经设计的锚蛋白重复结构域一周后。优选地，所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行。
[0060]
sds-page分析中的术语“较高分子量的产物”通常且优选地是指在凝胶上以比预期分子量高的分子量运行的条带。在一个实施方案中，sds-page分析中的所述较高分子量产物是指在凝胶上以高于21.5kda的分子量运行的条带。在图3中，在ph5、6或7.4下于60℃下温育一周的蛋白质#2在sds-page中表现出此类较高分子量产物，其以比大约以14kda运行的预期条带高的表观分子量运行。在一个实施方案中，sds-page分析中的所述较少较高分子量产物是指在60℃下温育一周后，所述较高分子量产物减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％，最优选地50％。
[0061]
在一个实施方案中，与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述经设计的锚蛋白重复结构域具有改善的稳定性，其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比的所述改善的稳定性为在sds-page分析中出现较少的较低分子量产物，通常且优选地在60℃下温育该经设计的锚蛋白重复结构域一周后。优选地，所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行。
[0062]
sds-page分析中的术语“较低分子量的产物”通常且优选地是指在凝胶上以比预期分子量低的分子量运行的条带。在图3中，在ph5、6或7.4下于60℃下温育一周的蛋白质#2在sds-page中表现出此类较低分子量产物，其以比大约以14kda运行的预期条带低的表观分子量运行。在一个实施方案中，sds-page分析中的所述较低分子量产物是指在60℃下温
育一周后，所述较低分子量产物减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％，最优选地50％。
[0063]
在一个实施方案中，与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述经设计的锚蛋白重复结构域具有改善的稳定性，其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比的所述改善的稳定性为在labchip分析中出现较少的较高分子量产物，通常且优选地在60℃下温育该经设计的锚蛋白重复结构域一周后。在一个实施方案中，labchip分析中的所述较高分子量产物是指在色谱图上以比预期分子量高的分子量运行的条带。在一个实施方案中，labchip分析中的所述较高分子量产物是在指色谱图上以高于30kda的分子量运行的条带。在图4中，在ph 6或7.4下于60℃温育一周的蛋白质#2在labchip分析中表现出此类较高分子量的产物，其以比大约以介于15kda和20kda之间运行的预期条带高的表观分子量运行。在一个实施方案中，labchip分析中的所述较少的较高分子量产物是指在60℃下温育一周后，所述较高分子量产物减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％，最优选地50％。
[0064]
在一个实施方案中，与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述经设计的锚蛋白重复结构域具有改善的稳定性，其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比的所述改善的稳定性为在labchip分析中出现较少的较低分子量产物，通常且优选地在60℃下温育该经设计的锚蛋白重复结构域一周后。在一个实施方案中，labchip分析中的所述较低分子量产物是指在色谱图上以比预期分子量低的分子量运行的条带。在一个实施方案中，labchip分析中的所述较低分子量产物是指色谱图上出现在大约7kda分子量处的条带。在图4中，在ph 6下于60℃温育一周的蛋白质#2在labchip分析中表现出此类较低分子量的产物，其以比大约以介于15kda和20kda之间运行的预期条带低的表观分子量运行。在一个实施方案中，labchip分析中的所述较少的较低分子量产物是指在60℃下温育一周后，所述较低分子量产物减少至少5％、10％、15％、20％，最优选地25％。
[0065]
在一个实施方案中，与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述经设计的锚蛋白重复结构域具有改善的稳定性，其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比的所述改善的稳定性为在尺寸排阻色谱中出现较少量的较高分子量产物，通常且优选地在ph 5下于60℃温育一周后。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱法中的术语“较高分子量产物”通常且优选地是指在预期分子量产物之前洗脱的产物。在图5c中，在ph 5下于60℃温育一周的蛋白质#2表现出此类较高分子量的产物，其在尺寸排阻色谱法中在4.1分钟时洗脱，然而预期分子量产物大约在4.6分钟后洗脱。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱法中的所述较少量的较高分子量产物是指在60℃下温育一周后，曲线下总面积的百分比减少该曲线下总面积的至少5％、10％、15％、20％，最优选地25％。
[0066]
在一个实施方案中，所述温育是指在ph 8.5、7.4、6或5下温育。在一个实施方案中，所述温育是指在ph 8.5下温育。在一个实施方案中，术语“温育”是指在ph 7.4下温育。在一个实施方案中，所述温育是指在ph 6下温育。在一个实施方案中，所述温育是指在ph 5下温育。在一个实施方案中，所述在ph 8.5下的温育是指在磷酸盐/柠檬酸盐/硼酸盐缓冲液中温育。在一个实施方案中，所述在ph 7.4下的温育是指在pbs中温育。在一个实施方案中，所述在ph 6下的温育是指在ph 6的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液中温育。在一个实施方案中，所述在ph 5下的温育是指在ph 5的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液中温育。
[0067]
在另一方面，本发明还提供一种重组结合蛋白，其包含对血清白蛋白具有结合特异性的至少一个本发明的经设计的锚蛋白重复结构域。如上文和本文针对本发明的经设计的锚蛋白重复结构域所述的优选实施方案和特征适用于本发明的任何和所有方面，包括本发明的重组结合蛋白，其包含对血清白蛋白具有结合特异性的至少一个本发明的经设计的锚蛋白重复结构域。
[0068]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的一个或两个。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好一个或恰好两个。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好两个。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的三个。
[0069]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的一个或两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)和/或在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好一个或恰好两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)和/或在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好两个，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个在与seq id no:3或4的第77位相对应的位置处不具有天冬酰胺(n)和/或在与seq id no:3或4的第78位相对应的位置处不具有谷氨酸(e)。
[0070]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的一个或两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好一个或恰好两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好两个，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含与seq id no:3或4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，具有seq id no:3或4的氨基酸序列的所述氨基酸序列同一性为至少93％，还优选地至少95％，并且再次还优选地至少98％。
[0071]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的一个或两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含选自seq id no:3至6的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好一个或恰好两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的
每一个独立地包含选自seq id no:3至6的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好两个，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含选自seq id no:3至6的氨基酸序列。
[0072]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的一个或两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3或4的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好一个或恰好两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3或4的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好两个，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3或4的氨基酸序列。
[0073]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对血清白蛋白具有结合特异性的本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的一个或两个，其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对血清白蛋白具有结合特异性的本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好一个或恰好两个，其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对血清白蛋白具有结合特异性的本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好两个，其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于90nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于80nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于70nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于60nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于50nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。
[0074]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对血清白蛋白具有结合特异性的至少两个经设计的锚蛋白重复结构域，其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个具有改善的稳定性。seq id no:9至12是此类重组结合蛋白的示例。在一个实施方案中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其包含对血清白蛋白具有结合特异性的两个、优选地恰好两个经设计的锚蛋白重复结构域，其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个具有改善的稳定性。seq id no:9至12是此类重组结合蛋白的示例。
[0075]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对血清白蛋白具有结合特异性的两个、优选地恰好两个经设计的锚蛋白重复结构域，其中对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个由seq id no:3组成。seq id no:9和10是此类重组结合蛋白的示例。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对血清白蛋白具有结合特异性的两个、优选地恰好两个经设计的锚蛋白重复结构域，其中对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个由seq id no:4组成。seq id no:11和12是此类重组结合蛋白的示例。
[0076]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的一个或两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含选自seq id no:3至6的氨基酸序列，并且其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好一个或恰好两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含选自seq id no:3至6的氨基酸序列，并且其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好两个，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含选自seq id no:3至6的氨基酸序列，并且其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于90nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于80nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于70nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于60nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于50nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。
[0077]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的一个或两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3或4的氨基酸序列，并且其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好一个或恰好两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3或4的氨基酸序列，并且其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好两个，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3或4的氨基酸序列，并且其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于90nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于80nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于70nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于60nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于50nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。
[0078]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的一个或两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3或4的氨基酸序列，并且其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白，并且其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个具有改善的稳定性，并且其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比的所述改善的稳定性选自：(i)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在sds-page上表现出较少的降解条带，其中
所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph5.0下温育一周之后进行；(ii)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在sds-page上表现出较少的较高分子量条带，其中所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；(iii)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在尺寸排阻色谱中表现出较少的较高分子量峰，其中所述尺寸排阻色谱法在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；以及(iv)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在labchip分析中表现出少至少10％的较高分子量条带，其中所述labchip分析在100微摩尔、60℃以及ph 6.0或7.4下温育之后进行。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好一个或恰好两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3或4的氨基酸序列，并且其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白，并且其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个具有改善的稳定性，并且其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比的所述改善的稳定性选自：(i)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在sds-page上表现出较少的降解条带，其中所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；(ii)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在sds-page上表现出较少的较高分子量条带，其中所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；(iii)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在尺寸排阻色谱中表现出较少的较高分子量峰，其中所述尺寸排阻色谱法在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；以及(iv)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在labchip分析中表现出少至少10％的较高分子量条带，其中所述labchip分析在100微摩尔、60℃以及ph 6.0或7.4下温育之后进行。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好两个，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3或4的氨基酸序列，并且其中所述重组结合蛋白以等于或低于100nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白，并且其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个具有改善的稳定性，并且其中与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比的所述改善的稳定性选自：(i)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在sds-page上表现出较少的降解条带，其中所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；(ii)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在sds-page上表现出较少的较高分子量条带，其中所述sds-page在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；(iii)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在尺寸排阻色谱中表现出较少的较高分子量峰，其中所述尺寸排阻色谱法在100微摩尔、60℃以及ph 5.0下温育一周之后进行；以及(iv)与由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在labchip分析中表现出少至少10％的较高分子量条带，其中所述labchip分析在100微摩尔、60℃以及ph 6.0或7.4下温育之后进行。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于90nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于80nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于70nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白
以等于或低于60nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以等于或低于50nm的解离常数(kd)结合pbs中的人血清白蛋白。
[0079]
在一个实施方案中，与具有相同氨基酸序列的重组结合蛋白相比，所述重组结合蛋白具有改善的稳定性，不同的是对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个被由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域置换。seq id no:9至12是此类重组结合蛋白的示例。
[0080]
由seq id no:9或11组成的重组结合蛋白是与由seq id no:7组成的重组结合蛋白相比表现出改善的稳定性的此类重组结合蛋白的示例，该重组结合蛋白包含对血清白蛋白具有结合特异性的两个经设计的锚蛋白重复结构域，其各自由seq id no:2组成。由seq id no:10或12组成的重组结合蛋白是与由seq id no:8组成的重组结合蛋白相比表现出改善的稳定性的此类重组结合蛋白的示例，该重组结合蛋白包含对血清白蛋白具有结合特异性的两个经设计的锚蛋白重复结构域，其各自由seq id no:2组成。
[0081]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的一个或两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好一个或恰好两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好两个，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:3的氨基酸序列。
[0082]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的一个或两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:4的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好一个或恰好两个，其中所述一个或两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:4的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含本发明的经设计的锚蛋白重复结构域中的恰好两个，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含seq id no:4的氨基酸序列。
[0083]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含选自seq id no:9至12的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含seq id no:9的氨基酸序列，优选地由该氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含seq id no:10的氨基酸序列，优选地由该氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含seq id no:11的氨基酸序列，优选地由该氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含seq id no:12的氨基酸序列，优选地由该氨基酸序列组成。
[0084]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白在小鼠中的终末半衰期为具有相同氨基酸序列的重组结合蛋白在小鼠中的终末半衰期的至少70％，优选地至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％，最优选地至少90％，不同的是对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个被由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域置换。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白在小鼠中的终末半衰期与具有相同氨基酸序列的重组结合蛋白在小鼠中的终末半衰期相差小于30％，优选地小于25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％，最优选地小于10％，不同的是对血清白蛋白具有结合特异性的所述
经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个被由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域置换。优选地，通过将所述重组结合蛋白以1mg/kg的剂量通过静脉内注射施用到balb/c小鼠的尾静脉中来确定小鼠中的所述终末半衰期。
[0085]
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白在食蟹猴中的终末半衰期为具有相同氨基酸序列的重组结合蛋白在食蟹猴中的终末半衰期的至少70％，优选地小于75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％，最优选地92％，不同的是对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个被由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域置换。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白在食蟹猴中的终末半衰期与具有相同氨基酸序列的重组结合蛋白在食蟹猴中的终末半衰期相差小于30％，优选地小于25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％，最优选地小于8％，不同的是对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每一个被由seq id no:2组成的经设计的锚蛋白重复结构域置换。优选地，食蟹猴中的所述终末半衰期通过以1mg/kg的剂量通过30分钟静脉内注射施用所述重组结合蛋白来测定。
[0086]
在另一方面，本发明涉及编码本发明的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的锚蛋白重复结构域的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的重组结合蛋白的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码选自seq id no:3至6的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码选自seq id no:9至12的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码seq id no:3的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码seq id no:4的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码seq id no:5的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码seq id no:6的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码seq id no:9的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码seq id no:10的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码seq id no:11的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码seq id no:12的氨基酸序列的核酸。此外，本发明涉及包含所述核酸中任一者的载体。
[0087]
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域，和/或编码本发明的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域的核酸，以及任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂。药学上可接受的载体和/或稀释剂是本领域技术人员已知的，并且将在下文更详细地说明。更进一步地，提供了一种诊断组合物，其包含本文所述的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域中的一种或多种。
[0088]
药物组合物包含如上文所述的结合蛋白和药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如remington's pharmaceutical sciences 16
th edition,osol,a.ed.,1980中所述。本领域技术人员已知的合适载体、赋形剂或稳定剂包括例如盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、汉克氏溶液、固定油，油酸乙酯、5％右旋糖盐水、增强等渗性和化学稳定性的物质、缓冲液和防腐剂。其它合适载体包括本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载体，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。药物组合物还可以是组合制剂，其包含另外的活性剂，诸如抗癌剂或抗血管生成剂。
[0089]
待用于体内给药的制剂必须是无菌的或经过消毒的。这很容易通过无菌过滤膜过
滤实现。
[0090]
药物组合物可在技术人员的知识范围内通过任何合适的方法施用。优选的给药途径是肠胃外给药。在肠胃外给药中，本发明的药物将与如上文所定义的药学上可接受的赋形剂联合被配制成单位剂量可注射形式，诸如溶液、混悬液或乳液。给药的剂量和模式将取决于待治疗的个体和具体疾病。
[0091]
此外，考虑将上述药物组合物中的任一种用于治疗疾病或障碍。本发明还提供了治疗方法。该方法包括向对其有需要的患者施用治疗有效量的本发明的药物组合物或重组结合蛋白或经设计的锚蛋白重复结构域。
[0092]
另外，提供了一种治疗哺乳动物(包括人类)的病理病症的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用有效量的上述药物组合物。
[0093]
本公开提供了一种治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的重组结合蛋白或药物组合物。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，癌症是实体瘤。seq id no:9至12是可用于治疗癌症的此类方法中的重组结合蛋白的示例
[0094]
在一些实施方案中，癌症是脑癌、膀胱癌、乳腺癌、透明细胞肾癌、宫颈癌、结肠癌和直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈鳞状上皮细胞癌、唇口癌、肝癌、肺鳞状上皮细胞癌、黑素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、非黑素瘤皮肤癌、卵巢癌、口腔癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、小细胞肺癌(sclc)、头颈鳞状上皮细胞癌(scchn)、三重阴性乳腺癌或甲状腺癌。
[0095]
本发明不限于实施例中描述的具体实施方案。其它来源可按照下文所述的概要使用和处理。
[0096]
本说明书涉及本说明书中命名为“p5754_sequence_protocol.txt”的氨基酸序列表的多个氨基酸序列，并且该序列记录(sequence protocol)的氨基酸序列以引用方式并入本文。
[0097]
定义
[0098]
除非本文另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语应具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
[0099]
在本发明的上下文中，术语“蛋白质”是指分子，所述分子包含多肽，其中多肽的至少一部分通过在单个多肽链内和/或多个多肽链之间形成二级、三级和/或四级结构而具有或能够获得限定的三维排列。如果蛋白质包含两个或更多个多肽链，则各个多肽链可非共价连接或共价连接，例如通过两个多肽之间的二硫键连接。通过形成二级和/或三级结构而单独具有或能够获得限定的三维排列的蛋白质部分被称为“蛋白质结构域”。这种蛋白质结构域是本领域技术人员熟知的。
[0100]
如在重组蛋白、重组多肽等中使用的术语“重组”，是指通过使用本领域技术人员熟知的重组dna技术产生所述蛋白质或多肽。例如，可将编码多肽的重组dna分子(例如，通过基因合成产生)克隆到细菌表达质粒(例如，pqe30，qiagen公司)、酵母表达质粒、哺乳动物表达质粒或植物表达质粒，或者能够体外表达的dna中。如果例如将此类重组细菌表达质粒插入适当的细菌(例如，大肠杆菌(escherichia coli))中，则这些细菌可产生由该重组dna编码的多肽。对应产生的多肽或蛋白质被称为重组多肽或重组蛋白。
[0101]
在本发明的上下文中，术语“结合蛋白”是指包含结合结构域的蛋白。结合蛋白还可包含两个、三个、四个、五个或更多个结合结构域。优选地，所述结合蛋白是重组结合蛋白。本发明的结合蛋白包含对血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。
[0102]
此外，任何此类结合蛋白可包含另外的多肽(诸如例如多肽标签、肽接头、与具有结合特异性的其他蛋白质结构域的融合、细胞因子、激素、或拮抗剂)、或本领域技术人员熟知的化学修饰(诸如偶联到聚乙二醇、毒素(例如，来自免疫原的dm1)、小分子、抗生素等)。
[0103]
术语“结合结构域”意指对靶表现出结合特异性的蛋白质结构域。优选地，所述结合结构域是重组结合结构域。
[0104]
术语“靶”是指单个分子，诸如核酸分子、多肽或蛋白质、碳水化合物或任何其他天然存在的分子，包括此类单个分子的任何部分，或者两种或更多种此类分子的复合物，或者整个细胞或组织样本，或任何非天然化合物。优选地，靶是天然存在的或非天然的多肽或蛋白质，或含有化学修饰(例如，天然存在或非天然磷酸化、乙酰化或甲基化)的多肽或蛋白质。例如，在本发明的上下文中，血清白蛋白是所公开的血清白蛋白特异性结合结构域和蛋白质的靶。
[0105]
在本发明的上下文中，术语“多肽”涉及由多个(即两个或更多个)经由肽键连接的氨基酸的链组成的分子。优选地，多肽由八个以上经由肽键连接的氨基酸组成。术语“多肽”还包括通过半胱氨酸的s-s桥连接在一起的氨基酸的多个链。多肽是本领域技术人员熟知的。
[0106]
专利申请wo2002/020565和forrer等人，2003(forrer,p.,stumpp,m.t.,binz,h.k.,pl
ü
ckthun,a.,2003.febs letters 539,2-6)包含重复蛋白特征和重复结构域特征、技术和应用的一般描述。术语“重复蛋白”是指包含一个或多个重复结构域的蛋白质。优选地，重复蛋白包含一个、两个、三个、四个、五个或六个重复结构域。此外，所述重复蛋白可包含另外的非重复蛋白结构域、多肽标签和/或多肽接头。重复结构域可以为结合结构域。
[0107]
术语“重复结构域”是指包含两个或更多个连续重复模块作为结构单元的蛋白质结构域，其中所述重复模块具有结构和序列同源性。优选地，重复结构域还包含n末端和/或c末端封端模块。为了清楚起见，封端模块可以是重复模块。此类重复结构域、重复模块和封端模块、序列基序以及结构同源性和序列同源性是本领域技术人员由以下各项的示例所熟知的：锚蛋白重复结构域(wo2002/020565)、富含亮氨酸的重复结构域(wo2002/020565)、三十四肽重复结构域(main,e.r.,xiong,y.,cocco,m.j.,d'andrea,l.,regan,l.,structure 11(5),497-508,2003)和犰狳重复结构域(wo2009/040338)。本领域技术人员还熟知，此类重复结构域不同于包含重复氨基酸序列的蛋白质，其中每个重复氨基酸序列能够形成单个结构域(例如纤粘蛋白的fn3结构域)。
[0108]
如在经设计的重复蛋白、经设计的重复结构域等中所用的，术语“经设计的”是指此类重复蛋白和重复结构域分别是人造的并且在自然界中不存在的特性。本发明的结合蛋白是经设计的重复蛋白，并且它们包含至少一个经设计的锚蛋白重复结构域。
[0109]
术语“靶相互作用残基”是指有助于与靶直接相互作用的重复模块的氨基酸残基。
[0110]
术语“框架残基”是指重复模块的氨基酸残基，其有助于折叠拓扑结构，即，有助于所述重复模块的折叠或有助于与相邻模块的相互作用。此类贡献可为与重复模块中其他残基的相互作用，或在存在于α-螺旋或β-片层中时对多肽主链构象的影响，或参与形成线性
多肽或环的氨基酸拉伸。
[0111]
此类框架和靶相互作用残基可通过分析由物理化学方法(诸如x-射线晶体学、nmr和/或cd光谱)获得的结构数据，或通过与结构生物学和/或生物信息学领域技术人员熟知的已知和相关结构信息进行比较来鉴定。
[0112]
术语“重复模块”是指经设计的重复结构域的重复氨基酸序列和结构单元，其最初来源于天然存在的重复蛋白的重复单元。包含在重复结构域中的每个重复模块来源于天然存在的重复蛋白的家族或亚族(例如锚蛋白重复蛋白家族)的一个或多个重复单元。此外，重复结构域中包含的每个重复模块可包含从同源重复模块推导的“重复序列基序”，所述同源重复模块得自对于靶所选择的重复结构域，例如如实施例1中所述，并且具有相同的靶特异性。
[0113]
因此，术语“锚蛋白重复模块”是指最初来源于天然存在的锚蛋白重复蛋白的重复单元的重复模块。锚蛋白重复蛋白是本领域技术人员所熟知的。
[0114]
重复模块可包含具有为了选择靶特异性重复结构域而在文库中未被随机化的氨基酸残基的位置(“非随机化位置”)和具有为了选择靶特异性重复结构域而在文库中已被随机化的氨基酸残基的位置(“随机化位置”)。非随机化位置包含框架残基。随机化位置包含靶相互作用残基。“已被随机化”意指在重复模块的氨基酸位置处允许两个或更多个氨基酸，例如，其中允许通常二十种天然存在的氨基酸中的任一种，或者其中允许二十种天然存在的氨基酸中的大多数，诸如除半胱氨酸之外的氨基酸，或除甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸之外的氨基酸。出于本专利申请的目的，seq id no:2至6的氨基酸残基3、4、6、14和15是本发明的锚蛋白重复模块的随机化位置。
[0115]
术语“重复序列基序”是指从一个或多个重复模块推导的氨基酸序列。优选地，所述重复模块来自对同一靶具有结合特异性的重复结构域。此类重复序列基序包含框架残基位置和靶相互作用残基位置。所述框架残基位置对应于重复模块的框架残基位置。同样，所述靶相互作用残基位置对应于重复模块的靶相互作用残基的位置。重复序列基序包括非随机化位置和随机化位置。
[0116]
术语“重复单元”是指包含一种或多种天然存在的蛋白质的序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”存在于多个拷贝中，并且表现出确定蛋白质折叠的所有所述基序所共有的限定的折叠拓扑结构。此类重复单元的示例包括富含亮氨酸的重复单元、锚蛋白重复单元、犰狳重复单元、三十四肽重复单元、heat重复单元和富含亮氨酸的变体重复单元。
[0117]
术语“对靶具有结合特异性”、“特异性结合到靶”、“高特异性结合到靶”、“特异于靶”或“靶特异性”等是指，结合蛋白或结合结构域在pbs中以比其结合到不相关蛋白质(诸如，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(mbp))低的离解常数(即，其以更高的亲和性结合)结合到靶。优选地，靶在pbs中的解离常数(“kd”)为至少102；更优选地，至少103；更优选地，至少104；或更优选地，比mbp的对应解离常数低至少105倍。确定蛋白质-蛋白质相互作用的解离常数的方法，诸如基于表面等离子共振(spr)的技术(例如，spr均衡分析)或等温滴定量热法(itc)是本领域技术人员熟知的。如果在不同条件(例如，盐浓度、ph)下进行测量，则具体蛋白质-蛋白质相互作用的测量kd值可以是变化的。因此，优选地利用标准化蛋白质溶液和标准化缓冲液(诸如，pbs)来进行kd值的测量。通过表面等离振子共振(spr)分析对血清白蛋白具
有结合特异性的本发明重组结合蛋白的解离常数(kd)的典型和优选的测定描述于实施例7中。
[0118]
术语“约”意指提及的值 /-20％；例如，“约50”应意指40至60。
[0119]
术语“pbs”意指含有137mm nacl、10mm磷酸盐和2.7mm kcl并且ph为7.4的磷酸盐缓冲水溶液。这例示于实施例3中。术语“磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液ph 6”意指包含375mm na2hpo4*2h2o和150mm nacl，并且ph为5.7的含水缓冲液。这例示于实施例3中。术语“磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液ph 5”意指包含30mm柠檬酸和30mm nah2p04并且ph为4.75的含水缓冲液。这例示于实施例3中。术语“磷酸盐/柠檬酸盐/硼酸盐缓冲液”意指包含30mm柠檬酸、30mm nah2po4、30mm硼酸并且ph为8.5的含水缓冲液。这例示于实施例3中。
[0120]
术语“小鼠血清白蛋白”是指uniprot登录号p07724，术语“食蟹猴血清白蛋白”(即食蟹猴(macaca fascicularis))是指uniprot登录号a2v9z4，并且术语“人血清白蛋白是指uniprot登录号p02768。
[0121]
实施例
[0122]
实施例中使用的蛋白质：
[0123]
蛋白质#2(seq id no:2，其具有融合至其n末端的his标签(seq id no:1))；
[0124]
蛋白质#3(seq id no:3，其具有融合至其n末端的his标签(seq id no:1))；
[0125]
蛋白质#4(seq id no:4，其具有融合至其n末端的his标签(seq id no:1))；
[0126]
蛋白质#5(seq id no:5，其具有融合至其n末端的his标签(seq id no:1))；
[0127]
蛋白质#6(seq id no:6，其具有融合至其n末端的his标签(seq id no:1))；
[0128]
蛋白质#7(seq id no:7，其具有融合至其n末端的his标签(seq id no:1))；
[0129]
蛋白质#8(seq id no:8，其具有融合至其n末端的his标签(seq id no:1))；
[0130]
蛋白质#9(seq id no:9，其具有融合至其n末端的his标签(seq id no:1))；
[0131]
蛋白质#10(seq id no:10，其具有融合至其n末端的his标签(seq id no:1))；
[0132]
蛋白质#11(seq id no:11，其具有融合至其n末端的his标签(seq id no:1))；
[0133]
蛋白质#12(seq id no:12，其具有融合至其n末端的his标签(seq id no:1))；
[0134]
如果没有另外描述，则根据本领域技术人员熟知的方法进行实验。一些示例的实验条件还在wo2012/069654和wo2016/156596中有所描述。
[0135]
实施例1：构建对血清白蛋白具有结合特异性并具有改善的稳定性的经设计的锚蛋白重复结构域
[0136]
意料不到的是，据观察由与seq id no:2相对应的氨基酸序列组成的蛋白质(最初描述于wo2016156596中)似乎在升高的温度下温育后是不稳定的(参见实施例2至6)，尽管事实上与对血清白蛋白具有结合特异性的较早经设计的锚蛋白重复结构域(wo2012/069654)相比，其是具有改善的稳定性的变体。因此，本发明的目的是提供seq id no:2的变体，其在升高的温度下温育后表现出改善的稳定性，同时保持血清白蛋白结合和药代动力学特性。通过涉及多个位置处几轮变化的氨基酸的高度迭代过程(例如，与本领域技术人员熟知的丙氨酸扫描过程相当)并在体外和体内表征所得的蛋白质变体，最终得到表现出改善的稳定性特性的4种变体。出乎意料的是，这些变体全部涉及第77位和/或第78位处的氨基酸asp，该氨基酸是已知位于多肽链降解的起源处的氨基酸。非常令人惊讶的是，许多这些变体包含asp-gly序列基序，已知其特别易于多肽链降解。因此，该方法令人惊奇地导致
了意料不到的变体。
[0137]
将编码由seq id no:2至6组成的经设计的锚蛋白重复结构域中每一者的dna克隆到基于pqe(qiagen，germany)的表达载体中，从而提供n末端his标签以有利于简单的蛋白质纯化，如下所述。以下实施例中描述了这些特别选择的序列的制备和表征以及使用。
[0138]
实施例2：蛋白质的表达和纯化
[0139]
在大肠杆菌中产生由seq id no:2至6组成、另外具有融合至其n末端的his标签seq id no:1的蛋白质，以及由seq id no:7至12组成、另外具有融合至其n末端的his标签seq id no:1的蛋白质，将其纯化至均质，并储存在pbs缓冲液中。为清楚起见，蛋白质#2至#6是对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，蛋白质#7至#12是包含对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。蛋白质#7和#8包含两倍的seq id no:2。蛋白质#9和#10包含两倍的seq id no:3。蛋白质#11和#12包含两倍的seq id no:4。来自wo2016156596的seq id no:134的蛋白质#7是本领域技术人员所熟知的，并且来自wo2018054971的seq id no:21的蛋白质#8是本领域技术人员所熟知的。因此，与蛋白质#7(其为包含对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白)相比，蛋白质#9和#11为包含经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，该经设计的锚蛋白重复结构域具有(i)对血清白蛋白的结合特异性并且具有(ii)改善的贮存稳定性。同样，与蛋白质#8(其为包含对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白)相比，蛋白质#10和#12为包含经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，该经设计的锚蛋白重复结构域具有(i)对血清白蛋白的结合特异性并且具有(ii)改善的贮存稳定性。将如该段中所述进行表达和纯化的蛋白质用于实施例3至12的实验。
[0140]
另选地，在大肠杆菌中产生由seq id no:2至12组成的蛋白质(在n末端处另外具有氨基酸gs)，将其纯化至均质，并储存在pbs缓冲液中。在氨基酸gs位于n末端的情况下，因为起始met之后是小gly残基，因此由表达载体另外编码的met残基在大肠杆菌细胞质中被有效地从所表达的多肽上切除。在实施例3至12中，由seq id no:2至12组成的另外在n末端处具有氨基酸gs的蛋白质表现出与由seq id no:2至12组成的另外具有融合至其n末端的his标签seq id no:1的蛋白质相同的结果。
[0141]
实施例3：贮存稳定性温育
[0142]
测试实施例2的蛋白质在100微摩尔蛋白质浓度和60℃下，在各种ph下1周(7天)的贮存稳定性。所用的缓冲液为pbs(ph 7.4；137mm nacl、10mm磷酸盐和2.7mm kcl)或磷酸盐/柠檬酸盐(ph5.7；375mm na2hpo4*2h2o和150mm nacl，ph使用1m一水合柠檬酸盐调节)，或磷酸盐/柠檬酸盐(ph 4.75；30mm柠檬酸和30mm nah2p04，ph用氢氧化钠调节)，或磷酸盐/柠檬酸盐/硼酸盐(ph8.5，30mm柠檬酸，30mm nah2po4，30mm硼酸)。在将蛋白质与相应缓冲液混合时，所得ph值分别为ph 7.4、ph 6、ph 5或ph 8.5。与60℃下的温育并行，将蛋白质的等分试样在-80℃下温育1周(7天)作为对照。
[0143]
在60℃和不同ph下温育期间的稳定性在工业上与经设计的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白的制造相关，因为制造过程可包括一个或多个工艺步骤，在该工艺步骤期间多肽暴露于此类条件。另外，本领域的技术人员通过加速贮存稳定性测量来确定贮存稳定性，该加速贮存稳定性测量包括在升高的温度下温育的步骤。
[0144]
实施例4：贮存稳定性分析样品的sds-page
[0145]
在nupage 4％-12％bis-tris十二烷基钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)凝胶(thermo fisher)上分析实施例3的蛋白质样品(每个泳道10微克蛋白质)，用instant blue染色(sigma aldrich)进行染色。结果示于图3中。所有蛋白质均示出约14.4kda的预期大小的主条带。一些蛋白质示出较低分子量的附加条带(较低分子量产物)和/或较高分子量的条带(较高分子量产物)。与蛋白质#2相比，蛋白质#3和#4在ph 7.4、ph 6、和ph 5下表现出较低量的较低分子量产物。从sds-page判断，较低分子量产物在ph 7.4、ph 6和/或ph 5下的减少为至少10％。类似地，从sds-page判断，较低分子量产物的量在ph 7.4、ph 6和/或ph 5下减少至少50％。类似地，蛋白质#2在ph 7.4、ph 6和/或ph 5下示出至少50％更多的较低分子量产物或较低分子量产物条带。令人惊讶的是，在60℃下温育一周后，蛋白质#2表现出较高分子量条带。蛋白质#3和#4似乎不表现出较高分子量条带，即，表现出改善的稳定性。从sds-page判断，当将蛋白质#2与蛋白质#3和#4比较时，较高分子量条带产物条带的减少在ph 7.4下为至少50％，在ph 6下为至少50％，并且在ph 5下为至少50％。类似地，蛋白质#2示出较高分子量条带和/或较高分子量产物的增加，其在ph 7.4下达到至少10％，在ph 6下达到至少20％，并且在ph 5下达到至少50％。
[0146]
实施例5：贮存稳定性分析样品的labchip分析
[0147]
使用labchip gxii仪器根据制造商(perkin elmer)分析实施例3的蛋白质样品。简而言之，将样品与变性溶液混合并在70℃下变性10分钟，然后在ht protein express chip上进行分析。使用仪器的软件分析运行。结果示于图4中。与蛋白质#2相比，蛋白质#3和#4在ph 7.4、ph 6、和ph 5下表现出较低量的降解产物或较低分子量产物。从labchip数据判断，降解产物条带或较低分子量产物条带在ph 7.4、ph 6和ph 5下的减少为至少10％。蛋白质#2在60℃下温育一周后表现出较高分子量条带，然而蛋白质#3和#4不表现出较高分子量条带。从labchip数据判断，较高分子量条带产物条带的减少在ph 7.4下为至少10％，并且在ph 6下为至少50％(参见表1)。在该实施例中，对于蛋白质#2-#4，在条带大于25kda的情况下，认为该条带是labchip分析中的较高分子量条带。在该实施例中，对于蛋白质#2-#4，在条带小于10kda的情况下，认为该条带是labchip分析中的较低分子量条带。假设蛋白质制剂的纯度高，则此类较低分子量条带可被认为是降解产物条带。
[0148]
表1：由labchip检测到的不同ph下的较高分子量条带百分比
[0149][0150][0151]
*该表中的蛋白质#2、#3、#4表示由seq id no:2至4的对应氨基酸序列和另外的n末端his标签(seq id no:1)组成的经设计的锚蛋白重复结构域。
[0152]
实施例6：贮存稳定性分析样品的尺寸排阻色谱分析
[0153]
在agilent 1200hplc系统上的ge superdex 200 150/5柱上以0.5ml/min的流速在pbs中分析实施例3的样品。在每种蛋白质中，分析0.1ml
à
100微摩尔的-80℃对照样品和60℃温育样品中的每一者。尺寸排阻色谱图(280nm下的光密度减去360nm下的光密度)在图
5a(ph 7.4)、图5b(ph6)和图5c(ph5)中示出。蛋白质#3和#4示出在ph 7.4、ph 6、和ph 5下，-80℃对照样品和60℃温育样品的大致重叠色谱图。蛋白质#2示出在ph 7.4和ph 6下，-80℃对照样品和60℃温育样品的大致重叠色谱图。相比之下，在ph 5下，与-80℃对照样品相比，蛋白质#2在60℃温育样品中示出较高表观分子量物质的明显增加。60℃温育样品中在ph 5下的蛋白质#2的较高表观分子量物质对应于曲线下总面积的25％，然而在ph 5下的蛋白质#2-80℃对照样品未示出较高表观分子量物质。在该实施例中，较高表观分子量物质是峰值在4.1分钟左右时的洗脱的物质。预期的表观分子量物质是峰值在4.6分钟左右时的洗脱的物质。蛋白质#3和#4在ph 5下的60℃温育样品中未示出较高的表观分子量物质。
[0154]
实施例7：亲和力测量
[0155]
根据本领域技术人员已知的标准程序，使用proteon系统(biorad)在pbs中通过spr测量来确定实施例2的蛋白质对人血清白蛋白的亲和力。所测定的亲和力列于表2中。对血清白蛋白具有结合特异性的所有经设计的锚蛋白重复结构域均表现出解离常数kd《100nm，并且解离常数在相当的范围内。
[0156]
表2：结合到人血清白蛋白的经设计的锚蛋白重复结构域的解离常数(kd)
[0157][0158]
*该表中的蛋白质#2、#3、#4表示由seq id no:2至4的对应氨基酸序列和另外的n末端his标签(seq id no:1)组成的经设计的锚蛋白重复结构域。
[0159]
实施例8：血清白蛋白物质交叉反应性
[0160]
使实施例2的蛋白质样品经受elisa血清白蛋白交叉反应性分析，如wo2016156596中所述。在4℃下，将每孔100μl的20nm血清白蛋白的pbs溶液在maxisorp板(nunc,denmark)中固定过夜。用300μl pbst(补充有0.1％tween 20的pbs)洗涤5次后，在室温下将孔用300μl pbst-c(补充有0.25％酪蛋白的pbst)封闭2小时，同时在titramax 1000摇床(heidolph,germany)上以450rpm振荡。如上所述洗涤5次后，施加100μ/孔或50μl孔蛋白质#2、#3或#4(对于每种蛋白质，浓度范围为100nm至0.01pm)的pbst-c溶液，并且在室温下温育2小时并伴以450rpm振荡。如上所述洗涤5次后，使用100μl的兔抗经设计的锚蛋白重复结构域单克隆抗体的pbst-c溶液在室温下1小时并伴以450rpm振荡来检测蛋白质的结合。如上所述洗涤5次后，使用100μl/孔的山羊抗兔igg-hrp缀合物的pbst-c溶液在室温下1小时并伴以450rpm振荡来检测结合的抗经设计的锚蛋白重复结构域抗体。如上所述洗涤5次后，然后使用在水中以1:4稀释的100μl可溶性bm蓝色pod底物(roche,switzerland)将elisa显影。5分钟后，使用100μl 1m h2so4停止反应。然后记录od(od 450nm-od 620nm)。使用graphpad prism确定ec
50
值(表3)。分析示出，人、食蟹猴和小鼠的血清白蛋白以高亲和力结合。对于蛋白质#2、#3和#4，人血清白蛋白结合的测量的ec
50
值低于1nm。对于蛋白质#2、#3和#4，食蟹猴血清白蛋白结合的测量的ec
50
值低于20nm。对于蛋白质#2、#3和#4，小鼠血清白蛋白结合的测量的ec
50
值低于30nm。
[0161]
表3：结合到血清白蛋白的经设计的锚蛋白重复结构域的ec
50
[nm]
[0162][0163]
*该表中的蛋白质#2、#3、#4表示由seq id no:2至4的对应氨基酸序列和另外的n末端his标签(seq id no:1)组成的经设计的锚蛋白重复结构域。
[0164]
实施例9：对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在小鼠中的药代动力学特征
[0165]
使用如实施例2中所述制备的蛋白质#2、#3和#4在雌性balb/c小鼠中进行药代动力学分析。通过静脉内注射将蛋白质以1mg/kg施用到尾静脉中。将分成两组(每组3只小鼠)的六只小鼠用于每种蛋白质。对于每种蛋白质，在注射后5分钟、24小时、72小时、168小时和360小时从一组的小鼠，以及在注射后4小时、48小时、144小时和168小时从另一组的小鼠收集血液。使血样在室温下静置，并使用本领域技术人员熟知的程序离心以产生血清，然后储存在-80℃下待分析。使用兔单克隆抗-darpin抗体作为捕获试剂以及抗-rgs-his抗体-hrp缀合物作为检测试剂，并使用标准曲线，通过夹心elisa测定蛋白质#2、#3、和#4的血清浓度。使用本领域技术人员熟知的常规兔免疫和杂交瘤生成技术生成单克隆抗-darpin抗体，并且在浓度测定实验之前验证单克隆抗体与蛋白质#2至#16的结合。简而言之，将每孔100μl10nm的山羊抗兔抗体(thermo scientific)的pbs溶液在4℃下固定在maxisorp板(nunc，denmark)中过夜。用300μl pbst(补充有0.1％tween20的pbs)洗涤5次后，在室温下将孔用300μl pbst-c(补充有0.25％酪蛋白的pbst)封闭1小时，同时在titramax 1000摇床(heidolph,germany)上以450rpm振荡。如上所述洗涤5次后，在室温下添加100μl/孔5nm兔抗darpin抗体的pbst-c溶液持续1h并伴以450rpm振荡。如上所述洗涤5次后，在室温下添加稀释于pbst-c中的血清样品或标准参照物的不同稀释液持续2小时并伴以450rpm振荡。在如上所述洗涤5次后，在室温下添加50μl 100ng/ml小鼠抗-rgs-his抗体-hrp缀合物(qiagen)的pbst-c溶液持续30分钟并伴以450rpm振荡。在如上所述洗涤5次后，使用50μl tmb底物使elisa显影。5分钟后，使用100μl 1m h2so4停止反应。然后记录od(od 450nm-od 620nm)。使用标准软件诸如phoenix winnonlin(certara，princeton，usa)或graphpadprism(graphpad software，la jolla，usa)和标准分析诸如非隔室分析来测定药代动力学参数，全部都是本领域技术人员所熟知的。所得药代动力学特征在图6a中示出。来源于测量的曲线下药代动力学参数面积、清除率、分布体积和半衰期列于表4中。
[0166]
表4：蛋白质#2、#3和#4的小鼠中药代动力学参数
[0167][0168]
*该表中的蛋白质#2、#3、#4表示由seq id no:2至4的对应氨基酸序列和另外的n末端his标签(seq id no:1)组成的经设计的锚蛋白重复结构域。
[0169]
实施例10：对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在食蟹猴中的药代动力学特征
[0170]
对于每种蛋白质，通过30分钟静脉内输注给药，以1mg/kg给药在两个雄性食蟹猴中进行药代动力学分析。对于每种蛋白质，在注射后5分钟、6小时、24小时、72小时、120小时、168小时、336小时、408小时、504小时和672小时从每只动物收集血液。使血样在室温下静置，并使用本领域技术人员熟知的程序离心以产生血清，然后储存在-80℃下待分析。蛋白质#2、#3和#4的血清浓度通过夹心elisa测定，如实施例9中所述。使用标准软件诸如phoenix winnonlin(certara，princeton，usa)或graphpadprism(graphpad software，la jolla，usa)和标准分析诸如非隔室分析来测定药代动力学参数，全部都是本领域技术人员所熟知的。所得药代动力学特征在图6b中示出。来源于测量的曲线下药代动力学参数面积、清除率、分布体积和半衰期列于表5中。
[0171]
表5：蛋白质#2-#4在食蟹猴中的药代动力学参数
[0172][0173]
*该表中的蛋白质#2、#3、#4表示由seq id no:2至4的对应氨基酸序列和另外的n末端his标签(seq id no:1)组成的经设计的锚蛋白重复结构域。
[0174]
实施例11：使用对血清白蛋白具有结合特异性并具有改善的稳定性的经设计的锚蛋白重复结构域产生和表征重组结合蛋白
[0175]
通过重组dna技术生成包含对血清白蛋白具有结合特异性并且具有改善的贮存稳定性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。seq id no:7至12是此类重组结合蛋白的示例。如实施例3中所述制备蛋白质#7、#8、#9、#10、#11和#12(由seq id no:7至12组成，另外还具有融合至其n末端的his-标签seq id no:1；参见实施例2)。类似地，可在大肠杆菌中产生由seq id no:7至12组成的蛋白质并使用常规方法将其纯化，所述蛋白质各自另外还在n末端携带氨基酸mgs(其中n末端甲硫氨酸在大肠杆菌细胞质中从表达的多肽有效地切除，因为起始met之后是小gly残基)。
[0176]
根据实施例3至6评估重组结合蛋白的稳定性改善。由seq id no:9和11组成的重组结合蛋白表现出比由seq id no:7组成的重组结合蛋白高的稳定性。同样，由seq id no:10和12组成的重组结合蛋白表现出比由seq id no:8组成的重组结合蛋白高的稳定性。
[0177]
实施例12：包含对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白在小鼠中的药代动力学特征
[0178]
使用蛋白质#7、#9和#11以及使用蛋白质#8、#10和#12在小鼠中进行药代动力学分析，所有这些均如实施例2所述产生。研究基本上如实施例9中所述进行，每种蛋白质使用三只小鼠并在注射后5分钟、4小时、48小时和96小时采血。浓度测定和药代动力学参数的测定如实施例9中所述进行。为了比较蛋白质#7、#9和#11，药代动力学迹线示于图7a中，并且来源于对所有蛋白质的测量的曲线下药代动力学参数面积、清除率、分布体积和半衰期列于表6中。为了比较蛋白质#8、#10和#12，药代动力学迹线示于图7b中，并且来源于对所有蛋白
质的测量的曲线下药代动力学参数面积、清除率、分布体积和半衰期列于表7中。
[0179]
表6：蛋白质#7、#9和#11在小鼠中的药代动力学参数
[0180][0181]
*该表中的蛋白质#7、#9和#11表示由seq id no:7、9和11的对应氨基酸序列和另外的n末端his标签(seq id no:1)组成的经设计的锚蛋白重复结构域。
[0182]
表7：蛋白质#8、#10和#12在小鼠中的药代动力学参数
[0183][0184]
*该表中的蛋白质#8、#10和#12表示由seq id no:8、10和12的对应氨基酸序列和另外的n末端his标签(seq id no:1)组成的经设计的锚蛋白重复结构域。